專利名稱：壓載水排放浮游動物活體的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水樣中浮游動物活體的鑒別方法，具體地，本發(fā)明涉及壓載水排放的浮游動物活體的鑒別方法。
背景技術(shù)：
壓載水是指為控制船舶縱傾、橫傾、吃水、穩(wěn)性或應(yīng)力而在船上加裝的水及其懸浮物。船舶到岸時為空出噸位，必須將壓載水排入到岸國的海域中。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全球船舶每年攜帶的壓載水約有120億噸，壓載水和壓載艙的沉積物中含有大量的生物和微生 物，包括了細菌、藻類、原生動物、浮游生物及其他生物。平均每立方米壓載水含有的浮游動物超過I億個，全世界每天存在于船舶壓載水中隨船舶被擴散到世界各地海域的海洋生物約有7000種，許多細菌、動物和植物經(jīng)過數(shù)月的航程仍存活于壓載水及其沉積物中，當船舶到港口裝貨時，這些生物隨著壓載水被排放到港口國水域。船舶壓載水排放的生物可能會捕食本地物種，改變生活環(huán)境或改變環(huán)境條件(如降低水的透明度)，取代本地物種，減少本地生物多樣性，甚至造成本地物種的滅絕、整個生態(tài)系統(tǒng)的破壞等；船舶壓載水排放的物種也可能造成降低海產(chǎn)品產(chǎn)量等直接經(jīng)濟損失，造成與人類健康生態(tài)影響有關(guān)的間接經(jīng)濟損失；船舶壓載水排放的微生物轉(zhuǎn)移可能會形成可怕的威脅，壓載水除了攜帶細菌和病毒外，還會傳輸一些微藻類，包括可能形成有害的藻花或赤潮的有毒種類，這些病原體和微生物可能弓I起人類嚴重的疾病甚至死亡。因此隨著國際貿(mào)易和航海運輸業(yè)的快速發(fā)展，壓載水在國際間的裝載和排放不斷增多，船舶壓載水攜帶外來生物和病原體造成的衛(wèi)生、環(huán)保、海洋生態(tài)等問題越來越受到國際組織和世界各國的關(guān)注。根據(jù)《船舶壓載水和沉積物控制和管理國際公約(草案)》，第D-2條壓載水執(zhí)行標準。根據(jù)本條進行壓載水管理的船舶壓載水中活體生物的排放量被設(shè)定為限值。其中第一條規(guī)定活體生物最小尺寸>50 μ m的個體濃度< 10個/m3，活體生物最小尺寸為10 50 μ m的個體濃度< 10個/ml。標準中要求的是活體生物濃度，這就要求在短時間內(nèi)，將壓載水中種類繁多的生物種類區(qū)分死活，并將生物的個數(shù)進行加和，在現(xiàn)有的檢測技術(shù)條件下，這是一個很大的挑戰(zhàn)。然而現(xiàn)階段對于壓載水浮游動物是否活體的鑒定則是對管理船舶壓載水的關(guān)鍵一環(huán)。活體浮游動物的鑒別方法上，國內(nèi)更是缺乏規(guī)范快捷的操作方法。為此方面的科研工作造成了一定的難度。現(xiàn)有技術(shù)在檢測海洋浮游生物活性時，一般使用鏡檢目測的方法，該方法通常耗時長、繁瑣且主觀性強、準確度低，對于檢測結(jié)果較難正確檢驗核實。而起還有較高的成本和對使用者可能造成有毒危害的弊端，其檢測效果也較差，檢測后結(jié)果也不穩(wěn)定。因此需要一種簡便、快捷和結(jié)果可靠的檢測壓載水中排放浮游動物的鑒別方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)在檢測海洋浮游生物活性時，所使用方法通常耗時長且繁瑣，還有較高的成本和對使用者可能造成有毒危害的弊端，其檢測效果也較差，檢測后結(jié)果也不穩(wěn)定的缺陷，提供一種簡便、快捷和結(jié)果可靠的檢測方法本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)壓載水排放的浮游動物活體的鑒別方法，包括以下步驟(I)在采集的每60ml浮游動物水樣中滴加I 2%浮游動物染色溶液I. 0-2. Oml,進行染色；(2)再向水樣中滴加福爾馬林溶液進行樣品固定；(3)將樣品混勻后，取樣品進行鏡檢，并計數(shù)。在本發(fā)明的一實施方式中，所述I 2%浮游動物染色溶液的制備方法為稱取Ig 2g碘化鉀、O. 25g O. 50g碘溶于IOOml I. 5%詹納斯綠B溶液，其中所述詹納斯綠B溶液是通過將詹納斯綠B溶于由氯化鈉、氯化鉀和蒸餾水制備而成的IOOml緩沖液，稍加熱使之溶解，過濾，其中所述緩沖液。優(yōu)選地，所述浮游動物染色溶液的濃度為I. 5%。在本發(fā)明的一實施方式中，所述加熱的溫度范圍是40°C -45°C。在本發(fā)明的一實施方式中，所述緩沖液的組分含量為氯化鈉l_2g氯化鉀O. 25-0. 50g蒸餾水100ml。在本發(fā)明的一實施方式中，所述步驟(I)中的染色的時間為20_30min。在本發(fā)明的一實施方式中，所述步驟(2)中的福爾馬林溶液的體積百分比濃度為5%。本發(fā)明所述的詹納斯綠B(即詹納斯綠B，又稱健那綠)為市售產(chǎn)品。本發(fā)明所采用的試劑、溶劑等均可從市售途徑購買得到。本發(fā)明所述的詹納斯綠B染色溶液的“ ％ ”是指質(zhì)量百分比。本發(fā)明的有益效果是，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法的整個染色過程更加快速、簡化，對使用者安全，且成本較低、效果明顯，極易區(qū)分出浮游動物是否活體。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例I對壓載水中浮游動物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的浮游動物活體進行的檢測。I 試劑I. I (I)制備詹納斯綠B染色溶液氯化鈉I. OOg氯化鉀O. 25g蒸餾水IOOml
先將氯化鈉、氯化鉀分別溶于少量蒸餾水中，混合后用蒸餾水稀釋到100ml。(2) I. 5 %詹納斯綠B溶液稱取I. 5g詹納斯綠B溶于IOOml緩沖液，在40°C _45°C稍加熱，使之很快溶解，用濾紙(定性濾紙)過濾，即為I. 5%詹納斯綠B溶液(一般配置后避光保存，以保持其充分氧化能力，有效期為20天)。
I. 31. 5%浮游動物染色液稱取碘化鉀I. 5g，碘O. 375g加入IOOml I. 5 %詹納斯綠B溶液中，待完全溶解后即為配置完畢的浮游動物染色液(配置后避光保存，有效期為7天。)2染色步驟2. I從壓載水中采集浮游動物水樣(3組平行水樣)，每升水樣中滴加I. 5 %浮游動物染色溶液I. 5ml，染色30min ；2. 2再向水樣中滴加5%福爾馬林溶液進行樣品固定；2. 3將樣品搖動5min，確保樣品混勻后，取樣品Iml于IOX鏡下觀察到固定前活體浮游動物具線粒體部位呈較淺的藍色，其余部位保持原有體色，而固定前死體浮游動物周身幾乎均呈墨藍色。對于壓載水中浮游動物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活體浮游動物染色固定后身體局部呈淺藍色，死體浮游動物染色固定后周身呈墨藍色。實施例2本實施例的試劑和方法與實施例I的大體相同，不同之處在于在染色步驟2. I中向每組每升水樣中滴加I. O %浮游動物染色溶液為I. Oml (Ig碘化鉀，O. 25g碘加入IOOml
I.5%詹納斯綠B溶液)。對于壓載水中浮游動物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活體浮游動物染色固定后身體局部呈較淺藍色，死體浮游動物染色固定后周身呈深藍色。實施例3本實施例的試劑和方法與實施例I的大體相同，不同之處在于在染色步驟2. I中向每組每升水樣中滴加的2. O %浮游動物染色溶液為2. Oml (2g碘化鉀，O. 5g碘加入IOOml
I.5%詹納斯綠B溶液)。對于壓載水中浮游動物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活體浮游動物染色固定后身體局部呈較深藍色，死體浮游動物染色固定后周身呈深墨藍色。對照實施例對于壓載水中浮游動物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的直接鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于死亡不久的浮游動物細胞體內(nèi)葉綠素等細胞器仍相對完整，易將其判定為活體；但隨著固定時間的延長，葉綠體等細胞器會隨浮游動物細胞內(nèi)外滲透壓的變化而破裂消失。從而出現(xiàn)同一組樣品不同時間鏡檢存在一定的誤差，第一次鏡檢時發(fā)現(xiàn)活體浮游動物為168個，死亡的浮游動物個體數(shù)為72個，8小時后鏡檢發(fā)現(xiàn)活體浮游動物為88個，死亡的浮游動物個體數(shù)為152個。且鏡檢耗時長。由實施例1-3與對照實施例對同一組樣品浮游動物活體的個體濃度檢測結(jié)果比較，可以得出本發(fā)明的方法具有“快速、簡化、效果明顯、極易區(qū)分出浮游動物是否活體且穩(wěn)定性好、誤差值小”等優(yōu)點。且本發(fā)明采用的試劑均為市售的較廉價的試劑，從而使得本發(fā)明的方法所消耗的成本大大降低。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。權(quán)利要求
1.壓載水排放浮游動物活體的鑒別方法，包括以下步驟 (1)在采集的每60ml浮游動物水樣中滴加I 2%浮游動物染色溶液I.0-2. 0ml，進行染色； (2)再向水樣中滴加福爾馬林溶液進行樣品固定； (3)將樣品混勻后，取樣品進行鏡檢，并計數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述I 2%浮游動物染色溶液的制備方法為稱取Ig 2g碘化鉀、O. 25g O. 50g碘溶于IOOml I. 5%詹納斯綠B溶液，其中所述詹納斯綠B溶液是通過將詹納斯綠B溶于由氯化鈉、氯化鉀和蒸餾水制備而成的IOOml緩沖液，稍加熱使之溶解，過濾，其中所述緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述浮游動物染色溶液的濃度為1.5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述加熱的溫度范圍是40°C_45°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的組分含量為 氯化鈉l-2g氯化鉀 O. 25-0. 50g 蒸懼水100ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的染色的時間為20_30mino
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的福爾馬林溶液的體積百分比濃度為5%。
全文摘要
本發(fā)明提供壓載水排放的浮游動物活體的鑒別方法，包括以下步驟(1)在采集的每60ml浮游動物水樣中滴加1～2％浮游動物染色溶液1.0-2.0ml，進行染色；(2)再向水樣中滴加福爾馬林溶液進行樣品固定；(3)將樣品混勻后，取樣品進行鏡檢，并計數(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法的整個染色過程更加快速、簡化，且成本較低、效果明顯，極易區(qū)分出浮游動物是否活體。
文檔編號G01N1/30GK102636487SQ20121008146
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者劉艷, 吳惠仙, 薛俊增 申請人:上海海洋大學(xué)