專利名稱：馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法。
背景技術(shù)：
馬鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis, ER)是馬屬動(dòng)物幾種高度接觸傳染性疾病的總稱，其病原體為親緣關(guān)系密切的兩種皰疹病毒馬皰疹病毒1型(EHV-I)和馬皰疹病毒 4型(EHV-4)。馬鼻肺炎是馬的一種急性發(fā)熱性傳染病。在敏感馬群中可100%感染，1993 年6月在新疆野馬繁殖中心野馬群中爆發(fā)的馬鼻肺炎流行過程中，馬群100%感染，成年馬臨床癥狀較輕而幼駒癥狀嚴(yán)重，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、上呼吸道粘膜的卡他性炎癥以及白細(xì)胞減少。病程1周左右，幼駒可達(dá)IOd以上，妊娠毋馬感染本病時(shí)易發(fā)生流產(chǎn)和產(chǎn)下弱駒，弱駒產(chǎn)下后多在48h內(nèi)死亡，流產(chǎn)和弱駒死亡率可達(dá)80%以上。本病廣泛發(fā)生于世界各地，美國、英國、日本、澳大利亞、新西蘭、意大利、波蘭、瑞典、比利時(shí)、愛爾蘭、挪威、瑞士、葡萄牙、西班牙、法國、德國、匈牙利、加拿大、南非、巴西、 阿根廷、印度、馬來西亞以及我國的臺(tái)灣省和香港特別行政區(qū)等50多個(gè)國家和地區(qū)均有報(bào)導(dǎo)，給世界養(yǎng)馬業(yè)帶來很大危害、多數(shù)國家已將本病例為養(yǎng)馬業(yè)重點(diǎn)防制疫病之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將馬鼻肺炎列為須通報(bào)動(dòng)物疫病。在大量飼養(yǎng)馬匹進(jìn)行傳統(tǒng)耕作或以之作為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)一部分的國家中，EHV-I和 EHV-4這兩種病毒感染呈地方性流行。從馬以外的其它馬屬動(dòng)物，如斑馬、亞洲野驢和驢，已經(jīng)分離到與EHV1/4親緣關(guān)系極為密切的皰疹病毒.也可見到EHV-I感染非馬屬動(dòng)物的個(gè)別病例，如感染牛引起流產(chǎn)，美洲駝引起視神經(jīng)疾病和失明等。目前，尚無證據(jù)證明這兩種皰疹病毒對(duì)人有感染性。馬鼻肺炎的呼吸道疾病雖說可造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，但最大的威脅卻是給種馬、賽馬或娛樂馬帶來的潛在的流產(chǎn)和神經(jīng)疾患后遺癥。國內(nèi)于1980年從流產(chǎn)的馬胎兒中分離到了病毒(但未區(qū)分是EHV-I還是EHV-2)，并對(duì)部分省區(qū)的馬匹進(jìn)行了普查，總陽性率為49. 9 %，證明了本病在我國的存在。人類基因組測序已經(jīng)完成，豐富的信息加深了我們對(duì)基因差異及其與疾病和疾病治療關(guān)系的理解。越來越多的致病基因突變需要鑒定，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室要檢測的DNA大幅度增加，迫切需要快速，精確，經(jīng)濟(jì)的高通量核酸檢測方法。本專利采用PCR檢測方法與液相芯片檢測技術(shù)結(jié)合，建立了馬鼻肺炎(EHV-I)的液相芯片快速檢測方法，為馬鼻肺炎的檢測提供了又一種方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法，即一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的馬鼻肺炎病毒液相芯片檢測方法，及其所用到的引物，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用液相芯片技術(shù)。該技術(shù)是在核酸水平上的一種檢測技術(shù)，具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高的特點(diǎn)。其原理是將編碼微球單個(gè)逐一通過檢測通道時(shí)受到雙色激光(如紅色和綠色)同時(shí)照射，第一束激光激發(fā)微球的分類熒光，根據(jù)熒光編碼確定微球的類別，即微球內(nèi)部的兩種熒光物質(zhì)受激發(fā)后可發(fā)射兩種不同波長的熒光，不同類別微球內(nèi)這兩種熒光物質(zhì)比例不同，則熒光強(qiáng)度比例也不同，從而將不同的特異性反應(yīng)區(qū)分開來；第二束激光激發(fā)報(bào)告分子上的熒光素，根據(jù)熒光強(qiáng)度確定微球上結(jié)合的報(bào)告分子的數(shù)量從而確定目標(biāo)分子的數(shù)量(定量)。系統(tǒng)只記錄與紅色熒光同時(shí)出現(xiàn)的綠色熒光信號(hào)， 不記錄未結(jié)合的報(bào)告分子熒光信號(hào)，因此檢測前無需洗脫未結(jié)合的報(bào)告分子。此外，利用流式細(xì)胞術(shù)中90°C角散射光可有效地消除微球聚集對(duì)結(jié)果造成的影響。各種熒光信號(hào)經(jīng)分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，可獲得檢測物的種類和數(shù)量。本發(fā)明中所涉及到的引物和探針序列如下正向引物dirct primer :5-AAGCCCAGGCATTCGCAAGACC-3~ SEQ ID NO :1反向引物reverse primer :5:CAAACCGACGCTGATGCCCACA_3~ SEQ ID NO :2探針Probe 5~ _TTAAGTGGCCCAGCATCAAACA_3~ SEQ ID NO :3。正向引物和反向引物5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；探針的5’端進(jìn)行氨基化修飾。本發(fā)明的引物和探針用于檢測馬鼻肺炎病毒，其檢測方法包括有1)檢測樣品 RNA的提取、2) RT-PCR擴(kuò)增目的片段、3)寡核苷酸探針與微球共價(jià)偶聯(lián)、4)探針與RT-PCR 擴(kuò)增片段雜交和幻液相芯片儀分析步驟。其中步驟2~) RT-PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為第一階段，反轉(zhuǎn)錄50°C :30min ；第二階段，預(yù)變性94°C :3min ；第三階段，擴(kuò)增94°C :30s, 59°C :30s, 72°C :30s，30 個(gè)循環(huán)；第四階段，延伸72°C :5min。本發(fā)明的檢測方法能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速檢測，從樣品處理到出結(jié)果僅需4小時(shí)左右；由于采用了接近生物反應(yīng)體系的液相芯片系統(tǒng)和特異性的探針，使該方法可與熒光定量PCR相媲美。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物與常見馬屬動(dòng)物其他病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，由于采用了液相反應(yīng)體系，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)檢測方法，大大杜絕了非特異性擴(kuò)增造成的假陰性結(jié)果。本發(fā)明的方法提供了優(yōu)化的操作程序，操作簡單，具有良好重復(fù)性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明所用到的儀器耗材信息如下表面羧基化的熒光編碼微球、鞘液購置于BD 公司，TMAC temtrameihyl-ammdni μπι chloride, Tris, SDS (10% sol μ tion)購置于美國 Sigma 公司，SPAE Str印tavidin-R-phycoerythrin 購于美國 Prozyme 公司，RNA 提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購于大連寶生物公司。主要設(shè)備包括BD FACSArray液相芯片儀、梯度 PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)、Sigma高速冷凍離心機(jī)等。通過hternet登陸美國國立生物信息技術(shù)中心(NCBI)，查詢檢索已公布的馬鼻肺炎病毒基因序列。利用I^rimer Premierf.O軟件設(shè)計(jì)引物和探針，并最終篩選出一對(duì)具有高特異性的引物和探針，參見表1。表1設(shè)計(jì)的引物和預(yù)期目的片段大小
權(quán)利要求
1.一種馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測的引物和探針，其特征在于，引物和探針的核酸序列如下正向引物=SEQ ID NO 1 反向引物Γ SEQ ID NO 2 探針 Γ SEQ ID NO :3ο
2.如權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于所述的正向引物和反向引物5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；探針的5'端進(jìn)行氨基化修飾。
3.一種液相芯片檢測馬鼻肺炎病毒的方法，其特征在于，是用權(quán)利要求2所述的引物和探針進(jìn)行檢測。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于包括有1)檢測樣品RNA的提取、2)RT-PCR擴(kuò)增目的片段、幻寡核苷酸探針與微球共價(jià)偶聯(lián)、4)探針與RT-PCR擴(kuò)增片段雜交和幻液相芯片儀分析步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的步驟2)RT-PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為 第一階段，反轉(zhuǎn)錄50°C :30min ；第二階段，預(yù)變性94°C :3min ；第三階段，擴(kuò)增 94°C :30s, 59°C :30s，72°C :30s，30 個(gè)循環(huán)； 第四階段，延伸720C :5min0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法，本發(fā)明的檢測方法能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速檢測，從樣品處理到出結(jié)果僅需4小時(shí)左右；由于采用了接近生物反應(yīng)體系的液相芯片系統(tǒng)和特異性的探針，使該方法可與熒光定量PCR相媲美。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物與常見馬屬動(dòng)物其他病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，由于采用了液相反應(yīng)體系，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)檢測方法，大大杜絕了非特異性擴(kuò)增造成的假陰性結(jié)果。本發(fā)明的方法提供了優(yōu)化的操作程序，操作簡單，具有良好重復(fù)性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102433394SQ20111042642
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者孫濤, 岳志芹, 徐彪, 朱來華, 梁成珠, 王群, 肖西志, 趙玉然, 鄧明俊, 鄭小龍 申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心