專利名稱：：一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫體外診斷試劑領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：弓形蟲(Toxoplasmagondii)是貓科動物的腸道球蟲，由法國學(xué)者Nicolle及Manceaux在剛地橋J止鼠(Ctenodactylusgondii)的脾臟單核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，蟲體呈弓形，故命名為剛地弓形蟲。弓形蟲病(toxoplasmosis)又稱弓形體病，是由弓形蟲所引起的一種人畜共患寄生蟲病。據(jù)文獻(xiàn)報道，弓形蟲可感染多種哺乳動物，家畜感染率可達(dá)10-50%。全球約有10億人感染了弓形蟲，我國人群平均感染率為5.16%。弓形蟲是孕婦宮內(nèi)感染導(dǎo)致胚胎畸形的五大病原體之一，先天性弓形蟲病患者可導(dǎo)致智力發(fā)育障礙、神經(jīng)系統(tǒng)病變?nèi)缒X癱、癲癇、腦膜炎、弱智等癥狀。我國每年約有9萬名新生兒受弓形蟲病損害，年均耗資上億元，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，同時也嚴(yán)重地影響了我國的人口素質(zhì)。當(dāng)機(jī)體遭受弓形蟲感染時，體內(nèi)會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體(免疫球蛋白，Ig)，來抵抗病原體，以保護(hù)機(jī)體功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。一般規(guī)律是先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。IgM抗體滴度在達(dá)到高峰后很快開始逐漸下降至較低水平，下降后一般不易檢出，而IgG抗體達(dá)到高峰后則基本穩(wěn)定在一個較高的滴度且持續(xù)較長時間。臨床上檢查出弓形蟲IgG抗體說明曾經(jīng)感染過，而且有一定的免疫水平。弓形蟲的病原學(xué)診斷方法具有確診意義，但存在操作較困難、靈敏度低等缺點(diǎn)。因而，血清學(xué)試驗是目前廣泛應(yīng)用的重要輔助診斷手段。常用的血清學(xué)診斷方法主要包括染色試驗(Sabin-FeldmanDT)、間接血凝試驗(IHA)、放射免疫分析(RIA)以及酶聯(lián)免疫分析(EIA)等。染色試驗存在需要活蟲操作的缺點(diǎn)。間接血凝試驗雖然與染色試驗符合率高但重復(fù)性差、致敏紅細(xì)胞不穩(wěn)定。放射免疫分析雖然高靈敏、高特異，但存在有效期短、具有放射性污染的缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫分析雖然有效期長、特異性強(qiáng)，但存在底物大部分有毒或為致癌物質(zhì)等缺點(diǎn)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)是近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析，是繼放射免疫分析和酶免疫分析之后發(fā)展起來的一種超高靈敏度的微量測定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析將抗原與抗體的高特異性免疫反應(yīng)與高靈敏的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相結(jié)合，具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速、無污染、儀器簡單經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。它是放射性免疫分析與普通酶免疫分析理想的取代者，是目前最理想的免疫分析方法。采用酶促增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析原理為樣品中的待測物、酶標(biāo)記物和固相載體上的包被物特異性結(jié)合形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物，催化發(fā)光底物反應(yīng)，利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體發(fā)光，從而檢測樣品中待測物。化學(xué)發(fā)光底物液通常由A、B溶液組成。A溶液含有化學(xué)發(fā)光劑及增強(qiáng)劑，并加入緩沖溶液配制而成。B溶液由氧化劑和緩沖溶液配制而成。在使用前兩者混合，加入到待測溶液中進(jìn)行反應(yīng)。異硫氰酸熒光素(FITC)是一種很穩(wěn)定的熒光素，極易結(jié)合在蛋白分子上，不僅標(biāo)記簡單，而且標(biāo)記物十分穩(wěn)定。FITC作為半抗原結(jié)合到蛋白質(zhì)載體上具有很強(qiáng)的免疫原性，F(xiàn)ITC單克隆抗體與標(biāo)記在蛋白質(zhì)上的FITC反應(yīng)，不僅特異性高，而且親和力也高于抗原抗體的結(jié)合?！睹庖邔W(xué)雜志》2003年，19(3)期，230-234頁《FITC標(biāo)記單克隆抗體檢測icIL-lra的方法研究》公開了通過FITC標(biāo)記抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記FITC將其應(yīng)用于ELISA檢測icIL-lra的方法，使用此方法能有效地放大抗原抗體反應(yīng)敏感性，在免疫分析中有很大應(yīng)價值。其中，F(xiàn)ITC標(biāo)記單克隆抗體的方法為將純化的抗IL-lra單克隆抗體在50mmol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液透析后，加入DMSO溶解的FITC,4。C反應(yīng)16小時后經(jīng)Sephadex-G50純化后，分裝、避光保存。改良的過碘酸鈉法是制備辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的通用技術(shù)，即為在低pH下以Nal04先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與抗體上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70%的HRP和抗體結(jié)合，99%的抗體與酶結(jié)合，酶與抗體的活性無重大損失，是目前最常用的方法。抗原、抗體反應(yīng)要求在最適比例條件下進(jìn)行，其工作濃度不同對結(jié)果影響較大，因此必須對包被抗原或抗體和標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行最佳工作濃度的滴定和選擇，通常采用棋盤滴定法(也稱方陣實(shí)驗或方陣滴定法)選擇最佳抗原或抗體的工作濃度，即為制備抗原或抗體系列梯度稀釋的包被板，按列分別加入用稀釋的強(qiáng)陽性、弱陽性、陰性參考血清及稀釋液，溫育、洗滌后加入系列梯度稀釋的標(biāo)記抗體或抗原，溫育、洗滌檢測結(jié)果，選擇P/N最大的抗原或抗體稀釋度為最佳工作濃度。微孔板的固相包被一4殳采用物理吸附法，而磁性顆粒固相包被則通常采用縮合劑EDC(碳二亞胺)共價偶聯(lián)法，即為通過縮合劑EDC將待包被的抗體氨基或羧基與磁性顆粒上活化的功能團(tuán)羧基或氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成共價偶聯(lián)物。
發(fā)明內(nèi)容為了解決目前臨床上病原學(xué)試驗操作不方便、靈敏度低，放免試劑有效期短、放射性廢棄物污染危害以及酶免試劑受多種因素干擾、底物大部分有毒等不足，本發(fā)明提供了一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒。本發(fā)明的試劑盒由陰性、陽性對照品，固相載體，弓形蟲抗原標(biāo)記物，酶結(jié)合物，化學(xué)發(fā)光底物液A、B,以及濃縮洗滌液組成，其中，所述的固相載體為包被FITC抗體的微孔板或f茲性顆粒，弓形蟲抗原標(biāo)記物為FITC標(biāo)記的弓形蟲抗原，酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-人IgG單克隆抗體。所述的化學(xué)發(fā)光底物液A含有1~20mmol/L魯米諾、0.1~0.5mmol/L4-鞋基聯(lián)苯、0.01~0.1mmol/L4-碘代苯基硼酸、50500mmol/LpH8.0~10.0硼酸緩沖溶液。所述的化學(xué)發(fā)光底物液B含有1~5mmol/L過氧化脲、0.05~0.5%(體積)吐溫20、10-50mmol/LpH7.0~7.6磷酸鹽緩沖溶液。所述的濃縮洗滌液含有12~20%(重量)NaCl、0.1~0.7%(重量)KC1、0.05~0.2%(體積)吐溫20、50~500mmol/LpH7.2~7.6Tris畫HCl緩沖液，使用時用蒸餾水20倍稀釋。使用本發(fā)明的試劑盒檢測弓形蟲IgG抗體，操作簡便，靈敏度高，特異性好，與病原學(xué)檢驗結(jié)果符合度極高。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選方案為所述的化學(xué)發(fā)光底物液A含有10mmol/L魯米諾、0.3mmol/L4-羥基聯(lián)苯、0.05mmol/L4-碘代苯基硼酸、200mmol/LpH8.0~10.0硼酸緩沖液。所述的化學(xué)發(fā)光底物液B含有3.5mmol/L過氧化脲、0.1%(體積)吐溫20、20mmol/LpH7.0~7.6磷酸鹽緩沖液。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選方案為所述的濃縮洗滌液含有16%(重量)NaCl、0.4%(重量)KC1、0.1°/。(體積)吐溫20、200mmol/LpH7.4Tris-HCl緩沖液，使用時用蒸餾水20倍稀釋。本發(fā)明還提供了一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備方法，包括以下步驟A、包被固相載體的制備用含0.54)Lig/mLFITC抗體20mmol/LpH7.27.4磷酸鹽緩沖液包被固相載體，2~8°C包被18~20小時后，用含20%(體積)小牛血清、5%(重量)蔗糖的20mmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液封閉18~20小時，棄盡封閉液后抽濕，28。C干燥18~20小時，加入干燥劑密封；B、FITC標(biāo)記弓形蟲抗原的制備將用50mmol/LpH9.6碳酸緩沖液透析的弓形蟲抗原加入DMSO溶解的FITC，反應(yīng)終止后純化、分裝、低溫避光保存；采用棋盤滴定法選擇最佳的FITC標(biāo)記抗原工作濃度，并溶解于1%(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液中以制備FITC標(biāo)記的弓形蟲抗原工作溶液；C、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗-人IgG單克隆抗體溶液的制備采用改良過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶標(biāo)記抗-人IgG單克隆抗體，采用棋盤滴定法選擇最佳的酶標(biāo)抗體工作濃度，并溶解于1%(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液中以制備酶標(biāo)抗體工作溶液；D、發(fā)光底物液的制備化學(xué)發(fā)光底物液A含有:魯米諾4-羥基聯(lián)苯4-硪代苯基硼酸硼酸緩沖液化學(xué)發(fā)光底物液B含有:過氧化脲1~20mmol/L0.1~0.5mmol/L0.01~0.1mmol/L50500mmol/LpH8.0~10.0;l'~5mmol/L12~20%(重量)0.1~0,7%(重量)0.05~0.2%(體積)50~500mol/LpH7.2~7.60.05~0.5%(體積)1050mmol/LpH7.0~7.6;吐溫20磷酸鹽緩沖溶液E、濃縮洗滌液的制備濃縮洗滌液含有NaClKC1吐溫20Tris-HC1緩沖液使用時用蒸餾水20倍稀釋；F、陰性、陽性對照品的制備收集弓形蟲IgG抗體、HBsAg、HIV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體為陰性的正常人血清過濾除菌、分裝、低溫儲存。收集弓形蟲IgG抗體陽性，HBsAg、fflV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體為陰性的患者血清過濾除菌、分裝、低溫儲存。該方法便于生產(chǎn)，易于監(jiān)控生產(chǎn)過程，保證了批次間的穩(wěn)定性。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟A、包被固相載體還可以采用以下方法制備以磁性顆粒作為固相載體，以EDC共價偶聯(lián)法將FITC抗體偶聯(lián)到磁性顆粒表面。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選方案為，所述的化學(xué)發(fā)光底物液A含有魯米諾4-羥基聯(lián)苯4-碘代苯基硼酸硼酸緩沖溶液所述的化學(xué)發(fā)光底物液B含有:過氧化脲1Ommol/L0.3mmol/L0.05mmol/L200mmol/L3.5mmol/LpH8.0~10.0;吐溫200.1%(體積)磷酸鹽緩沖溶液20mmol/LpH7.0-7.6;在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選方案為，所述的濃縮洗滌液含有:NaClKC1吐溫20Tris-HCl緩沖液使用時用蒸餾水20倍稀釋。16%(重量)0.4%(重量)0.1°/。(體積)200mmol/LpH7.2~7.具體實(shí)施例方式以下所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備A、包被板制備用含2|ug/mLFITC抗體的20mmol/LpH7.4磷酸緩沖液溶液，以100(iL/孔體積包被微孔板，28。C包被18~20小時后，用含20%(體積)小牛血清、5%(重量)蔗糖的20mmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液120iuL/孔封閉18~20小時，甩盡封閉液后抽濕，28。C干燥18-20小時，加入干燥劑密封并檢查密封的鋁箔袋是否漏氣，置于28'C保存。B、FITC標(biāo)記弓形蟲抗原的制備a)、FITC標(biāo)記將弓形蟲抗原2mg用50mmol/LpH9.6碳酸緩沖液在28。C條件下透析，將FITC溶于二曱基亞砜(DMSO)中，終濃度為lmg/mL,按弓形蟲抗原FITC=lmg:150|ag的比例將FITC二曱基亞砜溶液緩慢加入弓形蟲抗原溶液中混合均勻，暗處4°C反應(yīng)8小時，加入5mol/L的NH4C1溶液至終濃度50mmol/L,4°C終止反應(yīng)2小時，將FITC標(biāo)記的弓形蟲抗原溶液在0.05mol/LpH7.2的磷酸鹽緩沖液中透析至透析液清亮，加入0.1%(重量)NaN3、1%(重量)牛血清白蛋白(BSA)pH7.2的10mmol/L磷酸鹽緩沖液中，4。C暗處保存。b)、FITC標(biāo)記抗原稀釋液的配制將0.2gNaH2P04.2H20、2.9gNa2HP04.12H20和10g牛血清白蛋白(BSA)加入潔凈容器中，用雙蒸水定溶至1000mL。c)、FITC標(biāo)i己抗原工作液的配制將制備的FITC標(biāo)記抗原用稀釋液分別稀釋成不同濃度，使用棋盤滴定法選擇出最佳的稀釋度為1:5500。C、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗-人IgG單克隆抗體的制備a)、標(biāo)記方法采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶與抗-人IgG單克隆抗體偶^:,加入50%甘油、置于-20。C凍存。b)、酶標(biāo)記物稀釋液的配制將0.2gNaH2P04.2H20、2.9gNa2HP04.12H20和10g牛血清白蛋白(BSA)加入潔凈容器中，用雙蒸水定溶至lOOOmL。c)、酶標(biāo)記物工作液的配制將制備的酶標(biāo)記物用稀釋液分別稀釋成不同濃度，使用棋盤滴定法選擇出最佳的稀釋度為1:6000。D、發(fā)光底物液的制備a)、化學(xué)發(fā)光底物液A釆用如下配方1Ommol/L魯米諾、0.3mmol/L4-羥基聯(lián)苯、O.05mmol/L4-碘代苯基硼酸、pH8.0~10.0200mmol/L硼酸緩沖液。將1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯(lián)苯、0.012g4-碘代苯基硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調(diào)整pH值為8.0~10.0,用雙蒸水定溶至1000mL。b)、化學(xué)發(fā)光底物液B采用如下配方3.5mmol/L過氧化脲、0.1%(體積)吐溫20、pH7.0-7.620mmol/L磷酸鹽緩沖液。將0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04.12H20、8.74gNaH2P04.2H20加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調(diào)整pH值為7.0-7.6，用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時將底物液A、B等體積混合。E、濃縮洗涂液的制備采用如下配方16%(重量)NaCl、0.4%(重量)KCl、0.1%(體積)吐溫20、pH7.4200mmol/LTris-HCl緩沖液。將160gNaCl、4gKC1、24.2g三羥曱基氨基曱烷(Tris)、lml吐溫20溶于900ml雙蒸水中，用HC1調(diào)整pH至7.4,用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時用雙蒸水20倍稀釋。F、陰性、陽性對照品的制備收集經(jīng)ELISA法檢測弓形蟲IgG抗體、HBsAg、HIV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體陰性的正常人血清6份以上，過濾除菌、分裝、低溫儲存。收集經(jīng)ELISA法檢測弓形蟲IgG抗體陽性，HBsAg、HIV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體陰性的患者血清6份以上，適當(dāng)稀釋后過濾除菌、分裝、低溫儲存。實(shí)施例2一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備以磁性顆粒作為固相載體，以EDC法將FITC抗體偶聯(lián)到磁性顆粒表面，以含12%(重量)NaCl、0.1%(重量)KC1、400mmol/LpH7.2Tris-HCl緩沖液為濃縮洗滌液，其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒。實(shí)施例3一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備(1)、發(fā)光底物液的制備a)、化學(xué)發(fā)光底物液A釆用如下配方1mmol/L魯米諾、0.1mmol/L4-羥基聯(lián)苯、0.01mmol/L4-碘代苯基硼酸、50mmol/LpH8.0~10.0硼酸緩沖液。將0.177g魯米諾、0.017g4-羥基聯(lián)苯、0.0025g4-碘代苯基硼酸、2.85g硼酸、1.225g硼砂加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調(diào)整pH值為8.0-10,用雙蒸水定溶至1000mL。b)、化學(xué)發(fā)光底物液B采用如下配方1mmol/L過氧化脲、0.05%(體積)吐溫20、10mmol/LpH7.0-7.6磷酸鹽緩沖液。將0.094g過氧化脲、0.5mlTween20、25.79gNa2HP04■12H20、4.37gNaH2P04.2H20加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調(diào)整pH值為7.0-7.6，用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時將底物液A、B等體積混合。(2)、濃縮洗滌液的制備采用如下配方12%(重量)NaCl、0.1%(重量)KCl、0.05%(體積)吐溫20、50mmol/LpH7.4Tris-HCl緩沖液。將120gNaCl、lgKCl、6.05g三羥曱基氨基曱烷(Tris)、0.5ml吐溫20溶于900ml雙蒸水中，用HC1調(diào)整pH至7.2,用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時用雙蒸水20倍稀釋。其余步驟同實(shí)施例1。實(shí)施例4一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備(1)、發(fā)光底物液的制備a)、化學(xué)發(fā)光底物液A采用如下配方20mmol/L魯米諾、0.5mmol/L4-羥基聯(lián)苯、0.1mmol/L4-石典代苯基硼酸、500mmol/LpH8.0~10.0硼酸緩沖液。將3.54g魯米諾、0.0857g4-羥基聯(lián)苯、0.025g4-碘代苯基硼酸、28.5g硼酸、12.25g硼砂加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調(diào)整pH值為8.0-10，用雙蒸水定溶至1000mL。b)、化學(xué)發(fā)光底物液B采用如下配方5mmol/L過氧化脲、0.5%(體積)吐溫20、50mmol/LpH7.0~7.6磷酸鹽緩沖液。將0.47g過氧化脲、5mlTween20、128.95gNa2HP0412H20、21.85gNaH2P04.2H20加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調(diào)整pH值為7.0-7.6,用雙蒸水定溶至lOOOrnL。使用時將底物液A、B等體積混合。(2)、濃縮洗滌液的制備釆用如下配方20%(重量)NaCl、0.7%(重量)KCl、0.2%(體積)吐溫20、50mmol/LpH7.4Tris-HCl緩沖液。將200gNaCl、7gKCl、60.5g三羥曱基氨基甲烷(Tris)、2ml吐溫20溶于900ml雙蒸水中，用HC1調(diào)整pH至7.6,用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時用雙蒸水20倍稀釋。其余步驟同實(shí)施例1。實(shí)施例5一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的使用方法。(1)、取出實(shí)施例1中所制備的弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，室溫平衡15-30分鐘。(2)、將待測樣本用生理鹽水1:100預(yù)稀釋。(3)、在包被板分別加入陰性對照、陽性對照以及預(yù)稀釋的待測樣本50iaL,然后每孔分別加入50juLFITC標(biāo)記弓形蟲抗原，振蕩混勻，37。C溫育30分鐘。(4)、用稀釋后的洗滌液洗5次，每孔加滿洗滌液，每次浸泡10秒，最后在干凈的吸水紙上拍干。(5)、各孔加辣才艮過氧化物酶標(biāo)記抗-人IgG單克隆抗體100juL,振蕩混勻，37。C溫育30分鐘。(6)、用稀釋后的洗滌液洗5次，每孔加滿洗滌液，每次浸泡10秒，最后在干凈的吸水紙上拍干。(7)、各孔加入混合后的化學(xué)發(fā)光底物液(發(fā)光底物液A、B按1:1混合)100juL,室溫(2025°C)避光反應(yīng)5分鐘。(8)加化學(xué)發(fā)光底物液后的第530分鐘內(nèi)測量，在化學(xué)發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU),測量時間l秒/孔。(9)、Cutoff值=2.1^,RLU值>Cutoff值則樣本判定為陽性樣本；RLU值<Cutoff值則樣本判定為陰性樣本。實(shí)施例6一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的使用方法。(1)、將實(shí)施例2中所制備的弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒室溫平衡15-30分鐘。(2)、將待測樣本用生理鹽水1:100預(yù)稀釋。(3)、將陰性、陽性對照以及待測樣本50juL分別加入編號的圓底聚苯乙烯試管，然后每管分別加入FITC標(biāo)記抗原50nL、f茲性顆粒100nL,37X:振蕩反應(yīng)15分鐘。(4)、將試管架置于磁分離器上分離lmin，然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加入洗滌液500|liL，充分混勻，置于磁分離器上分離1min,倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復(fù)4次。(5)、各管加酶標(biāo)抗體lOO)aL,37。C振蕩反應(yīng)15分鐘。(6)、重復(fù)步驟(4)。(7)、各管加入混合后的化學(xué)發(fā)光底物液(發(fā)光底物液A、B按1:1混合)200400|aL,充分混勻，置于磁分離器內(nèi)，待》對鼓粒富集于底部后，暗處放置5min,在化學(xué)發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU),測量時間l秒/管；Cutoff值^2.1^,RLU值》Cutoff值則樣本判定為陽性樣本；RLU值〈Cutoff值則樣本判定為陰性樣本。實(shí)施例7采用實(shí)施例1中所制備的弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒按實(shí)施例5所述方法對100例育齡婦女孕前篩查血樣進(jìn)行才企測，同時采用5朱海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司生產(chǎn)的國藥準(zhǔn)字S20040019號弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)作為對照，比較檢測結(jié)果。結(jié)果如下表1本發(fā)明試劑盒與酶聯(lián)免疫試劑測定弓形蟲IgG抗體結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>從實(shí)驗結(jié)果可看出，本發(fā)明弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒與對照試劑盒;f全測結(jié)果一致。實(shí)施例8采用實(shí)施例2中所制備的弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒按實(shí)施例6所述方法對87例育齡婦女孕前篩查血樣進(jìn)行檢測，同時釆用珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司生產(chǎn)的國藥準(zhǔn)字S20040019號弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)作為對照，比較檢測結(jié)果。結(jié)果如下表2本發(fā)明試劑盒與酶聯(lián)免疫試劑測定弓形蟲IgG抗體結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從實(shí)驗結(jié)果可看出，本發(fā)明弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒與對照試劑盒兩種檢測方法的符合率為100%。實(shí)施例9采用實(shí)施例3中所制備的弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒按實(shí)施例5所述方法對109例育齡婦女孕前篩查血樣進(jìn)行檢測，同時采用珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司生產(chǎn)的國藥準(zhǔn)字S20040019號弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)作為對照，比較檢測結(jié)果。結(jié)果如下表3本發(fā)明試劑盒與酶聯(lián)免疫試劑測定弓形蟲IgG抗體結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>—1070107本發(fā)明試劑盒+022合計1072109從實(shí)驗結(jié)果可看出，本發(fā)明弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒與對照試劑盒兩種檢測方法的符合率為100%。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種檢測弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，由陰性、陽性對照品，固相載體，弓形蟲抗原標(biāo)記物，酶結(jié)合物，化學(xué)發(fā)光底物液A、B，以及濃縮洗滌液組成，其特征在于，所述的固相載體由FITC抗體包被，弓形蟲抗原由FITC標(biāo)記，酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-人IgG單克隆抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，所述的固相載體為包被FITC抗體的微孔板或磁性顆粒。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光底物液A含有.諾1~20mmol/L4-羥基聯(lián)苯0.1~0.5mmol/L4-石典代苯基硼酸0.01—0.1mmol/L硼酸纟爰沖;容液50~500mmol/LpH8.0-10.0;所述的化學(xué)發(fā)光底物液B含有過氧化脲1~5mmol/L吐溫200.05~0.5%(體積)磷酸鹽緩沖溶液1050mmol/LpH7.0~7.6。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光底物液A含有魯米諾10mmol/L4-羥基耳關(guān)苯0.3mmol/L4-碘代苯基硼酸0.05mmol/L硼酸緩沖溶液200mmol/LpH8.0-10.0;所述的化學(xué)發(fā)光底物液B含有'.過氧化脲3.5mmol/L吐溫200.1%(體積)磷酸鹽緩沖溶液20mmol/LpH7.0~7.6。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任意一項所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，其中的濃縮洗滌液含有NaCl12~20%(重量)KC10.1~0.7%(重量)吐溫200.05~0.2%(體積)Tris-HCl緩沖液50500mmol/LpH7.2~7.6。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，所述的濃縮洗滌液含有NaCl16%(重量)KC10.4%(重量)吐溫200.1%(體積)Tris畫HCl緩沖液200mmol/LpH7.2~7.6。7.檢測弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟A、包被固相載體的制備用含0.54嗎/mLFITC抗體的20mmol/LpH7.27.4磷酸鹽緩沖液包被固相載體，28。C包被18~20小時后，用含20%(體積)小牛血清、5%(重量)蔗糖的20mmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液封閉18~20小時，棄盡封閉液后抽濕，28。C干燥18~20小時，加入干燥劑密封；B、FITC標(biāo)記弓形蟲抗原的制備將用50mmol/LpH9.6石友酸鹽緩沖液透析后的弓形蟲抗原加入DMSO溶解的FITC,反應(yīng)終止后純化、分裝、低溫避光保存；采用棋盤滴定法選擇FITC標(biāo)記抗原工作濃度，并溶解于1%(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸鹽ll沖液中以制備FITC標(biāo)記的弓形蟲抗原工作溶液；C、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗-人IgG單克隆抗體溶液的制備釆用改良過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶標(biāo)記抗-人IgG單克隆抗體，采用棋盤滴定法選擇最佳的酶標(biāo)抗體工作濃度，并溶解于1%(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液中以制備酶標(biāo)抗體工作溶液；D、發(fā)光底物液的制備1~20mmol/L0.1~0.5mmol/L0.01~0.1mmol/L50500mmol/LpH8.0~10.0;1~5mmol/L0.05~0.5%(體積)10~50mmol/LpH7.0—7.6;化學(xué)發(fā)光底物液A含有魯米諾4-羥基聯(lián)苯4-碘代苯基硼酸硼酸緩沖溶液化學(xué)發(fā)光底物液B含有過氧化脲吐溫20磷酸鹽緩沖溶液E、濃縮洗滌液的制備濃縮洗滌液含有NaCl12~20%(重量)KC10.1~0.7%(重量)吐溫200.05~0.2%(體積)Tris畫HCl緩沖液50~500mmol/LpH7.2~7,6;F、陰性、陽性對照品的制備弓形蟲IgG抗體、HBsAg、HIV(1十2)抗體、TP抗體、HCV抗體為陰性的正常人血清過濾除菌、分裝、低溫儲存；弓形蟲IgG抗體陽性，HBsAg、HIV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體為陰性的患者血清過濾除菌、分裝、低溫儲存。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，所述包被固相載體由如下方法制備以磁性顆粒作為固相載體，以EDC共價偶聯(lián)法將FITC抗體偶聯(lián)到磁性顆粒表面。9.根據(jù)權(quán)利要求7-8之任意一項所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光底物液A含有魯米諾10mmol/L4-羥基聯(lián)苯0.3mmol/L4-石典代苯基硼酸0.05mmol/L硼酸緩沖溶液200mmol/LpH8.0-10.0;所述的化學(xué)發(fā)光底物液B含有過氧化脲3.5mmol/L吐溫200.1%(體積)磷酸鹽緩沖溶液20mmol/LpH7.0~7.6;所述的濃縮洗滌液含有NaCl16%(重量)KC10.4%(重量)吐溫200.1%(體積)Tris-HCl緩沖液200mmol/LpH7.2~7.6。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，由陰性、陽性對照品，固相載體，弓形蟲抗原標(biāo)記物，酶結(jié)合物，化學(xué)發(fā)光底物液A、B，以及濃縮洗滌液組成。本發(fā)明還公開了一種弓形蟲IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒的制備方法。使用本發(fā)明制備的試劑盒檢測弓形蟲IgG抗體，具有操作簡便，靈敏度高，特異性好，與病原學(xué)檢驗結(jié)果符合度極高等特點(diǎn)，可以作為孕前檢驗的重要指標(biāo)之一，對于提高出生人口素質(zhì)、優(yōu)生優(yōu)育具有意義。文檔編號G01N33/577GK101373189SQ20081010550公開日2009年2月25日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者于尚永,唐寶軍,宋勝利,應(yīng)希堂,彭京勝,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司