專利名稱:弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本實(shí)用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙
背景技術(shù):
弓形蟲病(toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxophasma gondii)感染所引起的人畜共患病。在人體多為隱性感染;發(fā)病者臨床表現(xiàn)復(fù)雜,其癥狀和體征又缺乏特異性,易造成誤診。孕婦受染后,病原可通過胎盤感染胎兒,直接影響胎兒發(fā)育,致畸嚴(yán)重,其危險性較未感染孕婦大10倍、影響優(yōu)生,成為人類先天性感染中最嚴(yán)重的疾病之一,已引起廣泛重視,世界上許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)將弓形蟲感染的檢查列為孕期常規(guī)檢查項(xiàng)目,在優(yōu)生優(yōu)育方面發(fā)揮著重要作用。目前對弓形蟲檢測的主要方法是弓形蟲特異性抗體檢測。檢測弓形蟲IgM判定是否為現(xiàn)癥感染,檢測IgG判定是否曾經(jīng)感染過。檢測兩種抗體有利于對被檢對象的進(jìn)行全面的判定,指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。目前弓形蟲抗體的檢測方法主要是ELISA等檢測方法。在膠體金的檢測方法中,有單獨(dú)檢測弓形蟲IgM或IgG的報道,但用膠體金類免疫層析技術(shù)同時檢測弓形蟲IgM和IgG抗體的檢測試紙尚未有相關(guān)報道。和用兩種試劑分別檢測IgM和IgG 抗體相比,同時檢測IgM和IgG抗體能減少檢測人員的工作量,節(jié)約成本;同時減少采血量, 減少患者的痛苦。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù),在抗體檢測方面已得到較為廣泛運(yùn)用, 基本原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體,在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對抗原或抗體,檢測時當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時,膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物,然后在NC膜上層析,再被包被抗原或抗體捕獲,形成肉眼可見的檢測T線, 通過檢測線的有無實(shí)現(xiàn)對結(jié)果的判定。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種弓形蟲IgM和IgG抗體檢測試紙,具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)用新型提供一種弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,塑料支撐板(8) —端粘貼上樣墊(1),上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記弓形蟲特異性的抗原P30或P22的膠體金墊O),膠體金墊( 一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3),硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線Tl (5)、檢測線T2 (6)和質(zhì)控C線,檢測線Tl (5)為抗人IgM抗體,檢測線T2 (6) 為抗人IgG抗體,質(zhì)控C線(7)為抗弓形蟲P30或P22抗體,硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。所述的弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,其特征在于所述的抗原為弓形蟲特異性的主要抗原P30或P22抗原,抗原可以利用基因工程重組表達(dá)或在培養(yǎng)蟲體中純化。[0008]所述的弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,其特征在于所述的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無紡布,吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。所述的弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,所述的抗原的包被方法為以0. OlM PH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗人IgM抗體配制成Ι-aiig/ml的溶液,以0. OlM pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBQ將抗人IgG抗體配制成l-2mg/ml的溶液,用噴膜儀在NC膜下部以1-1. 5ul/ cm的參數(shù)進(jìn)行劃線,包被Tl、T2線,同時在NC膜上部包被抗弓形蟲P30抗體作為C線,劃線后將NC膜在干燥間,溫度20-25°C,濕度小于30%,干燥2_5小時。所述的弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,所述的抗原標(biāo)記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30-50nm的膠體金溶液,制備完成后取IOOml 膠體金液放在燒杯內(nèi),用0. 2M K2CO3調(diào)至pH8. 0,按IOOml膠體金溶液加入0. 5-2mg弓形蟲 P30和(或)P22抗原,室溫?cái)嚢?小時,加入牛血清白蛋白BSA,聚乙二醇PEG20000 封閉20min,12000r/m離心30分鐘,棄上清,用膠體金工作液復(fù)溶至100ml,按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上,再置干燥間,溫度20-25°C,濕度小于 30 %,干燥2-5小時,制成膠體金墊。所述的弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,所述的試紙的裝配方法為在干燥室內(nèi),溫度20-25°C,濕度小于40%,取塑料支撐板板,將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼,在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/ 粘貼,在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊,搭膠體金墊的1/5 ;在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊,搭吸樣墊的1/10 ;最后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成2-5mm寬的試紙條,切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi),形成檢測卡。所述的弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,檢測方法為將被檢血清或血漿平衡至溫室,將試紙條或試劑卡平放,在上樣墊上加入5-20ul被檢樣品,再加入50-100ul的樣品稀釋液,使膠體金溶解并在NC膜上層析,然后用肉眼直接觀察在15分鐘內(nèi)C、T1、T2線的出現(xiàn)情況,并判定檢測結(jié)果。本實(shí)用新型的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術(shù)檢測弓形蟲IgM和 IgG抗體的新型試紙。采用膠體金標(biāo)記弓形蟲特異性抗原,包被抗人IgM和IgG抗體實(shí)現(xiàn)對血液中抗弓形蟲抗體的檢測,一次檢測獲得兩種檢測指標(biāo),節(jié)約時間和成本,減輕患者的痛苦。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
圖1是弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙結(jié)構(gòu)示意圖。附圖符號說明1 上樣墊;2 膠體金墊;3 =NC膜;4 吸樣墊5 檢測線Tl ;6 檢測線T2 ;7 質(zhì)控C線;8 塑料支撐板
具體實(shí)施方式
實(shí)施例制備弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙1主要材料1. 1弓形蟲特異性P30抗原、P30抗體香港先進(jìn)技術(shù)工業(yè)有限公司產(chǎn)品,為重
4組抗原,P30抗原用于膠體金標(biāo)記,P30抗體用于NC膜質(zhì)控線包被;鼠抗人IgM和IgG抗體Arista公司產(chǎn)品,用于NC膜包被;氯金酸Sigma公司產(chǎn)品;硝酸纖維素(NC)膜 Millipore公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白(BSA),聚乙二醇PEG20000,水解酪蛋白=Sigma產(chǎn)品。 其它常用試劑均為分析純試劑。1. 2臨床血清由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得,其中弓形蟲IgG抗體陽性樣本60份,IgM抗體陽性樣本10份,其中包括兩種抗體均陽性樣本5份。兩種抗體全為陰性正常人樣本50 份。1. 3弓形蟲IgM抗體檢測試劑盒(ELISA法),弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(ELISA 法)國內(nèi)已注冊的商用產(chǎn)品。2 方法2. 1弓形蟲P30重組抗原的膠體金標(biāo)記氯金酸一檸檬酸三鈉還原法制備直徑為 40nm的膠體金溶液,制備完成后取三份膠體金,分別用0. 2MK2C03將溶液調(diào)到pH7. 0、pH8. 0 和pH9. 0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌,按每IOOml溶液加入0. 5mg、lmg、l. 5mg 將重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中,繼續(xù)攪拌2小時,再滴加入到終濃度為0. 1% 的PEG2000和1 %的BSA進(jìn)行封閉20min,標(biāo)記結(jié)束后以12000r/m離心,棄上清,沉淀按原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液硼酸鹽緩沖液,PH8. 0,含BSA、羊血清,蔗糖和表面活性劑中。然后將標(biāo)記膠體金溶液按Iml溶液鋪22cm2的比例加樣于無紡布上,在溫度20-25°C, 相對濕度在< 30%的干燥間干燥2-4小時,制成膠體金墊。2. 2NC膜包被用 0. OlM pH7. 2PBS將鼠抗人 IgM分別稀釋成0. 5mg/mlUmg/ml,2mg/ ml,鼠抗人IgG分別稀釋成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml,然后用噴膜儀在NC膜下部按lul/cm 進(jìn)行分別劃線包被,同時在NC膜上部包被抗P30抗體,用于產(chǎn)品的質(zhì)控,包被完成后將NC 膜在在溫度20-25°C,相對濕度在< 30%的干燥間干燥2-5小時。2. 3弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙的組裝在干燥室內(nèi)(溫度20_25°C,相對濕度< 30% )取塑料支撐板,將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼,在NC膜T 線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/ 粘貼,在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5);在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10);然后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi),形成弓形蟲IgM和 IgG抗體聯(lián)合檢測試劑卡。2. 4檢測方法將被檢血清或血漿平衡至溫室,將制備好的試紙條或試劑卡平放,在上樣墊上加入IOul被檢樣品,若樣品中含抗弓形蟲IgM或IgG抗體,則和樣品墊上的標(biāo)記 P30抗原的膠體金結(jié)合,形成復(fù)合物,并擴(kuò)散到NC膜上進(jìn)一步層析,當(dāng)遇到包被在NC膜上 Tl線處的鼠抗人IgM時,復(fù)合物則又和包被抗IgM抗體結(jié)合,被捕獲在包被處;當(dāng)遇到包被在NC膜上T2線處IgG時,復(fù)合物則又和包被抗體結(jié)合,被捕獲在包被線T2處;當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達(dá)到一定數(shù)量時,則形成一條肉眼可見的Tl或T2線;若血清中不含特異性抗體,則不能形成免疫復(fù)合物,亦不能形成T線,C線作為試劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在5、10、15、20、和30分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況,并判定檢測結(jié)果。2. 5試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標(biāo)記、包被的試劑進(jìn)行組合配對,制備小樣,利用質(zhì)控血清對試劑進(jìn)行測試,發(fā)現(xiàn)最佳組合。[0029]2. 6臨床血清檢測用本試劑按檢測方法對所有臨床血清進(jìn)行檢測,同時用商用檢測ELISA試劑進(jìn)行對照檢測。3 結(jié)果3. 1試紙參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測結(jié)果,確定了試紙的最佳標(biāo)記pH值為8. 0 ;重組抗原的最佳標(biāo)記量為lmg/100ml膠體金溶液;最佳的膠體金工作液為IOmM硼酸酸鹽緩沖液,pH8. 0,含0. 5% 85八、10%羊血清,2%蔗糖,0. 2% Tween 20 ;最佳包被鼠抗人IgM和IgG 包被濃度均為lmg/ml。檢測結(jié)果的最佳判定時間為5-15分鐘。但以上參數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品時可能需要適當(dāng)調(diào)整。3. 2臨床血清檢測以ELISA試劑為對照,對IgG抗體進(jìn)行檢測,本試劑IgG檢測出陽性57份,ELISA檢測出IgG陽性60份,靈敏度=57/60 = 95.0% ;本試劑對IgG陰性樣本檢測均為陰性,相對特異性100%。P > 0. 05。以ELISA試劑為對照,對IgM抗體進(jìn)行檢測,本試劑IgM檢測出陽性9份,ELISA檢測出IgM陽性10份,靈敏度=9/10 = 90.0%;本試劑對IgM陰性樣本檢測均為陰性,相對特異性100%。P > 0. 05。IgM和IgG同時為陽性的樣本本試劑檢測和ELISA試劑完全一致。臨床檢測表明本試劑的性能和ELISA試劑相比無顯著性差異,適合用于臨床檢測。
權(quán)利要求1.一種弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,其特征在于塑料支撐板⑶一端粘貼上樣墊(1),上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記弓形蟲特異性的抗原P30或P22的膠體金墊 O),膠體金墊( 一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3),硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線Tl (5)、檢測線T2 (6)和質(zhì)控C線,檢測線Tl (5)為抗人IgM抗體,檢測線T2 (6)為抗人IgG抗體,質(zhì)控C線(7)為抗弓形蟲P30或P22抗體,硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊 (4)形成試紙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,其特征在于所述的抗原為弓形蟲特異性的主要抗原P30或P22抗原,抗原可以利用基因工程重組表達(dá)或在培養(yǎng)蟲體中純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙,其特征在于所述的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無紡布,吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種弓形蟲IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測試紙。特征在于塑料支撐板(8)一端粘貼上樣墊(1),上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記弓形蟲特異性的抗原P30或P22的膠體金墊(2),膠體金墊(2)一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3),硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線T1(5)、檢測線T2(6)和質(zhì)控C線,檢測線T1(5)為抗人IgM抗體,檢測線T2(6)為抗人IgG抗體,質(zhì)控C線(7)為抗弓形蟲P30或P22抗體。檢測時將樣品加在上樣墊上,15分鐘內(nèi)肉眼直接觀察,判定檢測結(jié)果。具有操作簡便、快速、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/558GK202256343SQ201120186120
公開日2012年5月30日 申請日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司