專利名稱：針對開發(fā)癌癥、自身免疫性疾病和傳染性疾病免疫治療的天然hla限制肽的差異化量化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
深入了解人類白細(xì)胞抗原(HLA)結(jié)合肽在原發(fā)惡性組織中的表達(dá)水平可大大改進(jìn)開發(fā)癌癥免疫療法以及自身免疫和感染疾病的免疫治療，從而誘發(fā)免疫系統(tǒng)T細(xì)胞對抗癌癥。該信息特別與肽疫苗相關(guān)，也與基于蛋白質(zhì)、DNA或RNA等分子實體的任何其他類型的T細(xì)胞疫苗相關(guān)。之前，在“組學(xué)”范圍內(nèi)并無這種量化數(shù)據(jù)，因為迄今為止，常見的定量分析方法大多依賴于差別化化學(xué)標(biāo)記戰(zhàn)略，要求所有要比較的樣本在單一實驗中處理，這嚴(yán)重地限制了此類研究的可能規(guī)模。EP1508047B1中披露了一種識別上述避免“反向免疫學(xué)”相關(guān)問題的肽的方法。如上所述，該方法不能用于所述肽的定量分析。WO 2005/076009中披露了運用標(biāo)記策略的另一種方法，其中允許進(jìn)行一些定量分析，但不能在更大的規(guī)模上進(jìn)行。例如，WO 03/025576中披露了其他標(biāo)記方法，Martin等人在《蛋白質(zhì)組學(xué)》(Proteomics 2003，3，2208-2220) —文中也進(jìn)行了披露。Fortier 等人披露了另一種方法(The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome, JEM, Vol. 205, No. 3, March 17,2008595-610)。該方法的缺點是由于酸洗脫，需要從非MHC結(jié)合肽中剝離出MHC結(jié)合肽。這通過使用b2m-敲除細(xì)胞株來實施。因此，該方法不能用于原發(fā)患者腫瘤材料。在該方法中，對原發(fā)鼠胸腺細(xì)胞與鼠EL4細(xì)胞株進(jìn)行了對比。通過測量MHC-I分子對起始量進(jìn)行了調(diào)整。僅此就大大限制了Fortier等人披露的方法。此外，沒有應(yīng)用不同尺寸和來源的原發(fā)組織所需要的正態(tài)化。相反，使用均衡的起始原料，讓正態(tài)化過時。然而，對于原發(fā)(患者)材料，正態(tài)化是絕對必要的。是否能刺激免疫反應(yīng)取決于是否存在被宿主免疫系統(tǒng)視為異物的抗原。發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)以及疾病抗原的提呈增加了運用宿主免疫系統(tǒng)干預(yù)腫瘤生長的可能性。對于癌癥免疫療法，目前正在探索各種利用免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞免疫作用的機(jī)制。細(xì)胞免疫反應(yīng)的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細(xì)胞。從腫瘤浸潤細(xì)胞群或外周血中分離出的細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(CTL)表明，這些細(xì)胞在癌癥的天然免疫防御中發(fā)揮了重要作用。尤其是識別與主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子結(jié)合的肽的CD8陽性T細(xì)胞(T-CDS+)。通常帶8至10個氨基酸殘基的這些肽源自于蛋白質(zhì)或位于細(xì)胞質(zhì)的缺損核糖體產(chǎn)物(DRIP)，它們在這種反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。人MHC分子也稱為人白細(xì)胞-抗原(HLA)。MHC分子有兩類大部分有細(xì)胞核的細(xì)胞上都可發(fā)現(xiàn)的MHC-I類分子。MHC分子分別由一條α重鏈和β-2-微球蛋白(MHC-I類受體)或α和β鏈(MHC-II類受體)組成。其三維構(gòu)造形成一個結(jié)合槽，用于與肽進(jìn)行非共價相互作用。MHC I類分子提呈主要為內(nèi)源性的蛋白、DRIPS和較大肽的蛋白裂解產(chǎn)生的肽。MHC II類分子主要發(fā)現(xiàn)于專職性抗原提呈細(xì)胞(APC)上，并且主要提呈在內(nèi)吞作用過程中被APC吞噬且隨后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和MHC I類分子的復(fù)合體由負(fù)載相應(yīng)TCR(T細(xì)胞受體)的CD8陽性細(xì)胞毒性T淋巴 細(xì)胞進(jìn)行識別，而肽和MHC II類分子的復(fù)合體由負(fù)載相應(yīng)TCR的CD4陽性輔助T細(xì)胞進(jìn)行識別。本領(lǐng)域已熟知TCR、肽和MHC由此按I : I : I的化學(xué)計算量而存在。對于觸發(fā)(引發(fā))細(xì)胞免疫反應(yīng)的肽，它必須與MHC分子結(jié)合。這一過程依賴于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態(tài)性。MHC-I類-結(jié)合肽的長度通常為8-12個氨基酸殘基，并且在其與MHC分子相應(yīng)結(jié)合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基(“錨”)。這樣，每個MHC的等位基因都有一個“結(jié)合基序”，從而確定哪些肽能與結(jié)合溝槽特異性結(jié)合。在MHC-I類依賴性免疫反應(yīng)中，肽不僅能與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的某些MHC-I類分子結(jié)合，而且它們還必須能被帶有特異性T細(xì)胞受體(TCR)的T細(xì)胞識別。腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識別的抗原，即它們的表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子等，它們在相應(yīng)腫瘤的細(xì)胞中被表達(dá)，并且與同源未變的細(xì)胞相比，其表達(dá)上調(diào)。目前將腫瘤相關(guān)抗原或疾病相關(guān)抗原分類為以下主要幾組癌-睪丸抗原T細(xì)胞能夠識別的最先確認(rèn)的TAA[腫瘤相關(guān)抗原；疾病相關(guān)抗原縮寫為DAA]屬于這一類抗原，由于其成員表達(dá)于組織學(xué)相異的人腫瘤中，在正常組織中，僅表達(dá)于睪丸精母細(xì)胞/精原細(xì)胞(偶爾于胎盤)中，因此，它最初被稱為癌-睪丸(CT)抗原。由于睪丸細(xì)胞不表達(dá)HLA I類和II類分子，所以，在正常組織中，這些抗原不能被T細(xì)胞識別，因此在免疫學(xué)上可考慮為具有腫瘤特異性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成員或NY-ES0-1。分化抗原腫瘤和正常組織(腫瘤源自該組織)都含有ΤΑΑ，大多數(shù)TAA發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤和正常黑色素細(xì)胞中。許多此類黑色素細(xì)胞譜系相關(guān)蛋白參與黑色素的生物合成，因此這些蛋白不具有腫瘤特異性，但是仍然被廣泛用于癌癥的免疫治療。例子包括，但不僅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-Ι或前列腺癌的PSA。過量表達(dá)的TAA :在組織學(xué)相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測到了基因編碼被廣泛表達(dá)的TAA，一般表達(dá)水平較低。有可能許多由正常組織加工和潛在提呈的表位低于T細(xì)胞識別的閾值水平，而它們在腫瘤細(xì)胞中的過量表達(dá)能夠通過打破先前確立的耐受性而引發(fā)抗癌反應(yīng)。這類TAA的典型例子為Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。腫瘤特異性抗原這些獨特的TAA產(chǎn)生于正常基因(如β -catenin、⑶K4等)的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉(zhuǎn)化和/或進(jìn)展相關(guān)。腫瘤特異性抗原一般可在不對正常組織帶來自體免疫反應(yīng)風(fēng)險的情況下誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。另一方面，這些TAA在多數(shù)情況下只與被確認(rèn)其上有TAA的確切腫瘤相關(guān)，并且通常在許多個體腫瘤之間并不共享 ΤΑΑ。由異常翻譯后修飾產(chǎn)生的TAA :此類TAA可能由腫瘤中既不具有特異性也不過量表達(dá)的蛋白產(chǎn)生，但其仍然具有腫瘤相關(guān)性(該相關(guān)性由主要在腫瘤具有活性的翻譯后加工所致)。此類TAA產(chǎn)生于糖基化模式的改變，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生針對MUCl的新型表位或在降解過程中導(dǎo)致諸如蛋白拼接的事件，這可能具有也可能不具有腫瘤特異性。腫瘤病毒蛋白這些TTA是病毒蛋白，可在致癌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且由于它們是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能夠激發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)。這類蛋白的例子有人乳頭狀瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它們在宮頸癌中表達(dá)。對于被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識別為腫瘤特異性或相關(guān)性抗原、或疾病特異性或相關(guān)性抗原以及用于治療的蛋白質(zhì)，必須具備特殊的先決條件。該抗原應(yīng)主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞或受感染細(xì)胞，而完全不表達(dá)于正常健康組織，或表達(dá)量相對較少，例如少于因子5、10或更多。在傳染病中有兩種可能性，第一，受感染細(xì)胞表達(dá)一種健康細(xì)胞不表達(dá)的抗 原-與感染直接相關(guān)-或受感染細(xì)胞過量表達(dá)一種健康細(xì)胞只有極少量表達(dá)的抗原-抗原過量表達(dá)通常存在于健康細(xì)胞的多肽組中。更為適宜的情況是，該相應(yīng)抗原不僅出現(xiàn)于一種腫瘤、感染或緊張中，而且濃度(即每個細(xì)胞的相應(yīng)肽拷貝數(shù)目)高。腫瘤特異性和相關(guān)性抗原以及疾病特異性或相關(guān)性抗原往往是源自直接參與正常細(xì)胞向腫瘤/受感染細(xì)胞轉(zhuǎn)化的蛋白，這種轉(zhuǎn)化是由某種功能(比如細(xì)胞周期調(diào)控或凋亡)而引起的。在癌癥的情況下，這些直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化事件的蛋白的其他下游靶標(biāo)也可能會被上調(diào)，因此可能與腫瘤間接相關(guān)。這些腫瘤間接相關(guān)抗原也可能是預(yù)防接種方法的革巴標(biāo)(Singh-Jasuja H. , Emmerich N. P. , Rammensee H. G. , Cancer Tmmunol·Immunother. 2004Mar ；453(3) :187-95)。在這兩種情況中，至關(guān)重要的是在抗原的氨基酸序列中都存在表位，這是因為這種源自腫瘤相關(guān)或疾病相關(guān)抗原的肽(“免疫原性肽”)可導(dǎo)致體外或體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)。基本上，任何能與MHC分子結(jié)合的肽都可能充當(dāng)一個T細(xì)胞表位。誘導(dǎo)體外或體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)的前提是存在具有相應(yīng)TCR的T細(xì)胞并且不存在對該特定表位的免疫耐受性。因此，TAA和DAA是開發(fā)腫瘤疫苗的起點。識別和表征TAA和DAA的方法基于對患者或健康受試者CTL的使用情況，或基于腫瘤與正常組織之間差別轉(zhuǎn)錄特性或肽差別表達(dá)模式的產(chǎn)生。然而，對腫瘤組織或人腫瘤細(xì)胞株中過量表達(dá)或選擇性表達(dá)的基因的識別并不提供在免疫療法中使用這些基因所轉(zhuǎn)錄抗原的準(zhǔn)確信息。這是因為，由于有著相應(yīng)TCR的T細(xì)胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水平，因而這些抗原的表位只有一部分適合這種應(yīng)用。因此，只選擇那些蛋白過量表達(dá)或選擇性表達(dá)的肽，并且這些肽是與可找到對抗性功能性T細(xì)胞的MHC分子結(jié)合在一起被提呈，這一點非常重要。這種功能性T細(xì)胞被定義為在以特異性抗原刺激后能夠克隆地擴(kuò)展并能夠執(zhí)行效應(yīng)子功能(“效應(yīng)T細(xì)胞”)的T細(xì)胞。輔助T細(xì)胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應(yīng)子功能中發(fā)揮著重要作用。觸發(fā)THl細(xì)胞反應(yīng)的輔助T細(xì)胞表位支持CD8陽性殺傷T細(xì)胞的效應(yīng)子功能，其中包括直接作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能(該類腫瘤細(xì)胞表面顯示有腫瘤相關(guān)肽/MHC復(fù)合體)。這樣，單獨形式的或與其他腫瘤相關(guān)肽形成組合物的腫瘤相關(guān)T輔助細(xì)胞肽表位可作為刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)疫苗組合物的活性藥物成分。鑒于上述情況，因此，本發(fā)明的對象提供了一種方法，其中至少部分地
-允許處理不同數(shù)量的(人)組織樣本和MHC表達(dá)水平，即可很容易地應(yīng)用到原發(fā)組織樣本中；-不限制于此類細(xì)胞，例如，其中必須產(chǎn)生beta2m-敲除配對物，即，也適用于原發(fā)(人)組織樣本；-可在“高通量”水平上進(jìn)行；且-可逐步進(jìn)行，S卩，以多年來新樣本的數(shù)據(jù)來提高定量數(shù)據(jù)的現(xiàn)有數(shù)據(jù)集。技術(shù)人員在研究本發(fā)明的以下說明時，本發(fā)明的其他目標(biāo)和優(yōu)勢將變得明了。在下面的描述中，以癌癥為例對本發(fā)明進(jìn)行說明。然而，只要各免疫方面給出的答案是涉及MHC I類分子，則本發(fā)明的方法也可以應(yīng)用于感染性疾病、自身免疫性疾病和寄生 蟲感染。此外，本發(fā)明不局限于人類疾病，可用于哺乳動物，如牛、豬、馬、貓、狗，嚙齒類動物，如大鼠、小鼠、山羊和其他家畜或因癌性疾病而瀕臨滅絕的動物，如袋獾。定義此處使用的術(shù)語“提呈譜”(presentationprofile 或 presentation plot)表不的是在條形圖中各種不同樣本中某種肽的平均提呈。提呈情況以豐度相對于最大面積的百分比表示。系數(shù)以基于所測重復(fù)的95%置信區(qū)間來進(jìn)行可視化。如果在樣本中發(fā)現(xiàn)了肽，但不可能量化，則標(biāo)注NA (不可用/無面積)。“提呈得分”是用O和I之間的數(shù)值來度量一組組織與另一組相比的肽過量表達(dá)情況。提呈得分越小，過量表達(dá)的可能性就越大。如果某個肽未在任何正?；蛘叻腔疾颖局邪l(fā)現(xiàn)，將不能計算得分，因此，設(shè)定為零。為了確定一組顯著過量表達(dá)的TUMAP，必須選擇顯著性閾值(如0. 05)，并且納入/取得所有提呈得分小于該閾值的TUMAP。因此，提呈得分反映了 TUMAP出現(xiàn)過量表達(dá)機(jī)會的概率。從統(tǒng)計學(xué)來看，提呈得分可以是線性混合模型的P值。在這種情況下，得分模擬將樣本之間和內(nèi)部的變化納入為隨機(jī)效應(yīng)并將諸如腫瘤實體和正常組織之間的差異納入為固定效應(yīng)的提呈數(shù)據(jù)(TUMAP功能區(qū))。在一種更加簡化的方法中，提呈得分可以是t檢驗的P值。使用FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)調(diào)整提呈得分以用于多重測試。此處使用的術(shù)語“質(zhì)量控制”涉及驗證本方法使用的數(shù)據(jù)滿足足夠的條件，以便它用于本方法。一個實例是確定序列的總數(shù)以及基于每個分析樣本肽數(shù)量重復(fù)性在各個區(qū)有小變化的序列數(shù)量，即，有多少肽序列可在一個樣本中被識別(最好是可靠識別)，這些被識別的肽中有百分之多少(如25130150%甚至75%)可用有小變化的可靠區(qū)域進(jìn)行分配(如20%或更少的CV)。這是不同樣本之間可靠正態(tài)化的一個先決條件。通常情況下，可以可靠識別的肽序列數(shù)量越多，數(shù)據(jù)的質(zhì)量就越高。另一個實例是識別和面積估計的質(zhì)量控制，例如通過肽識別結(jié)果和區(qū)域重復(fù)性的“典型”目視檢查或通過統(tǒng)計分析進(jìn)行質(zhì)量控制。發(fā)明的詳細(xì)說明在本發(fā)明的第一方面，發(fā)明的目的通過以下方法解決識別和無標(biāo)記定量至少一種哺乳動物的原發(fā)組織樣本上的MHC配體肽，其中包括以下步驟a)提供至少有一份病變原發(fā)組織樣本以及與該病變組織最好相應(yīng)的至少一份原發(fā)健康組織樣本，b)從所述樣本中分離MHC配體肽，c)用所述MHC配體肽進(jìn)行HPLC-MS分析，
d)為每個從步驟c)中獲得的信號提取母離子信號強(qiáng)度(區(qū))，e)通過片段譜聚類和數(shù)據(jù)庫檢索識別所述MHC配體肽的序列，以對不同操作和樣本之間的區(qū)域進(jìn)行分組；正態(tài)化重復(fù)操作之間的區(qū)域以彌補重復(fù)操作之間的技術(shù)性能/靈敏度差異，重復(fù)操作會得出每份樣本每個肽的平均數(shù)量，包括錯誤估計，f)分配MHC等位基因的所述序列以產(chǎn)生等位基因特異性序列亞組從而對不同樣本進(jìn)行比較；使用等位基因特異性亞組正態(tài)化不同的樣本以說明不同的樣本大小或MHC表達(dá)水平結(jié)果是樣本之間的相對數(shù)量可進(jìn)行比較，g)基于每個樣本的肽重復(fù)性進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，確認(rèn)已識別序列的總數(shù)以及各個區(qū)有小變化的序列數(shù)量盡可能的高，h)計算提呈譜和得分，以確定MHC配體肽的潛在過量提呈，i)控制識別和面積估計的質(zhì)量，例如通過肽識別結(jié)果和區(qū)域重復(fù)性的目視檢查或通過統(tǒng)計分析進(jìn)行質(zhì)量控制，j)將所述至少一份病變原發(fā)組織樣本的檢測值與獲自所述至少一種原發(fā)健康組織的數(shù)值進(jìn)行比較，且k)量化所述MHC配體肽在本發(fā)明的第二方面，發(fā)明的目的通過以下方法解決識別和量化原發(fā)組織樣本上的MHC配體肽，其中包括以下步驟a)提供至少有一份病變原發(fā)組織樣本以及與至少一種哺乳動物中該病變組織最好相應(yīng)的至少一份健康組織樣本，b)從所述樣本中分離MHC配體肽，c)對所述MHC配體肽進(jìn)行HPLC-MS分析，d)為每個從步驟c)中獲得的信號提取母離子信號強(qiáng)度(區(qū))，e)通過片段譜聚類和數(shù)據(jù)庫檢索識別所述MHC配體肽的序列以對不同操作和樣本之間的區(qū)域進(jìn)行分組；正態(tài)化重復(fù)操作之間的區(qū)域以彌補重復(fù)操作之間的技術(shù)性能/靈敏度差異，結(jié)果可得到每份樣本每個肽的平均數(shù)量，包括錯誤估計，f)分配MHC等位基因的所述序列以產(chǎn)生等位基因特異性序列亞組從而對不同樣本進(jìn)行比較；使用等位基因特異性序列亞組正態(tài)化不同的樣本以說明不同的樣本量或MHC表達(dá)水平結(jié)果是樣本之間的相對數(shù)量可進(jìn)行比較，g)基于每個樣本的肽重復(fù)性進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，確認(rèn)識別序列總數(shù)以及各個區(qū)有小變化的序列數(shù)量至少為25，優(yōu)選為50，更優(yōu)選為100，h)計算提呈譜和得分，以確定MHC配體肽的潛在過量提呈，i)通過統(tǒng)計分析對識別和面積估計進(jìn)行質(zhì)量控制，j)將所述至少一份病變原發(fā)組織樣本的檢測值與獲自所述至少一種健康組織的數(shù)值進(jìn)行比較，且k)量化所述MHC配體肽。根據(jù)本發(fā)明所述的一種方法為優(yōu)選，其中識別序列總數(shù)以及各個區(qū)有小變化的序列數(shù)量不明顯低于(例如少于20%，10%甚至是1%)定量比較分析中納入的其他樣本中
的數(shù)量。根據(jù)本發(fā)明所述的一種方法為優(yōu)選，其中所述MHC配體肽選自一種腫瘤相關(guān)肽(TAA)或疾病相關(guān)肽(DAA)。進(jìn)一步優(yōu)選本發(fā)明所述的一種方法，其進(jìn)一步包括一系列過量提呈和/或腫瘤特異性MHC配體肽。根據(jù)本發(fā)明所述的一種方法為更進(jìn)一步優(yōu)選，其中所述病變樣本為一份腫瘤樣本或一份受感染組織樣本。在本發(fā)明的情況下，直接源自受試者(例如患者)的樣本被稱為“原發(fā)”樣本，例如原發(fā)組織或腫瘤樣本，而細(xì)胞株樣本為例如確定的腫瘤細(xì)胞株。樣品可以是新鮮的也可以是保存的(如冷凍或制備)，只要它們適用于根據(jù)本發(fā)明所述的方法即可。
作為一種優(yōu)選實例，可使用與CNBr活化的瓊脂糖凝膠耦合之后經(jīng)酸處理和超濾的HLA-A、HLA-B, HLA-C特異性抗體W6/32或HLA_A*02特異性抗體BB7. 2以免疫沉淀法從固體組織獲得休克冷凍(原發(fā))組織樣本的HLA肽庫。對于不同的HLA等位基因，本領(lǐng)域已知的其他特異性抗體可用作為，例如A*03的GAP-A，B等位基因的BI. 23. 2。存在相應(yīng)的方法來獲得本領(lǐng)域已知的其他哺乳動物的MHC-I類肽。根據(jù)本發(fā)明所述的方法也可用于傳染性疾病，例如病毒或細(xì)菌感染，如登革熱、埃博拉病毒、馬爾堡病毒，結(jié)核病(TB)、腦膜炎或梅毒，優(yōu)選情況是，該方法用于抗生素耐藥菌株的傳染性生物體、自身免疫性疾病(如關(guān)節(jié)炎)、寄生蟲感染(如瘧疾)和其他疾病(如MS和Morbus帕金森)，只要免疫方面給出的答案是MHC-I類分子。表I列出了人寄生蟲感染的優(yōu)選實例
原生動物有機(jī)體—....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
卞物體或疾病的拉ΓΚ名稱受1$響身體部患病率來源/傳播
通州名稱位(庫/帶菌
Λ.)
EWmmBabcsia §7 紅細(xì)胞
__New York, 蜱《 咬Divergens、Martha's
權(quán)利要求
1.原發(fā)組織樣本MHC配體肽的識別和無標(biāo)記量化方法，包括以下步驟 a)提供至少有一份病變原發(fā)組織樣本以及與該病變組織最好相應(yīng)的至少一份原發(fā)健康組織樣本， b)從所述樣本中分離MHC配體肽， c)用所述MHC配體肽進(jìn)行HPLC-MS分析， d)為每個從步驟c)中獲得的信號提取母離子信號強(qiáng)度(區(qū))， e)通過片段譜聚類和數(shù)據(jù)庫檢索識別所述MHC配體肽的序列以對不同操作和樣本之間的區(qū)域進(jìn)行分組；正態(tài)化重復(fù)操作之間的區(qū)域以彌補重復(fù)操作之間的技術(shù)性能/靈敏度差異，重復(fù)操作會得出每份樣本每個肽的平均數(shù)量，包括誤差估計， f)將所述序列分配到MHC等位基因，以生成等位基因特異性序列亞組從而對不同樣本進(jìn)行比較；使用等位基因特異性亞組正態(tài)化不同的樣本以說明不同的樣本量或MHC表達(dá)水平結(jié)果是樣本之間的相對數(shù)量可進(jìn)行比較， g)基于每個樣本的肽重復(fù)性進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，確認(rèn)識別序列總數(shù)以及各個區(qū)有小變化的序列數(shù)量盡可能的高， h)計算提呈譜和得分，以確定MHC配體肽的潛在過量提呈， i)控制識別和面積估計的質(zhì)量，例如通過肽識別結(jié)果和區(qū)域重復(fù)性的目視檢查或通過統(tǒng)計分析進(jìn)行質(zhì)量控制， j)將所述至少一份病變原發(fā)組織樣本的檢測值與獲自所述至少一種原發(fā)健康組織的數(shù)值進(jìn)行比較，且 k)量化所述MHC配體肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的方法，其中所述MHC配體肽選自一種腫瘤相關(guān)肽(TAA)或疾病相關(guān)肽(DAA)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，進(jìn)一步包括一系列過量提呈和/或腫瘤特異性MHC配體肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項所述的方法，其中所述病變樣本為一份腫瘤樣本或一份受感染組織樣本。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一項所述的方法，其中，使用自動和/或手動檢查進(jìn)行質(zhì)量控制。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項所述的方法，進(jìn)一步包括選自以下群組的至少一個步驟 步驟d)，調(diào)整保留時間從而在不知道序列的情況下在重復(fù)操作內(nèi)分配相應(yīng)的信號，和/或通過調(diào)整保留時間從而在不知道序列的情況下分配不同樣本之間的相應(yīng)信號；步驟h)，實施來自每個基因的一個以上肽的相關(guān)提呈數(shù)據(jù)來計算基于基因的過量提呈得分；以及步驟i)，基于加標(biāo)肽的質(zhì)量控制。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6任一項所述的方法，其中，該方法在體外實施。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7任一項所述的方法，其中，所述方法的步驟按照所示的順序?qū)嵤?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求I至8任一項所述的方法，其中，所述方法由所示步驟組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9任一項所述的方法，進(jìn)一步包括通過所述方法用合成器或手動確定和/或定量而合成至少有一個MHC配體肽的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其進(jìn)一步包括測試所述MHC配體肽作為免疫原性合成肽的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至11任一項所述的方法，其中，所述樣本從各自個人身上所得。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其進(jìn)一步包括基于識別和/或量化的所述MHC配體肽生成個性化MHC配體譜，優(yōu)選為個性化疾病特異性MHC配體譜。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至13任一項所述的方法，其中，所述識別序列總數(shù)以及各個區(qū)有小變化的序列數(shù)量聞于5,優(yōu)選為聞于25,更優(yōu)選為聞于50,最更優(yōu)選為聞于100。
全文摘要
本發(fā)明涉及從大規(guī)模原發(fā)組織標(biāo)本中定量識別相關(guān)HLA-結(jié)合肽抗原而無需標(biāo)記的一種方法。該方法不僅可用于開發(fā)肽疫苗，而且對分子免疫監(jiān)測和識別任何免疫治療策略中的新抗原也有非常高的價值，其中，HLA限制抗原決定簇作為靶標(biāo)，如癌癥或傳染病和自身免疫性疾病中各種亞基疫苗或T-細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移方法。
文檔編號G01N33/68GK102939540SQ201180018775
公開日2013年2月20日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者托尼·懷申克, 延斯·弗里切 申請人:伊瑪提克斯生物技術(shù)有限公司