專利名稱：膠體金層析法抗核糖體p0抗體檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于醫(yī)學(xué)免疫應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及到利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測抗核糖體PO抗體的試紙。
背景技術(shù)：
抗核糖體P蛋白抗體被認(rèn)為是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)的特異性抗體(Ghirardello A, Doria A, Zamp ieri S, et al. Antiribosomal P ρ rotein antibodies detected by immunoblotting in patients with connective tissue diseases their specificity for systemic lupus erythematosus and as sociation with anticardiolip in antibodies [J] · Ann Rheum D is，2000，59 :975-981.)，其所針對的抗原為3種核糖體磷酸蛋白PO，Pl及P2。既往研究認(rèn)為，抗核糖體P蛋白抗體與SLE患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害關(guān)系密切，是神經(jīng)精神狼瘡的標(biāo)志；也有人報(bào)道認(rèn)為，其與病情活動及腎臟、肝臟損害等有關(guān)Walaouil S，Gorgil Y，Hajri2 R，et al. Autoantibodies to ribosomal P proteins in systemic lupus erythematosus [J]. JointB one Spine，2002，69 :173-176·)。國內(nèi)報(bào)道((吳振彪，朱平，王彥宏等系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清抗核糖體P蛋白抗體的檢測及其臨床意義[J]細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2005，21 (1) 120-122)。)采用歐盟免疫斑點(diǎn)法，對150例SLE患者血清抗核糖體P蛋白抗體進(jìn)行測定，陽性率為對％，介于文獻(xiàn)[Arnett PC, Reveille JD, Moutsopoulos HM, et al. Ribosomal P autoantibodies in systemic lupus erythematosus -frequencies in differentethnic groups and immunogenetics associations [J]. A rthritis Rheum, 1996, 39 1833-1839.]報(bào)道的 10% 40%之間，高于歐美人群13%的陽性率。Yalaouil S等認(rèn)為，抗核糖體P蛋白抗體與SLE的神經(jīng)精神損害的相關(guān)性最強(qiáng)，并稱其為SLE的神經(jīng)精神損害的“標(biāo)志物”(Yalaouil S，Gorgil Y, Hajri2 R, et al. Autoantibodies to ribosomal P proteins in systemic lupus erythematosus [J]. JointB one Spine，2002，69 :173-176.)，這與其和其余抗神經(jīng)元抗體在不同環(huán)節(jié)參與了神經(jīng)精神損害的過禾呈[Isshi K, Hirohata S. Differential roles of the anti ribosomal P antibody and anti neuronal antibody in the pathogenesis of central nervous system involvement in systemic lupus erythematosus[J]. A rthritisRheum,1998,41 1819-1827.]有關(guān)。之后有研究報(bào)道，抗核糖體P蛋白抗體與SLE患者的肝臟損害及狼瘡性腎炎相關(guān)，并認(rèn)為抗核糖體P蛋白抗體是引起肝細(xì)胞損傷的致病因子?？筆蛋白抗體與SLE患者的病情活動也有關(guān)，病情活動的患者該抗體的陽性率及滴度升高[Chindalore V，NeasB, ReichlinM. The association between anti ribosomal P antibodies and active nephritis in systemic lupus erythematosus[J]. Clin Imm uno Imm unopathol，1998， 87 :292-296.]。[0007]SLE患者存在著顯著的淋巴細(xì)胞亞群及腫瘤壞死因子受體異常，并與臟器的受累有關(guān)[左巍，馬東初，左偉等.狼瘡性腎炎患者淋巴細(xì)胞亞群比率和免疫球蛋白水平的變化 [J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2002，18(1) :46-48.]。Reichlin φ [ReichlinM, BroylesTF, H"u bscherO, et al. Antibodies to ribosomalP ρ roteins are more ρ revalent in juvenile onset systemic lupus erythematosus than in the adult disease[J]. A rthritis Rheum, 1999,42 :69-75.]報(bào)道，抗核糖體P蛋白抗體在青年發(fā)病的SLE患者中陽性率高。還發(fā)現(xiàn)，抗核糖體P蛋白抗體的陽性率與抗Sm、抗RNP抗體的陽性率及抗dsDNA抗體相關(guān)，而與抗SSA、抗SSB抗體及ANA 無相關(guān)性，與既往的(ihirardello A登報(bào)道相符。抗核糖體P蛋白不存在于其他自身免疫疾病中，抗核糖體磷蛋白(Rib-P)的自身抗體被認(rèn)為對SLE具有高度特異性。核糖體復(fù)合物的大亞基(60 酸性磷蛋白，P0(38kD)， Pl(19kD)和P2(17kD)，擔(dān)當(dāng)自身抗原。PO被認(rèn)為是主要靶抗原，因?yàn)閹缀跛锌购颂求w血清都與此抗原反應(yīng)，因此本實(shí)用新型采用表達(dá)人源化基因工程菌的方式來生產(chǎn)主要靶抗原P0。抗核糖體P抗體主要在活動期的SLE病人中查到。最重要的是在這些抗體和SLE， 特別是患嚴(yán)重的低血壓、腎炎和肝炎的SLE病人，之間存在相關(guān)性。目前實(shí)驗(yàn)室常用的檢測抗核膜糖蛋白(核糖體P0)抗體的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附齊Lli式驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫印跡法(immunoblotting test, IBT)、線性免疫分析法(Line immunoassay, LIA)、免疫擴(kuò)散法(immunodiffusion) [Rayno K, Reichlin Μ.Evaluation of Assays for the detection of autoantibodies to the ribosomal ρ ρ roteins[J]. Clini Imm unol, 2000,95 :99-103.]。免疫印跡法雖綜合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，但操作相對復(fù)雜，且試劑具有較強(qiáng)的毒性和污染性。線性免疫分析法主要用于疾病大類的篩查，針對性相對較差，同時也不適合高通量樣本的檢測。ELISA法檢測可用于高通量標(biāo)本測定，靈敏度也較高，目前被廣泛認(rèn)可，但操作比較繁瑣，需多次加樣和洗滌，且易受溫度和孵育條件的影響，在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行操作，給實(shí)驗(yàn)帶來諸多不便。免疫擴(kuò)散法由于敏感度較差，判斷結(jié)果依賴于操作人的經(jīng)驗(yàn)，孵育時間較長，不適合高通量樣本的檢測，因此在臨床上也受到限制。目前市場上商品化抗核糖體PO抗體檢測試劑盒主要為免疫印跡法，操作程序煩瑣，完成整個實(shí)驗(yàn)過程需三小時左右，亦需要專業(yè)免疫學(xué)技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，同時易受各種溫度和孵育時間等環(huán)境條件因素的影響，對試驗(yàn)帶來諸多不便。膠體金層析法應(yīng)用到抗核糖體PO抗體的檢測中。膠體金免疫層析法 (gold-immunochromatography assay, GICA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)效應(yīng)使樣品溶液在層析條上泳動，使樣品中的待測物與結(jié)合墊上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)，并與條狀纖維層析材料上的抗原(或抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)而形成肉眼可見的紫紅色條帶，得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到快速檢測的目的(Sikowicz G et al. One-step chromatographicimmunoassay for qualitative determination of choricogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990(36) 1579-1586.)。使用時只將樣品加樣到樣品墊上，數(shù)分鐘就根據(jù)檢測線上紫紅色條帶出現(xiàn)情況來判斷陰陽性結(jié)果。與其他檢測方法相比，檢測時間短，只需要5 10 分鐘，操作人員無需培訓(xùn)，操作簡便、快速，無需低溫保存，儲運(yùn)方便等優(yōu)勢。在自身免疫性疾病方面，目前國外市場上出現(xiàn)了一些檢測自身免疫疾病的試紙條產(chǎn)品，但抗核糖體PO抗體的膠體金免疫試紙?jiān)趪鴥?nèi)外市場上仍沒有問世。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問題是為了克服以上方法學(xué)的不足，將膠體金層析法應(yīng)用到抗核糖體PO抗體的檢測中，同時首次將核糖體PO抗原蛋白應(yīng)用到膠體金層析法中， 采用間接法來實(shí)現(xiàn)血液中的抗核糖體PO抗體檢測，實(shí)現(xiàn)高特異、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測性能，快速篩選出抗核糖體PO抗體的陽性樣本，能快速、便捷地輔助診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡。。本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問題在于提供一種膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙。本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問題可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，包括有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側(cè)依次向所述底板的另一側(cè)粘貼在所述底板上，其特癥在于所述的結(jié)合墊包被有金標(biāo)抗體a層和金標(biāo)抗體b層；所述的硝酸纖維素包被膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述的檢測線包被有核糖體 PO抗原蛋白層，所述的質(zhì)控線包被有金標(biāo)抗體c層。進(jìn)一步，所述的金標(biāo)抗體a層中的抗體A為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)中的一種或多種。所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種。所述的抗人IgG單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。所述金標(biāo)抗體a層中的抗體A優(yōu)選為葡萄球菌A蛋白。所述的金標(biāo)抗體b層中的抗體B和金標(biāo)抗體c層中的抗體C同時或不同時為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中金標(biāo)抗體b層中的抗體B和金標(biāo)抗體c層中的抗體C 可發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。 所述的金標(biāo)抗體b層中的抗體B優(yōu)選為兔IgG，相應(yīng)地金標(biāo)抗體c層中的抗體C優(yōu)選為羊抗兔IgG。所述的檢測線上包被的核糖體PO抗原蛋白層為通過原核表達(dá)克隆化基因獲得的核糖體PO抗原蛋白層。所述核糖體PO抗原蛋白是通過大腸桿菌原核表達(dá)的克隆化基因所獲得的重組蛋白。所述樣品墊的樣本來自人血清、血漿、全血樣本。[0035]根據(jù)本實(shí)用新型應(yīng)用的單克隆抗體可通過由Kohler等(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. Nature,1975(256) 495-497)首先描述的雜交瘤法進(jìn)行制備，或者可通過重組DNA法進(jìn)行制備(見美國專禾Ij 4816567)。"單克隆抗體，，由 Clackson 等(Making antibody fragments using phage display libraries[J]. Nature,1991 :624-628)禾口 Marks 等(By-passing immunization Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage[J]. Journal of Molecular Biology, 1991 :581-597)所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。根據(jù)本實(shí)用新型應(yīng)用的多克隆抗體可通過陳學(xué)清等(免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.[M]， 2000 :15-26)通過免疫動物來制備。本實(shí)用新型的SPAlrotein G通過原核表達(dá)克隆化重組基因，由J.薩姆布魯克等 (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.[M]，2002:12^-1232)描述的大腸桿菌原核表達(dá)克隆化基因。本實(shí)用新型的膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙的應(yīng)用，其是定性檢測人血清中抗核糖體PO抗體，輔助診斷早期系統(tǒng)性紅斑狼瘡。本實(shí)用新型將基因工程菌表達(dá)的抗原蛋白首次引入到試紙條中，實(shí)現(xiàn)了高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度的檢測性能，能滿足市場的快速篩選SLE，為病人及早診斷治療提供條件，同時，也能滿足基層實(shí)驗(yàn)室、即時檢測、床邊檢測的需求。本實(shí)用新型的檢測原理具體為選用親和層析純化的重組表達(dá)的核糖體PO抗原蛋白，金標(biāo)抗體a和金標(biāo)兔IgG作為膠體金標(biāo)記復(fù)合物，噴涂于結(jié)合墊，利用間接法來檢測血清樣品中是否含有抗核糖體PO抗體。檢測時，樣本隨著層析泳動到結(jié)合墊并浸潤膠體金標(biāo)記復(fù)合物，其中的人IgG和金標(biāo)抗體a結(jié)合形成人IgG-金標(biāo)抗體a復(fù)合物，由于毛細(xì)效應(yīng)， 此人IgG-金標(biāo)抗體a復(fù)合物沿包被膜泳動向前，若血清樣品中有抗核糖體PO抗體，此人 IgG-金標(biāo)抗體a復(fù)合物與包被于硝酸纖維素膜上的抗原蛋白發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)抗體a-人IgG-核糖體PO抗原蛋白三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶；由于毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動向前，金標(biāo)兔IgG與包被在質(zhì)控線上的羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶，多余的未結(jié)合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線和質(zhì)控線都出現(xiàn)條帶的判為陽性結(jié)果； 若血清樣品中不含有抗核糖體PO抗體，金標(biāo)抗體a到達(dá)檢測線時，不與包被在檢測線上的抗原蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，因此在檢測線處沒有出現(xiàn)紫紅色條帶，金標(biāo)抗體a繼續(xù)泳動向前到達(dá)吸水墊，而金標(biāo)兔IgG繼續(xù)泳動向前與包被于質(zhì)控線處羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)而被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成紫紅色條帶，因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)條帶判為陰性結(jié)與現(xiàn)有的檢測方法相比，本實(shí)用新型優(yōu)點(diǎn)1.本實(shí)用新型的獨(dú)特性在于基因重組表達(dá)的核糖體PO抗原蛋白首次應(yīng)用于膠體金層析試紙，大大提高了其檢測靈敏度，通過膠體金試紙可快速篩選出抗核糖體PO抗體所有陽性樣本(能檢出大于25RU/ml的樣本)。2.本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)成本低。本實(shí)用新型所提供的抗核糖體PO抗體的檢測試紙所需的核心試劑是金標(biāo)抗體a中的抗體A即抗人IgG或SPA或PROTEIN G、金標(biāo)抗體 C、抗體B、抗原蛋白，其單條試紙所用試劑量少，且可通過購買商品化試劑或自制，抗原蛋白來源于自制的純化基因工程抗原蛋白。[0044]3.與已公開的用于抗核糖體PO抗體檢測的其他方法相比，本實(shí)用新型的試紙具有許多其他方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，如檢測時間短(5 IOmin)；不需要任何特殊儀器，可實(shí)現(xiàn)床邊檢測和門診即時檢測；操作簡便，只需一步反應(yīng)，操作人員無需培訓(xùn)，檢測成本低； 對溫度無特殊要求，無需冷凍，儲存運(yùn)輸方便，室溫可保存M個月。

圖1為本實(shí)用新型的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本實(shí)用新型的檢測結(jié)果示意圖。其中圖加所示為加樣后，反應(yīng)3 5min即可看到檢測區(qū)D和控制區(qū)E相應(yīng)位置上出現(xiàn)紫紅色條帶；圖2b所示為當(dāng)控制區(qū)E和檢測區(qū)D均出現(xiàn)紫紅色條帶，結(jié)果為陽性，說明血清中含有抗核糖體PO抗體；圖2c所示為如只在控制區(qū)E出現(xiàn)一條紫紅色條帶，檢測區(qū)D不出現(xiàn)紫紅色條帶， 結(jié)果為陰性，說明血清中不含抗核糖體PO抗體；圖2dJe所示為如控制區(qū)E不出現(xiàn)紫紅色條帶，無論檢測區(qū)D是否有條帶出現(xiàn)， 都說明試紙失效。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型所述的膠體金免疫層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，如圖1所示，如圖1所示，該試紙是在底板7上由一側(cè)向另一側(cè)順次相互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜3、 結(jié)合墊2、樣品墊1、吸水墊6。結(jié)合墊2上包被有金標(biāo)抗體a層和金標(biāo)抗體b層，金標(biāo)抗體a層的抗體A為羊抗兔IgG金標(biāo)抗體或鼠抗人IgG金標(biāo)抗體或葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體或鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體；金標(biāo)抗體b層中的抗體B為兔IgG。硝酸纖維素包被膜3上設(shè)置有檢測線4和質(zhì)控線5，檢測線4包被有核糖體PO抗原蛋白層，質(zhì)控線5包被有金標(biāo)抗體c層，金標(biāo)抗體c層中的抗體為羊抗兔IgG。下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本實(shí)用新型。實(shí)施例1核糖體PO抗原蛋白制備應(yīng)用于本試紙的核糖體PO抗原蛋白是通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建重組基因，然后采用原核表達(dá)技術(shù)成功表達(dá)出全部為人源的核糖體PO抗原蛋白。其中，核糖體PO抗原蛋白來源于純化基因工程抗原蛋白。實(shí)施例2抗體制備抗體A及抗體C、抗體B用下述方法來制備。其中抗體A中的抗人IgG、抗體C及抗體B—般可通過在動物上經(jīng)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射純化的免疫原和佐劑而產(chǎn)生。通過將0. 05mg Img免疫制劑(分別針對山羊或小鼠)與3倍體積的Freund’s 完全佐劑混合得到注射溶液，將該注射溶液在動物皮內(nèi)多部位注射，一個月后將動物用1/5 至1/10原初量的人IgG的Freund’ s完全佐劑混合液經(jīng)多部位動物皮下注射而加強(qiáng)免疫。7 14天后將動物放血，測定血清抗人IgG滴度。對動物加強(qiáng)免疫直至滴度達(dá)到平臺期。 在許多免疫學(xué)教科書中描述了生產(chǎn)多克隆抗體的方法，例如，陳學(xué)清等《免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法》。通過從被免疫的動物回收脾細(xì)胞并使細(xì)胞永生化，例如通過與骨髓瘤細(xì)胞融合或通過Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化，并且篩選能表達(dá)目的抗體的單克隆抗體(Kohler，Milstein. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion [J]. European Journal of Immunology，1976 :501_511)?？赏ㄟ^大腸桿菌原核表達(dá)克隆化基因來制備抗體A中的重組葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白，具體操作方法參見J.薩姆布魯克等(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.[M]，2002: 1228-1232)，或購買商品化的重組葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白。實(shí)施例3膠體金溶液制備將0. 01 %的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入每IOOmL HAuCl4溶液加入適量的還原劑溶液，顏色從藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7 IOmin出現(xiàn)透明的橙紅色。再用超濾或微孔濾膜(0. 45 μ m)過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。 制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色顆粒狀沉淀物時棄用。其中所使用的還原劑可以為檸檬酸三鈉(Frens 1973)、鞣酸-檸檬酸三鈉(Slot 與Gueeze 1985年)、白磷，優(yōu)選使用檸檬酸三鈉，更優(yōu)選地使用檸檬酸三鈉。其中所用玻璃容器應(yīng)絕對清潔，用前需經(jīng)酸洗、硅化。其水應(yīng)為去離子超純水，電阻率達(dá)18. 2ΜΩ。膠體金溶液制備過程中，各溶液的配制方法如下LHAuCl4的配制用超純水溶解氯金酸，配成1 %溶液，置4°C備用，有效期四個月。IOOOmL HAuCl4溶液配方IOg HAuCl4、超純水定容至1000mL。2. 檸檬酸三鈉的配制檸檬酸三鈉(Sodium Citrate)的配制用超純水溶解Sodium Citrate,配成1 %溶液，0. 22 μ m膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。實(shí)施例4本實(shí)用新型的膠體金免疫層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙的制備方法，具體包括如下步驟步驟1，硝酸纖維素包被膜的制備(1)采用實(shí)施例1的方法制備核糖體PO抗原蛋白；(2)羊抗兔IgG金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實(shí)施例3制備的膠體金pH7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 μ g羊抗兔IgG，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌 10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；(3)硝酸纖維素包被膜3的制備，用包被膜緩沖液稀釋核糖體PO抗原蛋白至濃度為1. 0 1. 5mg/mL,調(diào)整ΒΙΟ-Dot儀器，噴涂于硝酸纖維素膜(NC)上檢測線4處，靠近結(jié)合墊2端，距結(jié)合墊2約9. 5mm,使Cenp-B抗原蛋白包被于硝酸纖維素包被膜的檢測線4 上；[0077]用包被緩沖液將羊抗兔IgG稀釋到0. 8 1. 5mg/mL,以1 10 μ 1/cm用BIO-Dot 儀器噴涂于硝酸纖維素膜(NC)上靠近吸水墊6的質(zhì)控線5處，距吸水墊6約9mm。檢測線 4與質(zhì)控線5兩線距離約5 8mm，噴線應(yīng)粗細(xì)均勻。37°C烘干，封裝備用。其使用的包被緩沖液可以是硼酸鹽，碳酸鹽，磷酸鹽，Tris-HCl或Tris-磷酸鹽， 醋酸鹽，巴比妥，等等，其緩沖液的目的為提供一定PH和離子強(qiáng)度使蛋白包被并牢固包被于NC膜，其緩沖液pH值一般約為6 9. 5范圍內(nèi)，優(yōu)選為6. 5 7. 5的中性緩沖范圍內(nèi)， 且最優(yōu)選緩沖液的PH值為7. 0 7. 4范圍內(nèi)。緩沖液優(yōu)選為磷酸鹽。其中的硝酸纖維素膜(NC)可以為任何商品化硝酸纖維素膜，S&SAE99, whatman 8ym、millipore M135、sartorius CN140等。使用的具體的NC膜不是本實(shí)用新型的關(guān)鍵， 但是在每次測定中，上述幾種NC膜可以作為優(yōu)選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩沖液處理的膜，與所用檢測線抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會很大程度造成線條不均勻，拖帶或是彌散的現(xiàn)象，因此運(yùn)用組裝試紙來選擇優(yōu)選的NC膜。步驟2，結(jié)合墊的制備(1)羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實(shí)施例3制備的膠體金 pH8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ m羊抗人IgG，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3 次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；(2)兔IgG金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實(shí)施例3制備的膠體金pH值至 7. 0 8. 0,按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g兔IgG，攪拌10 30min，然后加入 BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。(3)結(jié)合墊的制備經(jīng)緩沖液將聚脂膜浸泡30分鐘，37°C烘干，將羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體按一定的比例混合后，用ΒΙΟ-Dot儀器，以0. 5 4μ 1/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥，待干燥完畢之后得結(jié)合墊2，結(jié)合墊2真空包裝， 置2°C 8°C備用。置于2°C 8°C的環(huán)境下備用；結(jié)合墊的制備過程中，可以使用的緩沖液包括以下幾種(a)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% TritonX-IOO ；(b) 1% PVAU% BSA,0. 05% PR0CLIN 300、0. 1% TritonX-100, ρΗ7· OPBS ；(c) 1% PVAU% BSA、0. 05% PR0CLIN 300, ρΗ7· OPBS ；(d)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% Tween-20 ；(e)含有 1%PVA、0. 71 % Na3PO4U % BSA,0. 05% NaN3>0. 1 % Tween-20, pH7. OPBS ；其優(yōu)選的緩沖液是緩沖液(d)，因?yàn)樗哂袇^(qū)別陰陽性樣品的最大分辨率。 PR0CLIN 300和NaN3起防腐作用，而Tween-20具有去污和親水作用。羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照下述方法進(jìn)行通過預(yù)實(shí)驗(yàn)基本確定兔IgG金標(biāo)抗體的0D20，用ΒΙΟ-Dot噴量1 μ 1/cm噴于預(yù)處理的聚脂膜上，用0. OlMPBS為上樣緩沖液，即能得到預(yù)期的顏色強(qiáng)度的條帶，確定兔IgG金標(biāo)抗體的應(yīng)用OD噴量為Ιμ 。隨后將羊抗人IgG金標(biāo)抗體進(jìn)行梯度稀釋到終濃度0D100、80、60、40、20，然后將兔IgG金標(biāo)抗體稀釋到終濃度0D20，用ΒΙΟ-Dot將以上羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體混合物噴量為3 μ 1/cm噴于處理好的聚酯膜，將制備的硝酸纖維素包被膜3、結(jié)合墊2、 樣本墊1、吸水墊6依次粘貼于底板7上，用陽性血清、臨界參考值血清、陰性血清為調(diào)試對象。判定依據(jù)陽性血清的檢測線4和質(zhì)控線5兩者的條帶顏色強(qiáng)度一致為依據(jù)，臨界參考值血清能出現(xiàn)，陰性血清無條帶出現(xiàn)的那個OD值，即為這批的應(yīng)用量。通過本試驗(yàn)得出 0D20 40較為符合要求。步驟3，樣品墊的制備將玻璃纖維膜按45mL/片，用緩沖液均勻?yàn)⑼坑诓ＡЮw維膜上，于37°C烘干后得樣品墊，樣品墊用鋁箔袋封裝，備用；該步驟可以用的緩沖液包括以下幾種(a) 0. 05M Borax、0. OlMPBS (ρΗ7· 0)、0· 1% Sodium CaseinU % PEG20000,2% BSA, 0. 05% NaN3 ；(b)0. 05M Borax、0. OlMPBS (ρΗ7· 0)、0· 1 % Sodium CaseinU % PEG20000.2 % Casein,0. 05% NaN3 ；(c)0. 05M Tris-cl (pH7. 0) ,0. 01MPBS.0. 1 % Sodium CaseinU % PEG20000.2 % Casein、?！?05% ·3。優(yōu)選的緩沖液是緩沖液(a)，因?yàn)樗哂袇^(qū)別陰陽性樣品的最大分辨率，NaN3起防腐作用。步驟4首先進(jìn)行原材料預(yù)裁剪樣品墊的裁切用裁切機(jī)將樣品墊切成與PVC制成的底板等長度即長^cm,寬 2. km，置干燥房間備用。吸水墊的裁切用裁紙機(jī)將吸水紙切成與PVC制成的底板等長度即長^cm,寬3cm 制成吸水墊，置干燥房間備用。結(jié)合墊的裁切用裁切機(jī)將結(jié)合墊切成與PVC制成的底板等長度即長^cm,寬 2. km，置干燥房間備用。硝酸纖維素包被膜的裁切用裁紙機(jī)將硝酸纖維素包被膜切成與PVC制成的底板等長度即長^cm,寬1cm，置干燥房備用。將硝酸纖維素包被膜3、結(jié)合墊2、樣本墊1、吸水墊6按圖1所示依次層疊在PVC 塑料制成的底板7上，組成大板。組裝車間溫度應(yīng)控制在25°C 37°C，濕度20% 30%。步驟5切條用切條機(jī)將大板切成單人份，每人份寬度按照一定要求切成2. 5mm 4mm的寬度，隨機(jī)抽檢，靈敏度能檢出室內(nèi)質(zhì)控樣品(即弱陽性樣本)，條帶顯色程度達(dá)到如圖2d， 且無非特異性條帶，則產(chǎn)品通過質(zhì)控規(guī)定成為合格產(chǎn)品。組裝、包裝將1人份已切好的試紙組裝在備好的試紙卡里，使加樣窗對應(yīng)試紙的樣品墊，結(jié)果顯示窗對應(yīng)檢測區(qū)和控制區(qū)，組裝車間溫度應(yīng)控制在25°C 37°C，濕度 20% 30%。再與干燥劑、說明書、樣品加樣器封裝在外包袋里，于4 25°C避光保存。在上述膠體金層析法抗Cenp-B抗體檢測試紙的制備過程中，各溶液的配置方法如下1.0. IM碳酸鉀的配制用超純水配制，0.22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期一個月。IOOOmL 0. IM K2CO3 溶液配方13. 8g K2CO3 ；超純水定容至 IOOOmL02. 10% BSA的配制用超純水配制，0. 05%疊氮鈉(NaN3)，0. 22 μ m膜濾過，置4°C 備用，有效期兩周。IOOOmL 10% BSA溶液配方IOOg BSA, 0. 5g NaN3 ；超純水定容至1000mL。3、包被緩沖液的配制:9g NaclU. 15g Na2HPO4^O. 23g NaH2PO4UOg Sucrose,0. 5g EDTA溶于IL超純水中，過濾置于4°C備用。4.洗滌液也即保存液的配制2% BSA,0. 05% (NaN3) >0. OlM pH7. 2PBS，0. 22 μ m 膜濾過，置 4°C備用，有效期兩周。IOOOmL 標(biāo)記洗滌保存液配方:20g BSA,0. 5g NaN3、0. 01MpH7. 2PBS 定容至 IOOOmL05.金標(biāo)稀釋液的配制IOOOmL稀釋液的配制2. 423g tris, IOg BSA, 0. 2g NaR溶于超純水中，調(diào)pH8. 0， 定容到1000mL。用稀釋液將金標(biāo)稀釋到工作濃度后，加入20% Sucrose和5%的海藻糖。實(shí)施例5該實(shí)施例的膠體金免疫層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實(shí)施例4相同，只是將該實(shí)施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體的制備，具體如下用pH9. 0 0. 2M硼酸緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ g SPA蛋白，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌 10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存
液將沉淀重懸，置4°C備用。該實(shí)施例步驟2中的葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實(shí)施例4的方法進(jìn)行。實(shí)施例6該實(shí)施例的膠體金免疫層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實(shí)施例4相同，只是將該實(shí)施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為鼠抗人IgG金標(biāo)抗體的制備，具體如下用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.0 8.0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min， 離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。該實(shí)施例步驟2中的鼠抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實(shí)施例4的方法進(jìn)行。實(shí)施例7該實(shí)施例的膠體金免疫層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實(shí)施例4相同，只是將該實(shí)施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體的制備，具體如下用pH9. 0 0. 2M硼酸緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ g鏈球菌G蛋白，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。該實(shí)施例步驟2中的鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實(shí)施例4的方法進(jìn)行。本實(shí)用新型將重組表達(dá)的核糖體PO抗原蛋白弓I入到膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，能實(shí)現(xiàn)血液樣本中的抗核糖體PO抗體的檢測，能快速、便捷地輔助診斷早期系統(tǒng)性紅斑狼瘡。實(shí)施例8樣本處理取全血1 5ml，自然凝集5分鐘后，3000 5000g/5min lOmin，取上清即得到待測樣品溶液，至少有100 μ 1以上待測樣品溶液。用微量加樣器吸取以上血清50 70 μ 1樣本于樣品墊，緩慢加樣。或者用吸管將血清樣本緩慢滴加3 5滴于樣品墊上，5 IOmin觀察結(jié)果，根據(jù)條帶出現(xiàn)情況來判讀陰陽性結(jié)果。實(shí)施例9試劑盒的檢測和臨床性能評估本實(shí)用新型的膠體金抗核糖體PO抗體檢測試紙的金標(biāo)抗體a的抗體A優(yōu)選為 SPA，抗體b的抗體B為兔IgG，抗體c的抗體為羊抗兔IgG，對其試紙進(jìn)行的臨床性能進(jìn)行以下評估。1.穩(wěn)定性試驗(yàn)1. 1 37 °C加速穩(wěn)定性將試紙置于37°C進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)，每天取出用室內(nèi)質(zhì)控品進(jìn)行測試，通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內(nèi)精密度來判斷試紙的穩(wěn)定性。4個月后結(jié)果顯示， 質(zhì)控品的檢測結(jié)果符合預(yù)期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。陰陽性參考品為 10份抗核糖體PO抗體陽性血清和10份抗核糖體PO抗體陰性血清。1.2 4°C穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將試紙置于4°C進(jìn)行常規(guī)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，每月取出用室內(nèi)質(zhì)控品測試，同樣通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內(nèi)精密度來判斷試紙的穩(wěn)定性。12個月后結(jié)果顯示，質(zhì)控品檢測結(jié)果符合預(yù)期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。18個月后結(jié)果顯示，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率仍為100%。M個月后檢測結(jié)果顯示，出現(xiàn)一例假陰性。綜合以上結(jié)果說明試紙?jiān)? 8°C貯存，2年內(nèi)是穩(wěn)定的。2.診斷靈敏度從臨床中收集到100份確診為原發(fā)性膽汁肝炎(SLE)病人的血清，用自制的膠體金試紙按照說明書上的操作步驟對上面收集到的SLE病人血清進(jìn)行檢測。5min后統(tǒng)計(jì)結(jié)果
如下
權(quán)利要求1.膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，包括有樣品墊(1)、結(jié)合墊O)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)，所述樣品墊(1)、結(jié)合墊O)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6) 由底板(7)的一側(cè)依次向所述底板(7)的另一側(cè)相互搭接粘貼在所述底板(7)上，其特征在于所述的結(jié)合墊( 包被有金標(biāo)抗體a層和金標(biāo)抗體b層；所述的硝酸纖維素包被膜(3)上設(shè)置有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，所述的檢測線(4)包被有核糖體PO抗原蛋白層，所述的質(zhì)控線( 包被有金標(biāo)抗體c層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，其特征在于所述金標(biāo)抗體a層中的抗體A為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌A蛋白 SPA、鏈球菌G蛋白ftOtein G中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，其特征在于所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種；所述的抗人IgG單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，其特征在于所述金標(biāo)抗體a中的抗體A為葡萄球菌A蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，其特征在于所述的金標(biāo)抗體b層中的抗體B和金標(biāo)抗體c層中的抗體C同時或不同時為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中金標(biāo)抗體b層中的抗體B和金標(biāo)抗體c層中的抗體C可發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，其特征在于所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，所述的單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金層析法抗核糖體PO抗體檢測試紙，其特征在于所述的檢測線上包被的核糖體PO抗原蛋白層為通過原核表達(dá)克隆化基因獲得的核糖體PO抗原蛋白層。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種膠體金層析法抗核糖體P0抗體檢測試紙，其包括有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側(cè)依次向所述底板的另一側(cè)粘貼在所述底板上，其結(jié)合墊包被有金標(biāo)抗體a層和金標(biāo)抗體b層；硝酸纖維素包被膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，檢測線包被有核糖體P0抗原蛋白層，質(zhì)控線包被有金標(biāo)抗體c層。本實(shí)用新型采用間接免疫測定法，引入核糖體P0抗原蛋白，對結(jié)合墊和樣品墊進(jìn)行了工藝優(yōu)化，來實(shí)現(xiàn)抗核糖體P0抗體的高靈敏度、高特異、高準(zhǔn)確性的檢測性能，為輔助診斷早期系統(tǒng)性紅斑狼瘡提供參考依據(jù)。
文檔編號G01N33/558GK202083693SQ201120031080
公開日2011年12月21日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者孫宏彬, 張玥, 葛文斌, 錢杰, 韓永俊, 高成秀 申請人:上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司