專利名稱：弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種弓形蟲IgG抗體檢測(cè)免疫印跡試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
弓形蟲病(Toxoplasmosis)是剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，其病原體弓形蟲可寄生在人及多種動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)，人群及動(dòng)物普遍易感。該病廣泛分布于世界各地，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有10億人被弓形蟲感染([1]奚琳琳，李威.弓形蟲致病機(jī)理，毒力及基因型研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2009,4(11) :859-861.)。弓形蟲病在我國(guó)分布很廣泛，全國(guó)各省、市、自治區(qū)均有弓形蟲感染的報(bào)道，我國(guó)正常人群平均感染率在4% 9%左右([2]劉敏，陳曉光.中國(guó)人群弓形蟲病的流行特征分析[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào)，2010，17(3) :131-134.),特殊人群如腫瘤患者、精神病患者、先天缺陷嬰幼兒、免疫抑制、免疫缺陷患者感染率更高。所幸的是極大多數(shù)免疫功能正常的成人或兒童被弓形蟲感染后常無(wú)癥狀或僅有輕微癥狀，且多能自愈并獲永久免疫力。但先天感染的胎兒、兒童以及免疫缺陷者被感染后，則預(yù)后極為嚴(yán)重。是造成艾滋病患者死亡的一個(gè)重要并發(fā)病。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者約有20% 80% 合并弓形蟲感染，更重要的是它也是造成人類先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早產(chǎn)的重要病原體之一。弓形蟲病的的診斷方法包括直接從臟器、血液、腦脊液等組織分離弓形蟲進(jìn)行病原學(xué)診斷，需要幾天甚至幾周時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在實(shí)際應(yīng)用中價(jià)值不大。臨床上常規(guī)檢測(cè)主要是應(yīng)用各種血清學(xué)方法，檢測(cè)其特異IgG和IgM ([3]周彬，張玨，王柯，等.弓形蟲IgG和 IgM抗體雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析的建立及其初步臨床應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2010,33(010) :957-959.),血清學(xué)方法可以診斷先天性、急性和慢性弓形蟲病，但由于大多數(shù)免疫缺陷的人或動(dòng)物其抗弓形蟲的IgG滴度不會(huì)上升或不會(huì)出現(xiàn)高的IgM滴度，所以不能有效地用血清學(xué)方法對(duì)患有免疫缺陷的人或動(dòng)物診斷弓形蟲病。另外，在抗原消失相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間后血清抗體滴度才會(huì)逐步下降，所以也不能應(yīng)用于治療效果評(píng)價(jià)。目前檢測(cè)IgG抗體存在較高的假陽(yáng)性，而IgM抗體檢測(cè)普遍靈敏度差等問(wèn)題([4]韓靖云，劉倩，郭健.弓形蟲感染實(shí)驗(yàn)室診斷的技術(shù)進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，M(5) :393-395).因此，對(duì)疾病的早期診斷幫助不大，急需建立一種具有高度敏感性，且價(jià)廉、快速、操作簡(jiǎn)單、不需特殊設(shè)備，更適合于臨床的早期診斷方法。弓形蟲病的診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試驗(yàn)，正常人體感染弓形蟲多為隱性感染，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，蟲體大量繁殖，侵入除紅細(xì)胞外的各組織細(xì)胞內(nèi)寄生，造成各種組織的廣泛炎癥，從而出現(xiàn)臨床癥狀。人類感染弓形蟲后能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。感染早期IgM抗體增高，IgM在感染4個(gè)月后逐漸消失，在感染1個(gè)月后出現(xiàn)高濃度 IgG 抗體([5]KASPER D C, PRUSA A R, HAYDE Μ, et al. Evaluation of the vitros eciq immunodiagnostic system for detection of anti-toxoplasma immunoglobulin g
3and immunoglobulin m antibodies for confirmatory testing for acute toxoplasma gondii infection in pregnant women[J]. Journal of clinical microbiology,2009, 47(1) :164-168)。因此，弓形蟲IgG抗體是弓形蟲病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的一項(xiàng)重要指標(biāo)。早期的血清學(xué)方法使用弓形蟲循環(huán)抗原。研究和診斷用的弓形蟲循環(huán)抗原是以弓形蟲感染小鼠腹腔獲得，這種方法花費(fèi)大、獲得的抗原量少且不純(?；煊兴拗鞯鞍?， 因此假陽(yáng)性也時(shí)有發(fā)生。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及及弓形蟲抗原的相繼克隆，將重組抗原應(yīng)用于弓形蟲實(shí)驗(yàn)已經(jīng)越來(lái)越多。目前研究比較多的弓形蟲的表面抗原(SAG1(P30)、 SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、蟲體棒狀體抗原(R0P1、R0P2)、致密顆粒蛋白(GRA1、 GRA7)等([6]熊美華，王秀珍，劉露霞，等.弓形蟲速殖子抗原的提取及蛋白分析[J].中國(guó)寄生蟲病防治雜志，2001，14(3) :237-238.)。采用重組DNA技術(shù)制備的重組抗原可以克服完整弓形蟲抗原的缺點(diǎn)，能快速、經(jīng)濟(jì)地制備無(wú)限量特異重組弓形蟲抗原?，F(xiàn)有的弓形蟲抗體檢測(cè)方法包括ELISA、WeStern-bl0t等，其特異性均較高。采用 Western-blot方法制成的試劑盒，一般常規(guī)實(shí)驗(yàn)室均可完成，不需要特殊設(shè)備，判讀也簡(jiǎn)單明了。現(xiàn)市售的Western-blot試劑均為進(jìn)口試劑，價(jià)格昂貴。面對(duì)嚴(yán)峻的防制形式，不但需要特異準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，還需要一種更經(jīng)濟(jì)實(shí)用的試劑來(lái)篩查，以便為臨床和疾病防控提供對(duì)策。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒及其制備方法。所述弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒設(shè)有載體板、硝酸纖維膜、弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線；所述弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG 抗體檢測(cè)線處包被弓形蟲重組抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人、鏈抗體。所述弓形蟲重組抗原為SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7重組抗原。所述載體板可采用PVC板。所述弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得弓形蟲重組抗原；2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜IgG檢測(cè)線上包被弓形蟲重組抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體， 晾干；3)制備抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；4)抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記采用過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記；5)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上，在弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線處包被弓形蟲重組抗原，在對(duì)照線處包被包被人IgG 抗體，用切條機(jī)切成條狀，與酶標(biāo)記的抗人Y鏈單克隆抗體及其底物共同組裝成弓形蟲 IgG抗體免疫印跡試劑盒。在步驟1)、2)、5)中，所述弓形蟲重組抗原為 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7等。在步驟2)中，所述弓形蟲重組抗原和人IgG抗體的濃度可為l ^ig/mL;點(diǎn)樣量可為 1 μ L/cm。在步驟3)中，采用ELISA的方法鑒定McAb效價(jià)在1 IO7以上。在步驟4)中，所述辣根過(guò)氧化物酶的底物由0. 03% (W/V)的過(guò)氧化氫和0. 07% (W/V)的二氨基聯(lián)苯胺組成。本發(fā)明提供了一種采用免疫印跡技術(shù)建立弓形蟲IgG抗體檢測(cè)試劑條，可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標(biāo)本中弓形蟲IgG抗體的檢測(cè)。該檢測(cè)方法所需的標(biāo)本量極小， 不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測(cè)簡(jiǎn)便快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。


圖1為本發(fā)明所述弓形蟲IgM抗體免疫印跡試劑盒中膜條實(shí)施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。圖2為實(shí)驗(yàn)結(jié)果模式示意圖。在圖2中，H為使用前的示意圖，G為無(wú)效試驗(yàn)(產(chǎn)品質(zhì)量問(wèn)題)，F(xiàn)為陰性結(jié)果，A E為弓形蟲IgG陽(yáng)性結(jié)果；2為弓形蟲SAGl (P30)-IgG抗體檢測(cè)線，3為弓形蟲SAG2 (P22) -IgG抗體檢測(cè)線，4為弓形蟲R0P2_IgG抗體檢測(cè)線，5為弓形蟲GRA7-IgG抗體檢測(cè)線，6為對(duì)照線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。參見(jiàn)圖1，本發(fā)明所述弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒實(shí)施例設(shè)有載體板1、弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線2 5，對(duì)照線6和硝酸纖維膜(NC膜)7。硝酸纖維膜7粘貼在載體板1上表面，弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線2 5和對(duì)照線6依次設(shè)在硝酸纖維膜7上；在弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線處分別包被弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2和GRA7，在對(duì)照線6處包被人IgG抗體。所述載體板采用PVC板。所述弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)制備 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 弓形蟲重組抗原采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼弓形蟲螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7。2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜IgG檢測(cè)線上包被SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7弓形蟲重組抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，晾干。3)制備抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體
以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用ELISA的方法鑒定McAb效價(jià)在1 IO7 以上。4)抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記采用過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記。5)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線處包被弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2(P22)、R0P2 和GRA7，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，和酶標(biāo)記的抗人γ鏈單克隆抗體及其底物共同組裝成弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒。以下給出采用弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒檢測(cè)患者的臨床標(biāo)本1)標(biāo)本采用0. Olmol/LPBS緩沖液進(jìn)行1 50稀釋。2)封閉采用5%脫脂奶粉(0. 01mol/L PBST緩沖液配制)作為封閉液，于室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內(nèi)，并編號(hào)。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。5)加酶結(jié)合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結(jié)合物(采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體為檢測(cè)抗體)，于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。6)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，于室溫(18 25V )在搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結(jié)果判斷將檢測(cè)膜條放置在結(jié)果判定模板中，風(fēng)干后判斷結(jié)果。任何蛋白靶標(biāo)出現(xiàn)的特異性條帶，均可判斷為陽(yáng)性，可輔助診斷弓形蟲病(見(jiàn)圖2)。以下給出弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒的性能檢定1)外觀檢查試劑盒無(wú)破損，包被反應(yīng)膜平整、干凈無(wú)污染斑點(diǎn)、無(wú)裂縫，膠帶無(wú)開膠，無(wú)切斜現(xiàn)象。2)陽(yáng)性標(biāo)本符合率用弓形蟲IgG陽(yáng)性的不同滴度的陽(yáng)性參比血清各50份采用弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒檢定，計(jì)算陽(yáng)性符合率。陽(yáng)性參比血清的確定采用 ELISA(進(jìn)口試劑)法確定的臨床標(biāo)本。3)陰性標(biāo)本符合率用50份陰性參比血清檢定，計(jì)算陰性性符合率。陰性參比血清的確定采用ELISA(進(jìn)口試劑)法確定的臨床標(biāo)本。4)批內(nèi)差異同一批次弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，用特征性血清檢測(cè)，要求陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，用特征性血清檢測(cè)，要求陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié)果陰性。6)干擾試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不受標(biāo)本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。7)交叉反應(yīng)采用本弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡(n = 30)、類風(fēng)濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的血清檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。8)穩(wěn)定性檢測(cè)應(yīng)用Arrhenius法則，將弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒放置 370C 20天后檢測(cè)，以上各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為 18個(gè)月。以下給出具體實(shí)施例。實(shí)施例1將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線處包被弓形蟲重組抗原SAGl (Ρ30)、SAG2(P22)、R0P2 和GRA7，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，和酶標(biāo)記的抗人γ鏈單克隆抗體及其底物共同組裝成弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒。1)標(biāo)本采用0. Olmol/LPBS緩沖液進(jìn)行1 50稀釋。2)封閉采用5%脫脂奶粉(0. 01mol/L PBST緩沖液配制)作為封閉液，于室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內(nèi)，并編號(hào)。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。5)加酶結(jié)合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結(jié)合物(采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體為檢測(cè)抗體)，于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。6)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，于室溫(18 25V )在搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結(jié)果判斷將檢測(cè)膜條放置在結(jié)果判定模板中，風(fēng)干后判斷結(jié)果。任何蛋白靶標(biāo)出現(xiàn)的特異性條帶，均可判斷為陽(yáng)性，可輔助診斷弓形蟲病(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例2與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測(cè)線僅由SAG2 (P22)、R0P2和GRA7弓形蟲重組抗原組成，不含有SAGl (P30)弓形蟲重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測(cè)線僅由SAGl (P30)、R0P2和GRA7弓形蟲重組抗原組成，不含有SAG2(P22)弓形蟲重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4
與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測(cè)線僅由SAG1(P30)、SAG2(P22)和 GRA7重組抗原組成，不含有R0P2重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測(cè)線僅由SAG1(P30)、SAG2(P22)和 R0P2弓形蟲重組抗原組成，不含有GRA7弓形蟲重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例6與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于待檢標(biāo)本為腦脊液標(biāo)本，結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例7性能驗(yàn)證試驗(yàn)按實(shí)施例1方案制備弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，再進(jìn)行性能驗(yàn)證。1)外觀檢查試劑盒無(wú)破損，包被反應(yīng)膜平整、干凈無(wú)污染斑點(diǎn)、無(wú)裂縫，膠帶無(wú)開膠，無(wú)切斜現(xiàn)象。2)陽(yáng)性標(biāo)本符合率用弓形蟲IgG陽(yáng)性的不同滴度的陽(yáng)性參比標(biāo)本各50份采用弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒檢定，計(jì)算陽(yáng)性符合率。陽(yáng)性參比標(biāo)本的確定采用 ELISA(進(jìn)品試劑)法確定的臨床標(biāo)本。3)陰性標(biāo)本符合率用50份陰性參比標(biāo)本檢定，計(jì)算陰性符合率。陰性參比標(biāo)本的確定采用ELISA(進(jìn)品試劑)法確定的臨床標(biāo)本。4)批內(nèi)差異同一批次弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，用特征性標(biāo)本檢測(cè)，要求陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性標(biāo)本檢測(cè)的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，用特征性標(biāo)本檢測(cè)，要求陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性標(biāo)本檢測(cè)的結(jié)果陰性。6)交叉反應(yīng)采用本弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，進(jìn)行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(n = 30)、類風(fēng)濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。7)穩(wěn)定性檢測(cè)應(yīng)用Arrhenius法則，將弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒放置 370C 20天后檢測(cè)，以上各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為 18個(gè)月。
權(quán)利要求
1.弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于設(shè)有載體板、硝酸纖維膜、弓形蟲IgG 抗體檢測(cè)線、對(duì)照線，弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲 IgG抗體檢測(cè)線處包被弓形蟲重組抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人Y鏈抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于所述弓形蟲重組抗原為 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7。
3.如權(quán)利要求1所述的弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于所述載體板采用 PVC 板。
4.如權(quán)利要求1所述的弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼弓形蟲螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得弓形蟲重組抗原；2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜IgG檢測(cè)線上包被弓形蟲重組抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，晾干；3)制備抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體以人IgG特異性片段Y鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；4)抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記采用過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記；5)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上，在弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線處包被弓形蟲重組抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，與酶標(biāo)記的抗人Y鏈單克隆抗體及其底物共同組裝成弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述弓形蟲重組抗原為SAG1(P30)、SAG2(P2》、R0P2、GRA7。
6.如權(quán)利要求4所述的弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述弓形蟲重組抗原和人IgG抗體的濃度為1 ％ig/mL ；點(diǎn)樣量為1 μ L/cm。
7.如權(quán)利要求4所述的弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟3)中，采用ELISA的方法鑒定McAb效價(jià)在1 IO7以上。
8.如權(quán)利要求4所述的弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述辣根過(guò)氧化物酶的底物按質(zhì)量/體積百分比由0. 03%的過(guò)氧化氫和0. 07% 的二氨基聯(lián)苯胺組成。
全文摘要
弓形蟲IgG抗體免疫印跡試劑盒及其制備方法，涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)有載體板、硝酸纖維膜、弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線；所述弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測(cè)線處包被弓形蟲重組抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人γ鏈抗體。制備弓形蟲重組抗原；硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣；制備抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體；抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記；制備免疫印跡試劑盒。檢測(cè)時(shí)，所需的標(biāo)本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測(cè)簡(jiǎn)便快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。
文檔編號(hào)G01N33/535GK102288768SQ20111027805
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者張惠姍, 張長(zhǎng)弓, 李淑蓮, 林志鋒, 林惠玲, 王容美 申請(qǐng)人:廈門市湖里區(qū)婦幼保健院