一種基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明中，糖鏈和凝集素在三維環(huán)境中的反應(yīng)，提高了凝集素芯片技術(shù)的靈敏度，克服了凝集素芯片技術(shù)中凝集素與糖蛋白在二維環(huán)境中反應(yīng)時親和力弱而難以高效檢測糖基化蛋白的弊端。本發(fā)明所述方法可快速、簡便、特異、高通量地檢測蛋白質(zhì)糖基化特征，使用的樣品量較少，有利于不同樣品之間的糖基化差異比較，為建立高通量蛋白質(zhì)糖基化修飾差異譜分析提供技術(shù)平臺，有利于探討疾病分子標(biāo)志物的不同糖基化狀態(tài)對疾病的預(yù)測價值。
【專利說明】一種基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于凝集素液相懸浮芯片技術(shù)檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的新方法；具體涉及凝集素液相懸浮芯片的制備、凝集素偶聯(lián)量優(yōu)化，并應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)樣品和實際樣品的糖基化檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]目前已知，蛋白質(zhì)糖基化是最常見的翻譯后修飾之一，細(xì)胞內(nèi)約有50%以上的蛋白質(zhì)可被糖基化修飾；所述糖蛋白則在分化、發(fā)育、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移、精卵識別、免疫、傳染及再生中發(fā)揮重要的作用。有研究顯示，若干重要的糖蛋白的糖基化變化為腫瘤的早期診斷、進(jìn)程監(jiān)測、預(yù)后評估提供了重要的信息；因此，研究糖蛋白并揭示其糖基化特征非常重要。
[0003]然而，許多具有重要生理、病理意義的糖蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量較低，阻礙了糖基化的研究。為了研究糖基化的重要生物分子標(biāo)志物在生理或疾病狀態(tài)下的糖基化變化，有關(guān)研究發(fā)展了一系列芯片技術(shù)，如抗體芯片、凝集素芯片以及糖芯片等。上述高通量、高靈敏地檢測糖基化的方法為進(jìn)一步的輔助疾病的診斷提供了有效的手段。然而，以凝集素芯片為例，由于糖鏈與凝集素親和力較低，其檢測靈敏度和通量有限；因此，當(dāng)前亟需發(fā)展一種高靈敏度、高特異、高通量的檢測蛋白質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu)和糖基化水平的實用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，提高凝集素芯片技術(shù)的靈敏度；具體涉及將傳統(tǒng)的凝集素芯片技術(shù)和Bioplex液相懸浮芯片系統(tǒng)相結(jié)合制備凝集素液相懸浮芯片、凝集素偶聯(lián)量優(yōu)化，并應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)樣品和實際樣品的糖基化檢測。本發(fā)明所述的芯片系統(tǒng)能夠快速地、高靈敏度地、高通量地檢測分子標(biāo)志物的糖基化，是分析糖基化差異的有力手段，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0006](I)凝集素與磁珠的共價偶聯(lián)，制備凝集素液相懸浮芯片
[0007]采用清洗緩沖液(偶聯(lián)試劑盒自帶)清洗磁珠后，加入活化緩沖液(偶聯(lián)試劑盒自帶)重懸磁珠；向磁珠內(nèi)加入50 μ g/μ L EDC和50 μ g/μ L sulfo-NHS振蕩條件下避光室溫反應(yīng)20分鐘；用PBS清洗過量的EDC和sulfo-NHS，并重復(fù)清洗過程一次；最后，用PBS重懸活化的磁珠；用PBS配置一系列的凝集素與活化后的磁珠4°C過夜反應(yīng)；離心去上清后，加入“Stabil Guard Choice”無蛋白封閉溶液重懸，室溫孵育30分鐘；離心后，用貯存緩沖液(偶聯(lián)試劑盒自帶)重懸磁珠；
[0008](2)用氨基反應(yīng)生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記糖蛋白
[0009]將標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶于H2O,使蛋白終濃度為10 μ g/ μ L ;將10 μ L DMSO加入到氨基_反應(yīng)生物素中(標(biāo)記試劑盒自帶)，吹打使其溶解；向蛋白溶液中加入反應(yīng)緩沖液(標(biāo)記試劑盒自帶)和氨基-反應(yīng)生物素溶液，于37°C反應(yīng)10分鐘；利用IOkDa MWCO離心超濾管超濾除去反應(yīng)液，收集生物素標(biāo)記的糖蛋白；
[0010](3)將生物素標(biāo)記的糖蛋白與偶聯(lián)凝集素的磁珠反應(yīng)
[0011]向孵育緩沖液(0.5%Tween_20PBS)中加入生物素化的糖蛋白和磁珠，4°C下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，加入100 μ L清洗緩沖液(0.l%Tween-20PBS)清洗磁珠；再加入50 μ L孵育緩沖液稀釋的I μ g/mL鏈霉素-藻紅蛋白室溫下振蕩反應(yīng)40分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，重復(fù)清洗步驟；最后，用清洗緩沖液重懸磁珠；
[0012](4)利用Bio-Plex液相懸浮芯片檢測系統(tǒng)對信號進(jìn)行采集，每個孔檢測75個磁珠，并且記錄熒光信號中位值(MFI)。
[0013]本發(fā)明所述方法中，主要是將凝集素共價偶聯(lián)在磁珠上，在液體環(huán)境下與生物素標(biāo)記的糖蛋白進(jìn)行反應(yīng)，由于所述糖蛋白與凝集素在三維空間內(nèi)反應(yīng)，使得糖鏈與凝集素的親和力大大增加，進(jìn)而有效提高了凝集素芯片技術(shù)的靈敏度。本發(fā)明的方法可快速、簡便、特異、高通量地檢測蛋白質(zhì)糖基化特征，使用的樣品量較少，有利于不同樣品之間的差異比較，研究糖基化差異譜圖，為建立高通量蛋白質(zhì)糖基化修飾差異譜分析提供技術(shù)平臺，有利于探討疾病分子標(biāo)志物的不同糖基化狀態(tài)對疾病的預(yù)測價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明所述方法的實驗流程。
[0015]圖2為對于15 μ L磁珠，五種凝集素的偶聯(lián)質(zhì)量優(yōu)化曲線，其中，
[0016]A:WGA ；
[0017]B:AAL ；
[0018]C:Con A ；
[0019]D:PNA ；
[0020]E:RCA 120。
[0021]圖3為五種凝集素的最低檢測限，其中，
[0022]A: RCA120 ;
[0023]B:Con A ；
[0024]C:AAL ；
[0025]D:PNA ；
[0026]E:WGA。
[0027]圖4為五種凝集素的線性范圍，其中，
[0028]A:RCA 120 ；
[0029]B:Con A ；
[0030]C:AAL ；
[0031]D:PNA ；
[0032]E:WGA。
[0033]圖5凝集素液相懸浮液相芯片應(yīng)用于檢測標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)。
[0034]圖6凝集素液相懸浮液相芯片應(yīng)用于檢測臨床肝癌病人血清IgG的糖鏈結(jié)構(gòu)和糖基化水平；其中，
[0035]A:正常人和患肝癌人血清Ig G的糖基化結(jié)構(gòu)特點；[0036]B:兩種樣品所產(chǎn)生的突光信號相對定量；
[0037]C =PSA和SNA的凝集素印跡以驗證Ig G中的糖基化變化。
【具體實施方式】
[0038]下面的實例是對本發(fā)明提出的基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的新方法的進(jìn)一步說明。
[0039]實施例1凝集素偶聯(lián)量對凝集素芯片信號的影響實驗
[0040]在偶聯(lián)反應(yīng)中，用PBS配置一系列濃度的凝集素溶液，與15 μ L磁珠進(jìn)行偶聯(lián)；取出1.5μ L磁珠與過量的生物素化的糖蛋白(約5μ g/mL) 4°C過夜孵育，清洗后與二抗反應(yīng)，之后用Bioplex懸浮芯片檢測系統(tǒng)對信號進(jìn)行采集，結(jié)果如圖2所示，WGA的最佳偶聯(lián)量為21μ8\15μ?磁珠；AAL的最佳偶聯(lián)量為20μ8\15μ?磁珠；Con A的最佳偶聯(lián)量為2 μ g \ 15 μ L磁珠；PNA最佳偶聯(lián)量為5 μ g \ 15 μ L磁珠；RCA12 O的最佳偶聯(lián)量為10 μ g\15 μ L 磁珠。
[0041]實施例2凝集素液相懸浮芯片的最低檢測限實驗
[0042]采用上述實施例1制得的凝集素最佳偶聯(lián)量進(jìn)行偶聯(lián)；用反應(yīng)緩沖液配置一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白溶液，與1.5 μ L磁珠4°C過夜孵育，清洗后與二抗反應(yīng)，之后用Bioplex懸浮芯片檢測系統(tǒng)對信號進(jìn)行采集；本發(fā)明中特別設(shè)計了兩種不同的陰性對照:一種是BSA非糖蛋白陰性對照，另一種是糖蛋白陰性對照；凈信號為凝集素特異性識別的糖蛋白產(chǎn)生的信號減去陰性對照信號的平均值；當(dāng)凈信號大于標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍，并且信號與噪音的比值大于1.5倍時的最小糖蛋白濃度為檢測限；結(jié)果如圖3所示，RCA 120對牛去唾液酸胎球蛋白ASF的檢測限為50p·g/mL，Con A對牛胰腺核糖核酸酶B RNase B的檢測限為100pg/mL, AAL對辣根過氧化物酶HRP的檢測限為500pg/mL，PNA對牛去唾液酸胎球蛋白ASF的檢測限為2，000pg/mL, WGA對牛胎球蛋白FET的檢測限為3，333pg/mL ；RCA120對牛去唾液酸胎球蛋白ASF的檢測限為目前報道的凝集素芯片技術(shù)的最低檢測限。
[0043]實施例3凝集素液相懸浮芯片的線性范圍的實驗
[0044]采用上述實施例1制得的凝集素最佳偶聯(lián)量進(jìn)行偶聯(lián)；用反應(yīng)緩沖液配置一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白溶液，與1.5 μ L磁珠4°C過夜孵育，清洗后與二抗反應(yīng)，之后用Bioplex懸浮芯片檢測系統(tǒng)對信號進(jìn)行采集；結(jié)果如圖4所示，RCA 120對牛去唾液酸胎球蛋白ASF的線性范圍為50~3，333pg/mL，Con A對牛胰腺核糖核酸酶B RNase B的線性范圍為100~10，000pg/mL, AAL對辣根過氧化物酶HRP的線性范圍為0.5~500ng/mL，PNA對牛去唾液酸胎球蛋白ASF的2~1，000ng/mL,WGA對牛胎球蛋白FET的線性范圍為3.3~2，OOOng/
mLo
[0045]實施例4凝集素液相懸浮芯片用于檢測標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白樣品的糖鏈結(jié)構(gòu)
[0046]采用上述實施例1制得的凝集素最佳偶聯(lián)量進(jìn)行偶聯(lián)；取100 μ g標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白進(jìn)行生物素化標(biāo)記；用偶聯(lián)有17種不同凝集素的芯片分別與生物素化的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化物酶HRP(50ng/mL)、小鼠層粘連蛋白mLam(33ng/mL)和牛去唾液酸胎球蛋白ASF(50ng/mL)4°C過夜孵育，清洗后與二抗反應(yīng)，之后用Bioplex懸浮芯片檢測系統(tǒng)對信號進(jìn)行采集；在減去牛血清白蛋白BSA陰性對照的背景信號后，計算其信號的相對強(qiáng)度，結(jié)果如圖5所示，凝集素液相懸浮芯片方法檢測到糖鏈結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道相一致。[0047]實施例5凝集素液相懸浮芯片用于檢測實際樣品中糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)和糖基化水平
[0048]為了證明凝集素液相芯片在實際樣品糖基化檢測和相對定量的有效性，本發(fā)明中選擇了血清中富集的Ig G作為一個實際應(yīng)用的例子；分別從3個健康人及3個患肝癌人混合血清中富集獲得的Ig G以16.67ng/mL的濃度稀釋于孵育反應(yīng)液中，再與凝集素液相芯片4°C過夜孵育清洗后與二抗反應(yīng)，之后用Bioplex懸浮芯片檢測系統(tǒng)對信號進(jìn)行采集；采用牛血清白蛋白BSA作為陰性對照，在減去背景信號后，記錄凝集素的檢測信號；結(jié)果如圖6所示，凝集素的檢測信號顯示Ig G的糖基化特征與之前的報道一致；與健康人血清相比，肝癌人血清中Ig G上被SNA-1所識別的(α -2，6)唾液酸，以及被PSA所識別的(α -1, 6)核心巖藻糖顯著增加。
【權(quán)利要求】
1.一種基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，步驟如下: (1)凝集素與磁珠的共價偶聯(lián)，制備凝集素液相懸浮芯片 清洗緩沖液清洗磁珠后，加入活化緩沖液重懸磁珠；向磁珠內(nèi)加入50 μ g/μ L EDC和50 μ g/μ L sulfo-NHS，振蕩條件下避光室溫反應(yīng)20分鐘；用PBS清洗過量的EDC和sulfo-NHS，并重復(fù)清洗過程一次；最后，用PBS重懸活化的磁珠；用PBS配置一系列的凝集素與活化后的磁珠4°C過夜反應(yīng)；離心去上清后，加入“Stabil Guard Choice”無蛋白封閉溶液重懸，室溫孵育30分鐘；離心后，用貯存緩沖液重懸磁珠； (2)用氨基反應(yīng)生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記糖蛋白 將標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶于H2O,使蛋白終濃度為10 μ g/ μ L將10 μ L DMSO加入到氨基反應(yīng)生物素，吹打使其溶解；向蛋白溶液中加入反應(yīng)緩沖液和氨基反應(yīng)生物素溶液，于37°C反應(yīng)10分鐘；利用IOkDa MWCO離心超濾管超濾除去反應(yīng)液，收集生物素標(biāo)記的糖蛋白； (3)生物素標(biāo)記的糖蛋白與偶聯(lián)凝集素的磁珠反應(yīng) 向孵育緩沖液中加入生物素化的糖蛋白和磁珠，4°C下反應(yīng)過夜；反應(yīng)結(jié)束后，加入100 μ L清洗緩沖液清洗磁珠；再加入50 μ L孵育緩沖液稀釋的I μ g/mL鏈霉素-藻紅蛋白室溫下振蕩反應(yīng)40分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，重復(fù)清洗步驟；最后，用清洗緩沖液重懸磁珠； (4)利用Bio-Plex液相懸浮芯片檢測系統(tǒng)對信號進(jìn)行采集；每個孔檢測75個磁珠，并且記錄熒光中位值MFI。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，所述步驟(I)中，采用250 μ g/ μ L EDC和50 μ g/ μ L sulfo-NHS活化磁珠，避光室溫反應(yīng)20分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，所述步驟(I)中，采用“Stabil Guard Choice”無蛋白封閉溶液封閉磁珠,室溫孵育30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，所述步驟(2)中，采用NH2-reaction biotin標(biāo)記糖蛋白，于37°C反應(yīng)10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，所述步驟(3)中，凝集素液相懸浮芯片與糖蛋白孵育反應(yīng)的緩沖液為0.5%Tween-20PBSo
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，所述步驟(3)中，清洗緩沖液為0.l%Tween-20PBSo
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝集素液相懸浮芯片檢測糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，所述步驟(4)中，采用Bio-Plex液相懸浮芯片檢測系統(tǒng)對凝集素芯片信號進(jìn)行采集。
【文檔編號】G01N33/68GK103674918SQ201310680331
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】李宏, 汪泓, 余紅秀, 楊芃原 申請人:復(fù)旦大學(xué)