專利名稱：分泌抗番茄黃化曲葉病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番茄是全球重要的蔬菜作物，它品種多，適應(yīng)性廣，營(yíng)養(yǎng)豐富，是全世界總產(chǎn)量最高的30種農(nóng)作物之一。雙生病毒對(duì)番茄的危害是番茄生產(chǎn)的重要制約因素之一，尤其是近幾十年來(lái)雙生病毒病在全球范圍的擴(kuò)展蔓延導(dǎo)致其在番茄上的危害日趨嚴(yán)重。在所有侵染番茄的雙生病毒中，番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, ITLCV)危害最為嚴(yán)重。ITLCV最早于1964年在以色列被發(fā)現(xiàn)并正式命名，之后的30年間該病害迅速擴(kuò)散到中東、地中海沿岸、東南亞地區(qū)、美國(guó)、日本、澳大利亞、印度、墨西哥等眾多國(guó)家和地區(qū)。20世紀(jì)90年代中期，隨著雙生病毒的傳毒介體一B型煙粉虱入侵我國(guó)，導(dǎo)致煙粉虱傳番茄雙生病毒在我國(guó)由東向西、由南向北急速蔓延，嚴(yán)重威脅我國(guó)產(chǎn)值近千億元的番茄產(chǎn)業(yè)。2005年秋，ITLCV首次在廣西番茄主產(chǎn)區(qū)百色市田陽(yáng)鎮(zhèn)大面積爆發(fā)，2006年在上海、 江蘇和浙江等地相繼被發(fā)現(xiàn)，之后迅速擴(kuò)展至安徽、山東、河南、河北、廣東、重慶、云南、福建、遼寧和北京等地。目前全國(guó)已有15個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)發(fā)現(xiàn)該病毒的危害現(xiàn)象，已造成嚴(yán)重?fù)p失的地區(qū)有浙江、江蘇、安徽、山東、河南和河北等省。番茄黃化曲葉病由番茄黃化曲葉病毒(ITLCV)引起，該病毒隸屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬 (Begomovirus),具有典型的雙生病毒孿生顆粒形態(tài)，病毒粒子的大小約為20 X 30 nm。其基因組結(jié)構(gòu)組成因不同分離物而分為單組份或雙組份。病毒鏈上的AVl基因編碼病毒的外殼蛋白(Coat protein，CP)，與病毒粒子的包裝、介體傳毒、系統(tǒng)侵染及與寄主的互作相關(guān)。感染TYLCV的植株發(fā)病癥狀與病毒分離物、寄主的遺傳背景、生長(zhǎng)階段以及環(huán)境條件有關(guān)，癥狀的表現(xiàn)會(huì)有所差異。發(fā)病植株的典型癥狀為頂部葉片變小、皺縮卷曲黃化，節(jié)間縮短，植株明顯矮化，開花延遲，花朵減少，坐果少而小，成熟期果實(shí)不能正常轉(zhuǎn)色，且成熟不均勻。 該病在番茄生長(zhǎng)各階段均可發(fā)生。若在開花前感病，果實(shí)產(chǎn)量和商品價(jià)值均大幅度下降，嚴(yán)重時(shí)造成的損失可達(dá)100 %。番茄黃化曲葉病毒主要通過(guò)B型煙粉虱傳播，煙粉虱獲毒后可終生傳毒，但不經(jīng)卵傳，研究表明嫁接也可導(dǎo)致病毒的傳播，但不能經(jīng)機(jī)械摩擦或種子傳毒。ITLCV寄主很廣，據(jù)報(bào)道能夠侵染包括栽培作物以及雜草在內(nèi)的12個(gè)科的30多種植物，一些無(wú)癥帶毒的雜草和野生植物往往成為下茬番茄作物的侵染源，同時(shí)傳播介體煙粉虱也具有很廣的寄主范圍。加上各地區(qū)氣候條件、品種和栽培方式有所不同，單憑一種方法很難達(dá)到有效防治效果，因而對(duì)TYLCV的防治應(yīng)采用因地制宜的綜合防治措施，為此建立一套靈敏、快速的病毒檢測(cè)方法對(duì)該病毒的監(jiān)控和防治具有重要的意義。而目前僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法和核酸雜交等方法對(duì)小樣本進(jìn)行病毒檢測(cè)。本發(fā)明以原核表達(dá)的TYLCV衣殼蛋白(CP)為抗原通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了 1株抗TYLCV的特異性單克隆抗體， 以制備的單抗為核心建立了檢測(cè)ITLCV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間ITLCV 的檢測(cè)，從而為我國(guó)番茄黃花病毒病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，防控策略提供物質(zhì)和技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗番茄黃花曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)為CGMCC No. 5538, 它能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá) 10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與番茄黃化曲葉病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)?？狗腰S化曲葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果1)提供的雜交瘤細(xì)胞株能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、 Tissue-ELISA、和TAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、 靈敏的檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物中番茄黃化曲葉病毒的檢測(cè)。


圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)番茄ITLCV的靈敏度分析；
圖2是Tissue-blot ELISA方法檢測(cè)番茄樣品中ITLCV的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，于2011年11月觀日，保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 5538，它能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá) 10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與番茄黃化曲葉病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量分泌抗番茄黃化曲葉病毒單抗，且該單抗特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測(cè)TYLCV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間TYLCV的檢測(cè)，從而為我國(guó)番茄黃化曲葉病的早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、科學(xué)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備 1.免疫原的制備
根據(jù)已報(bào)道的ITLCV-SH2編碼外殼蛋白基因序列(登錄號(hào))設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物CP-F (5，-AATGGATCCATGTCGAAGCGACC-3’，劃線部分為 BamHI 酶切位點(diǎn))和 CP-R (5，-CCCAAGCTTTTAATTTGATATTG-3，，劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn))，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。利用CTAB法提取番茄病樣的基因組總DNA，以總DNA為模板，進(jìn)行常規(guī) PCR 擴(kuò)增，S卩模板 μ ，5XPrimeSTARTM Buffer (含]\%2+)10μ1，dNTP Μ χ4μ1,PrimeSTARTM DNA Polymerase (2.5 U/μ L) 0. 5μ1，上下游引物各 μ ，最后雙蒸無(wú)菌水補(bǔ)足反應(yīng)終體積為50μ1。PCR反應(yīng)體系如下預(yù)變性94°C 2 min，變性94°C 30 s，退火52°C 45 s，延伸72°C 1 min，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后延伸72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于0. 8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并用PCR凝膠回收試劑盒(AxyGEN)回收DNA片段，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將純化的PCR產(chǎn)物末端加A與克隆載體pMD-18T vector連接，重組質(zhì)粒命名為PMD18-T-CP，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α的感受態(tài)細(xì)胞中，用質(zhì)粒提取試劑盒(AxyGEN) 提取重組質(zhì)粒，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體pMDIS-T-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框的正確性，序列分析軟件為DNAstar、 NCBI-BLAST,所用的數(shù)據(jù)庫(kù)為GeneBank等。重組質(zhì)粒pMD18_T_CP中CP基因片段經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切后定向插入經(jīng)同樣酶切的ρΕΤ-3^ι表達(dá)載體中。PCR、酶切篩選陽(yáng)性克隆，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證重組原核表達(dá)載體pET-32a-CP中所攜帶CP基因序列未突變且讀碼框正確。并把原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CP 42°C熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)中， 挑取單菌落接種到含氨卞青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，按1 : 100的比例將培養(yǎng)物接種于含氨卞青霉素抗性的新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D600 ^ 0. 5，加入終濃度為1 mmol . L-I IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體。部分菌體加入1 X SDS-PAGE上樣緩沖液懸浮，沸水中處理5-10 min, 12 000 rpm離心后取上清10 μ 進(jìn)行12. 5% SDS-PAGE 電泳分析，其余菌體經(jīng)超聲波破碎，收集上清按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行用M2+-NTA親和層析柱純化目的蛋白。以純化的重組CP蛋白作為免疫原及檢測(cè)抗原。2.免疫動(dòng)物
用純化的ITLCV-CP蛋白免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠純化的CP蛋白以生理鹽水稀釋與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0. 2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射 0. 2ml每只，過(guò)3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10 1的比例，在無(wú)血清的 RPMI-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無(wú)血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 37°C，5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時(shí)，以表達(dá)純化的ITLCV-CP為包被抗原用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲60多個(gè)陽(yáng)性孔。選擇5個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得1株能分泌抗TYLCV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株D10。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。5.單克隆抗體的特異性檢測(cè)
用感染中國(guó)番木瓜曲葉病毒(PaLCuCNV)、煙草曲莖病毒(TbCSV)、中國(guó)勝紅薊黃脈病毒(AYVCNV)、臺(tái)灣番茄曲葉病毒(ToLCTWV)和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒(ITLCCNV)的組織提取液包被ELISA反應(yīng)板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對(duì)照，以感染番茄黃化曲葉病毒的番茄病汁葉為陽(yáng)性對(duì)照，用間接ELISA法測(cè)定單抗的特異性反應(yīng)。間接ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后 IOOul/孔包被ELISA板，4°C過(guò)夜或37°C 2小時(shí)，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6%牛血清封閉30-60min;加入單抗IOOul/孔， 370C 1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說(shuō)明書稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)IOOul/孔，37°C 1-2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色， 2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2. 1為陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DlO單抗對(duì)TYLCV有特異性反應(yīng)，而與PaLCuCNV、TbCSV、AYVCNV、ToLCTWV和 TYLCCNV其他病毒均無(wú)特異性反應(yīng)。6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入 5-10 X IO5個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心 3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0. 06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清1小時(shí)，12000rpm離心20min， 收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動(dòng)透析M小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，_70°C保存。7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果為DlO單抗亞類為IgGl、kappa鏈。用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，結(jié)果為上述單抗腹水效價(jià)在10 —6以上。二、病毒檢測(cè)免疫學(xué)方法及其試劑盒
1.用單抗建立的抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測(cè)病毒 ACP-ELISA方法的操作步驟
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)按1:20 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液進(jìn)行包被，即100 μ L每孔加至酶標(biāo)板，TYLCV病葉為陽(yáng)性對(duì)照，相應(yīng)健葉為陰性對(duì)照，37°C 2h，或 4°C過(guò)夜；
(2)PBST洗滌后用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后IOOul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入5000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗 (Sigma), IOOul/ 孔，37°C，Ih ；
(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物IOOul/孔，室溫30min；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，或用2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)0D405值，以P/N> 2. 1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。ACP-ELISA方法檢測(cè)靈敏度檢測(cè)單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對(duì)病葉從1 :10至5120作倍比稀釋，以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對(duì)照，進(jìn)行上述ACP-ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對(duì) 1 10 640倍稀釋的病葉汁液呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到1 :640，表明 ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。2.檢測(cè) TYLCV 的 TAS-ELISA 檢測(cè)方法 2. 1. TAS-ELISA方法的操作流程
(1)抗TYLCV-CP的兔抗血清1 3000倍稀釋后(由純化的原核表達(dá)TYLCV-CP免疫兔子制備)IOOul/孔包被聚苯乙烯板，37°C，2-4h或4°C，過(guò)夜；
(2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6%牛血清封閉200ul/孔于 37 °C 封閉 30-60min ；
(3)加入檢測(cè)樣品IOOul/孔。以TYLCV病葉為陽(yáng)性對(duì)照，以相應(yīng)的健康樣品作陰性對(duì)照，37°C l-2h ；
(4)洗滌后用封閉液5000倍稀釋單抗腹水，IOOul/孔，37°Cl-2h ；
(5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(Sigma) IOOul/孔，37°C l-2h ；
(6)PBST洗滌后拍干，加PNPP底物于室溫顯色5-30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)405nm的OD值，以 P/N> 2. 1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。2. 2. TAS-ELISA檢測(cè)方法最適條件的確定
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向加用包被緩沖液從1 : 100至1 : 128000倍比稀釋的兔抗TYLCV血清；ITLCV病葉汁勻漿液；縱向加用封閉液從1 : 1000至1 : 512000 倍比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說(shuō)明書稀釋，1 10000倍；按 TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果為TYLCV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為1 : 3000、1 5000。2. 3. TAS-ELISA方法檢測(cè)靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將TYLCV病葉汁用含3% BSA的PBS倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測(cè)定，結(jié)果為TAS-ELISA檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1 2560倍稀釋(w/V， g /mL)，說(shuō)明本方法具有很好的靈敏度。3. dot-ELISA方法的建立及田間檢測(cè)應(yīng)用
將番茄葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1 10 30 (w/v, g /mL)加入0. 01 mol/L PBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ 1上清點(diǎn)到NC膜上，同時(shí)設(shè)置健康和感病番茄葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入1 5000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ；用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC 膜放入1 8000倍稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min ； PBST洗膜4 5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0. 1 mol/L Tris CU0. 1 mol/L NaCl,0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。用方陣試驗(yàn)確定dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明DlO單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)TYLCV病葉的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)番茄葉片稀釋到1 320倍(w/ ν, g/mL)時(shí)，以DlO單抗建立的dot-ELISA檢測(cè)仍呈現(xiàn)紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:320倍稀釋(圖1)。
4. Tissue-blot ELISA (組織印跡ELISA)檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒方法及其試劑盒 4.1 Tissue-blot ELISA 檢測(cè)方法
Tissue-blot ELISA檢測(cè)方法中將硝酸纖維素膜剪成適當(dāng)大小，鋪墊在三層干凈的吸水紙上。將植物組織用刀片迅速橫切，將橫切面在膜上壓印;Γ5 s，其中葉片需緊卷成筒后用刀片橫切。其后膜干燥、單抗孵育、二抗孵育、顯色步驟與dot-ELISA檢測(cè)番茄中ITLCV 方法相同。用建立的Tissue-blot ELISA方法對(duì)2011年采自番茄發(fā)病田間或大棚的疑似帶毒樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，82個(gè)水稻檢測(cè)樣品中有M個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn) (圖2)，陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的Tissue-blot陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到 ITLCV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染ITLCV。說(shuō)明該Tissue-blot 方法能準(zhǔn)確、可靠地用于番茄樣品中番茄黃化曲葉病毒的檢測(cè)。4. 2檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒Tissue-blot ELISA試劑盒
1)試劑盒主要成分
TYLCV單克隆抗體1管0. 2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗 1管0. 1 ml
NBT/BCIP底物各1瓶分別為2 ml和Iml
陽(yáng)性對(duì)照1 (ITLCV番茄組織)1管2 ml
陰性對(duì)照1 (健康番茄組織)1管2 ml
抗體稀釋液(IOX)I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)操作步驟
a.將硝酸纖維素膜放在吸水紙上；
b.將植物組織用刀片迅速橫切，將橫切面在膜上壓印3 5s，其中葉片需緊卷成筒后用刀片橫切；
c.同時(shí)設(shè)置健康和感病番茄分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，膜室溫干燥10 20min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1 5000倍稀釋的單抗中室溫孵育30 60 min ；
f.用PBST洗膜3 4次，每次3min ； NC膜放入1 8000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min;
g.PBST洗膜4 5次，每次3 min ； 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0. 1 mol/L Tris CU0. 1 mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；h.待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(紫色)，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記
錄結(jié)果。3)保存及有效期于2 8°C避光保存，有效期12個(gè)月。4)緩沖液配方
磷酸鹽緩沖液(PBS，0. 01 mol/L, ρΗ7· 4)
NaCl8 g
KCl0. 2 g
KH2PO40. 2 g
Na2HPO4* 12H203g
疊氮化鈉0. 2 g
加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至7. 4，定容至1000 ml
洗滌液(0. 01 mol/L PBST)
1000 ml 0. 01mol/L PBS 中力口 0. 5 ml Tween-20
封閉液
0.01 mol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
權(quán)利要求
1.一種分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)為CGMCC No. 5538，其特征在于能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa 鏈，該單克隆抗體能與番茄黃化曲葉病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。
3.—種如權(quán)利要求2所述的抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用， 其特征在于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用?？寺×朔腰S化曲葉病毒上海分離物(TYLCV-SH2)的外殼蛋白基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了該病毒的外殼蛋白，用表達(dá)純化的蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗TYLCV單抗的雜交瘤細(xì)胞株D10，其保藏號(hào)為CGMCCNo.5538。D10單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10-6以上，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。利用D10單抗建立的檢測(cè)番茄中TYLCV的dot-ELISA檢測(cè)方法，當(dāng)病葉1:320倍稀釋(w/v,g/mL)時(shí)仍能檢測(cè)到病毒。建立的dot-ELISA和Tissue-blotELISA方法能準(zhǔn)確、特異、靈敏地檢測(cè)田間番茄樣品中的TYLCV病毒。抗TYLCV單抗的制備及其檢測(cè)方法的建立為該番茄病毒病的診斷、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102559603SQ20121000419
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉歡, 吳建祥, 周雪平, 尚海麗, 謝艷 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)