專利名稱：肽選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于選擇耐受原性(tolerogenic)肽的方法、由該方法鑒定的肽，及其在疾病治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及含有多種此類耐受原性肽的藥物組合物。
背景技術(shù)：
在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，T淋巴細(xì)胞能夠識別蛋白抗原的內(nèi)部表位?？乖蔬f細(xì)胞(APC)攝取蛋白抗原，并將其降解成短肽段。肽與細(xì)胞內(nèi)的I類或II類主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合，并被運(yùn)送到細(xì)胞表面。當(dāng)該肽與MHC分子一同被呈遞到細(xì)胞表面時能夠被T細(xì)胞識別(通過T細(xì)胞受體(TCR))，此時，該肽可作為一種T細(xì)胞表位。在對所有自身抗原或外源抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，T細(xì)胞表位都具有主要作用。通過使用實驗?zāi)Ｐ鸵炎C明了 T細(xì)胞表位在過敏性疾病(包括變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病和移植排異)中的重要作用。用合成的肽(根據(jù)T細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu))結(jié)合佐劑進(jìn)行注射有可能弓I發(fā)炎性或變應(yīng)性疾病。反之，研究表明，將可溶形式的肽表位給藥有可能導(dǎo)致針對特定肽表位的免疫耐受性。目前已證明，可溶性肽抗原給藥可作為一種抑制疾病的有效方法，用于實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE——多發(fā)性硬化癥(MS)的一種模型)(Metzler and Wraith (1993) Int.Tmmunol · 5 :1159-1165 ；Liu and Wraith (1995) Int. Tmmunol · 7 1255-1263 ；Anderton andWraith (1998)Eur. J. Immunol. 28 :1251-1261);以及關(guān)節(jié)炎、糖尿病和色素層視網(wǎng)膜炎的實驗?zāi)Ｐ?見上文Anderton and Wraith (1998)的綜述)。此外還可作為進(jìn)展性EAE疾病的治療手段(上文 Anderton and Wraith (1998))。耐受原性肽在治療或預(yù)防疾病中的用途已引起了相當(dāng)大的關(guān)注。原因之一是已發(fā)現(xiàn)某些耐受原性表位能夠下調(diào)T細(xì)胞對相同組織內(nèi)不同抗原的應(yīng)答。這種被稱為“旁觀者(bystander)抑制”的現(xiàn)象說明，利用特定的耐受原性肽有可能會誘導(dǎo)針對特定抗原內(nèi)一種以上表位(優(yōu)選的是所有表位)以及特定疾病中一種以上抗原的耐受性(上文Andertonand Wraith(1998)) 0這樣就無需對特定疾病中的所有致病性抗原進(jìn)行鑒定。此外，肽是用于治療的良好選擇，因為其成本相對低廉，并且能夠產(chǎn)生免疫學(xué)性質(zhì)不同的肽類似物。這樣就可以對肽進(jìn)行修飾，以改變其與MHC或TCR的相互作用。該方法可能存在的問題之一是，研究表明，并不是所有可充當(dāng)T細(xì)胞表位的肽都 能夠誘導(dǎo)耐受性。免疫后的髓磷脂堿性蛋白(MBP)肽89-101是一種免疫優(yōu)勢抗原，并且從引發(fā)T細(xì)胞活性和誘導(dǎo)EAE方面來看都是一種非常有效的免疫原。但研究表明，當(dāng)以溶液形式給藥時，這種肽不能誘導(dǎo)耐受性(上文Anderton and Wraith (1998))。在T細(xì)胞表位能夠誘導(dǎo)耐受性方面，已針對觀測到的分級結(jié)構(gòu)提出了多種解釋(見上文Anderton and Wraith (1998)的綜述)。具體地說，有人認(rèn)為肽對MHC的親和力與其耐受原性之間存在相關(guān)性(上文Liu and Wraith (1995))，但該觀點與一些觀測結(jié)果不吻合。例如，MBP[89-101]能夠以相對較高的親和力與I-As結(jié)合，但不具有耐受原性。因而并不能直接預(yù)測哪些肽能夠誘導(dǎo)耐受性。如果有一種合理的解釋來說明只有部分肽表位能夠誘導(dǎo)耐受性，則有助于選擇那些能夠有效地用于治療和預(yù)防過敏性病癥的耐受原性肽。發(fā)明概述
本發(fā)明人證明，如果一種肽表位具有不經(jīng)抗原加工即可被未成熟APC呈遞的適當(dāng)大小，則這種肽表位能夠誘導(dǎo)免疫耐受性。因此，一些T細(xì)胞表位具有耐受原性而其他T細(xì)胞表位不能誘導(dǎo)耐受性的觀測結(jié)果可由以下事實來加以解釋，即某些表位需經(jīng)過進(jìn)一步加工，然后才能夠被MHC分子呈遞。這些需要進(jìn)一步加工的表位盡管與佐劑協(xié)同注射時能夠誘導(dǎo)疾病，但是以可溶形式給藥時不能誘導(dǎo)耐受性。不需要進(jìn)一步加工的表位則能夠誘導(dǎo)耐受性，本發(fā)明人將其命名為“apitopes” (抗原加工非依賴性表位)。該發(fā)現(xiàn)為選擇耐受原性T細(xì)胞表位提供了一種基于規(guī)則的方法，該方法無需對肽的耐受原性能力進(jìn)行體內(nèi)檢測。這一點在用于治療或預(yù)防無可用動物模型的疾病的策略開發(fā)方面具有特別的優(yōu)勢。甚至對具有動物模型的疾病而言，該選擇方法也會使耐受原性成分的開發(fā)更加簡單和安全，因為它提供了一種機(jī)制，用于在體內(nèi)使用之前用人類T細(xì)胞(可識別與人類MHC分子結(jié)合的抗原)對肽的耐受性誘導(dǎo)能力進(jìn)行體外測試。第一方面，本發(fā)明提供一種用于選擇耐受原性肽的方法，該方法包括選擇一種無需進(jìn)一步加工即能夠與I類或II類MHC分子結(jié)合的肽的步驟。在一項優(yōu)選實施方案中，該肽無需進(jìn)一步加工即能夠與II類MHC分子結(jié)合。本領(lǐng)域有多種已知方法可用于篩選能夠充當(dāng)給定抗原的T細(xì)胞表位的肽。因此，本發(fā)明的方法通常用于從多種含有T細(xì)胞表位的肽中選擇一種耐受原性肽。為了檢測一種肽是否無需進(jìn)一步加工即能夠與I類或II類MHC分子結(jié)合，可以用抗原加工非依賴性呈遞系統(tǒng)(APIPS)對該肽與I類或II類MHC分子結(jié)合的能力進(jìn)行研究。因此，在一項優(yōu)選實施方案中，該方法包括以下步驟(i)用一種肽對APIPS進(jìn)行處理；并且(ii)分析APIPS中該肽與I類或I I類MHC分子的結(jié)合。第二方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明第一方面的方法所選擇的肽。該肽可用于疾病的治療和/或預(yù)防。具體地說，該肽可用于治療和/或預(yù)防由自反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。本發(fā)明的肽特別適用于治療/預(yù)防過敏性反應(yīng)，如變態(tài)反應(yīng)、自身免疫和移植排異。本發(fā)明人已確定了髓磷脂堿性蛋白的多個表位，該蛋白是多發(fā)性硬化癥中的一種自身抗原。因此，在一項特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽可用于治療和/或預(yù)防多發(fā)性
硬化癥。已知一些肽能夠誘導(dǎo)針對相同抗原上其他表位的耐受性，甚至可誘導(dǎo)針對不同抗原上其他表位的耐受性(通過被稱為旁觀者抑制的現(xiàn)象)。但本發(fā)明人預(yù)測，為了充分抑制所有自反應(yīng)性T細(xì)胞，將多種不同的apitopes聯(lián)合給藥于患者應(yīng)該有利于特定疾病的治療/預(yù)防。第三方面，本發(fā)明本發(fā)明提供一種藥物組合物，該組合物含有多種本發(fā)明第二方面所描述的肽，每種肽基于一種T細(xì)胞表位。第四方面，本發(fā)明提供一種方法，用于治療和/或預(yù)防主體所患的一種疾病，該方法包括將本發(fā)明第二方面所描述的肽給藥于該主體的步驟。治療和/或預(yù)防主體所患疾病的一般策略可包括以下步驟(i)確定該疾病的一種抗原；(ii)確定該抗原的一種apitope ;以及(iii)將該apitope給藥于該主體。附圖簡述 圖I顯示多發(fā)性硬化癥(MS)患者和健康個體對結(jié)核分支桿菌純化蛋白衍生物(PPD)和MBP的動力學(xué)曲線的典型實例。對分離自MS患者(A)和正常個體⑶的外周血單核細(xì)胞(PBMC)在PB)和全MBP存在情況下的增殖能力進(jìn)行測試；將反應(yīng)于MBP的增殖動力學(xué)曲線與反應(yīng)于第二抗原PPD的增殖動力學(xué)曲線進(jìn)行比較。圖2為MS患者中的PBMC對MBP及其肽產(chǎn)生應(yīng)答的總結(jié)表。對某些個體是在三個獨(dú)立的時間點進(jìn)行分析，每個時間點的間隔期約為4-7個月。圖3為健康個體中的PBMC對MBP及MBP肽產(chǎn)生應(yīng)答的總表。每個時間點的間隔期約為4-7個月。圖4顯示一名MS患者(MS49)的實例，該患者在2個不同的時間點對多種肽產(chǎn)生應(yīng)答，但在4個月之后測量的第二時間點期間的識別曲線明顯不同。在MBP和一組覆蓋全長MBP的肽存在的條件下培養(yǎng)PBMC，并通過3H-胸苷攝取量來測量增殖。在第一時間點觀測到的廣泛T細(xì)胞增殖應(yīng)答與7個月后(第二時間點)測量的應(yīng)答明顯不同。圖5顯示一名患者的實例，該患者的廣泛表位應(yīng)答(第一時間點)可以消退(第二時間點)，而在12個月的時間后(第三時間點)重新出現(xiàn)。圖6顯示由動力學(xué)應(yīng)答測定法確定的肽區(qū)域精確特異性圖譜，該結(jié)果是利用MS患者和健康個體產(chǎn)生的TCC獲得。用于篩選測定的大多數(shù)肽的長度為15個氨基酸殘基，但有少數(shù)為10個氨基酸殘基，有一種肽為17個氨基酸殘基。每種TCC的特異性至少測試了 2次。圖7a的表顯示髓磷脂堿性蛋白中能夠被MS患者的T淋巴細(xì)胞識別的T細(xì)胞表位的特性。圖7b的表顯不所有T細(xì)胞表位都不是必需被固定APC呈遞，因而不是apitopes。圖8和圖9顯示活體和固定APC將不同MBP肽呈遞至T細(xì)胞的情況。圖8A-30-44，圖 8B-110-124,圖 9A-130-144,圖 9B-156-170。

圖10的表顯示在3個獨(dú)立時間點獲得的MS患者體內(nèi)對MBP和MBP-肽的刺激指數(shù)
(SI)峰值。第二時間點的樣本是在第一時間點的4-8個月后收集，第三時間點的樣本是在第二時間點的3-5個月后收集。每天測量本底cpm，其變化范圍為80-700cpm ;確定陽性應(yīng)答(粗體字)的依據(jù)是SI > 3并且δ cpm > 1000。(不可能在所有3個時間點收集MS19和MS67的樣本)。圖11的表顯示健康個體對MBP和MBP-肽的刺激指數(shù)(SI)峰值。每天測量本底cpm，其變化范圍為80-700cpm;確定陽性應(yīng)答(粗體字)的依據(jù)是SI > 3并且dcpm > 1000。
圖12顯示由DR2 :MBP82_100轉(zhuǎn)基因小鼠分離的T細(xì)胞對APC呈遞77-100區(qū)嵌套MBP肽的應(yīng)答。圖13顯示T細(xì)胞克隆MS17 A3對APC呈遞125-148區(qū)嵌套MBP肽的應(yīng)答。圖14顯示MBP 89-101序列中的T細(xì)胞表位識別。該序列中有3個不同但又重疊的T細(xì)胞表位89-92、92-98和95-101。圖中顯示第94和95位殘基之間可能被天冬酰胺酰肽內(nèi)切酶(AEP)的作用剪切的位點。圖15顯示MBP肽87-96⑷和89-101⑶能夠充當(dāng)apitope，用于T細(xì)胞對89-94表位產(chǎn)生應(yīng)答。發(fā)明詳述
第一方面，本發(fā)明涉及一種用于選擇耐受原性肽的方法。耐受性文中使用的術(shù)語“耐受原性”是指能夠誘導(dǎo)耐受性。耐受性是指不對某種抗原產(chǎn)生應(yīng)答。對自身抗原的耐受性是免疫系統(tǒng)的一個基本特征，當(dāng)喪失這種耐受性時可導(dǎo)致自身免疫疾病。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)必須保持對大量不同的感染性因子產(chǎn)生應(yīng)答的能力，同時避免其自有組織中所含自身抗原的自身免疫攻擊。這在很大程度上是由未成熟T淋巴細(xì)胞對胸腺中凋亡性細(xì)胞死亡的敏感性來控制(中樞耐受性)。但是在胸腺中并不能檢測到所有自身抗原，因而只有自反應(yīng)性胸腺細(xì)胞死亡還不夠。因此，還有一些機(jī)制可以使外周組織的自反應(yīng)性成熟T淋巴細(xì)胞獲得耐受性(外周耐受性)。Anderton et al (1999) (Immunological Reviews 169 :123-137)對中樞耐受性和外周耐受性的機(jī)制進(jìn)行了綜述。耐受性的產(chǎn)生或鑒定方法是至少誘導(dǎo)部分CD4+T細(xì)胞的無反應(yīng)性。為了激活T細(xì)胞，肽必須與能夠?qū)煞N信號遞送至T細(xì)胞的“專職”APC相結(jié)合。第一種信號(信號I)由APC細(xì)胞表面的MHC-肽復(fù)合物遞送，并通過TCR被T細(xì)胞接收。第二種信號(信號2)由APC表面的⑶80和⑶86等輔助刺激分子遞送，并被T細(xì)胞表面的⑶28接收。當(dāng)T細(xì)胞在缺乏信號2的條件下接收信號I時不會被激活，實際上是成為無反應(yīng)性T細(xì)胞。無反應(yīng)性T細(xì)胞對隨后的抗原誘發(fā)具有不應(yīng)性，并且能抑制其他的免疫應(yīng)答。無反應(yīng)性T細(xì)胞被認(rèn)為與介導(dǎo)T細(xì)胞耐受性有關(guān)。盡管不希望受理論的約束，但本發(fā)明人預(yù)測，在與MHC分子一同被遞送之前需要加工的肽不能誘導(dǎo)耐受性，因為這些肽必須經(jīng)過成熟抗原呈遞細(xì)胞的處理。成熟抗原呈遞細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞)能夠?qū)乖M(jìn)行加工，而且能將信號I和信號2遞送至T細(xì)胞，從而導(dǎo)致T細(xì)胞激活。反之，apitopes能夠與未成熟APC上的II類MHC結(jié)合。因而無需共同刺激即能夠被呈遞至T細(xì)胞，從而導(dǎo)致T細(xì)胞無反應(yīng)性和耐受性。當(dāng)然，apitopes也能夠與成熟APC細(xì)胞表面的MHC分子結(jié)合。但免疫系統(tǒng)中包含未成熟APC的充裕程度要高于成熟APC (研究表明，被激活的樹突細(xì)胞還不到10 %，Summerset al. (2001) Am. J. Pathol. 159 :285-295)。因此，apitope 的默認(rèn)狀況是無反應(yīng)性 / 耐受性，而不是激活。研究表明，當(dāng)通過肽吸入來誘導(dǎo)耐受性時，抗原特異性CD4+T細(xì)胞的增殖能力下降。此外，這些細(xì)胞的IL-2、IFN-Y和IL-4產(chǎn)量被下調(diào)，但I(xiàn)L-10的產(chǎn)量提高。研究表明，在處于肽誘導(dǎo)耐受性狀態(tài)的小鼠中，IL-10的中和使小鼠完全恢復(fù)了對疾病的易感性。人們認(rèn)為，有一種始終處于耐受狀態(tài)的調(diào)節(jié)細(xì)胞群能夠產(chǎn)生IL-10，并介導(dǎo)免疫調(diào)控(Burkhartet al(1999)Int. Tmmunol. 11 1625-1634)。因此，可通過多種技術(shù)對耐受性的誘導(dǎo)進(jìn)行監(jiān)測，其中包括(a)對該肽在體內(nèi)充當(dāng)靶表位的疾病而言，降低接觸該疾病的易感性；(b) CD4+T細(xì)胞無反應(yīng)性的誘導(dǎo)(可通過隨后的抗原侵襲來進(jìn)行體外檢測)；(c)⑶4+T細(xì)胞群的改變，包括(i)增殖能力降低；(ii) IL-2、IFN- Y 和 IL-4 產(chǎn)量的下調(diào)；以及
(iii) IL-IO 產(chǎn)量提高?？乖庸し且蕾囆员砦?APITOPES)本發(fā)明所述方法的步驟包括，選擇一種無需進(jìn)一步加工即能夠與I類或II類MHC蛋白結(jié)合的肽。這些肽在文中被稱為“apitopes”(抗原加工非依賴性表位)。對來源于給定抗原的肽的細(xì)胞表面呈遞并不是隨機(jī)的，并且傾向于由少量經(jīng)常出現(xiàn)的表位占優(yōu)勢。特定肽的優(yōu)勢取決于多種因素，例如與MHC分子結(jié)合的相對親和力、在APC內(nèi)產(chǎn)生的時空點以及抗降解能力?？乖谋砦环旨壗Y(jié)構(gòu)可以隨免疫應(yīng)答的進(jìn)行而發(fā)生改變，這為自身耐受性和自身免疫疾病提供了重要的線索。免疫優(yōu)勢決定區(qū)可能是良好的耐受原。因此，在一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的apitope是基于一種優(yōu)勢表位。但是在對免疫優(yōu)勢肽產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答后，可能出現(xiàn)表位“擴(kuò)展”至亞優(yōu)勢決定簇的現(xiàn)象(Lehmann et al (1992) Nature 358:155-157)。亞優(yōu)勢表位的呈遞可能對觸發(fā)自身免疫具有重要作用。因此，本發(fā)明的apitope可基于一種亞優(yōu)勢決定簇。對所有給定抗原而言，也可能存在隱蔽表位。隱蔽表位是指那些以肽的形式給藥時能夠刺激T細(xì)胞應(yīng)答，但是以完整抗原的形式給藥時不能產(chǎn)生這種應(yīng)答的表位。在APC將抗原加工成肽的過程中，隱蔽表位可能被破壞。本發(fā)明人已證明，MBP的肽92-98是一種隱蔽表位(實施例2C)。有趣的是，在該肽區(qū)域內(nèi)推測含有一個天冬酰胺酰肽內(nèi)切酶剪切位點，這可能意味著APC在天然加工過程中沒有產(chǎn)生含有該區(qū)域的肽。隱蔽表位可作為一種體外apitope,因為它無需進(jìn)一步加工即能夠與MHC分子結(jié)合，并在識別該隱蔽表位的T細(xì)胞中誘導(dǎo)無反應(yīng)性。但這種表位不可能應(yīng)用于治療，因為它不能夠耐受可識別該抗原的天然加工表位的T細(xì)胞?？乖砦坏蔫b定方法可以是，測量T細(xì)胞對APC呈遞的覆蓋整個抗原的重疊肽(見下文)的應(yīng)答。這些研究通常是獲得肽“嵌套組”，通過測量對截短肽的應(yīng)答即可確定特定T細(xì)胞系/克隆的最小表位。并不能認(rèn)為抗原的最小表位會具有apitope的作用。很可能最小表位的側(cè)翼氨基酸是與MHC最佳結(jié)合所必需的。設(shè)計apitope時應(yīng)考慮到不同T細(xì)胞克隆的最小表位之間存在細(xì)微差別的可能性。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，可能無法確定所有表位的apitope。一個明顯的證據(jù)是，有些表位是以依賴于內(nèi)體中的MHC負(fù)載方式與MHC結(jié)合，因而需要加工(Viner et al. (1995)Proc.Natl. Acad. Sci. 92 =2214-2218)。這也是不能認(rèn)為每種最小表位都必然具有api tope作用的另一原因。鑒定含有T細(xì)胞表位的肽
本領(lǐng)域有多種已知方法可用于鑒定給定抗原中的T細(xì)胞表位。鑒定天然加工表位的方法可以是，對來源于帶有抗原的APC的肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。這些APC已經(jīng)過處理而促進(jìn)其攝取抗原，或是已通過轉(zhuǎn)化適當(dāng)基因而迫使其在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生該蛋白。通常是將APC與溶液中的或是適當(dāng)定向于APC細(xì)胞表面的蛋白共保溫。37°C保溫之后，在去污劑中將細(xì)胞裂解，并通過諸如親和層析法將II類蛋白純化。用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)介質(zhì)(如酸性條件)對純化MHC進(jìn)行處理，從而將肽由MHC洗脫。分離出這種肽合并物，并將其曲線與來自相同方式處理的對照APC的肽進(jìn)行比較。對蛋白表達(dá)/飼養(yǎng)細(xì)胞獨(dú)特的峰進(jìn)行分析(例如用質(zhì)譜法)，并對這些肽段進(jìn)行鑒定。利用該方法一般可獲得關(guān)于肽段抗原經(jīng)抗原呈遞而產(chǎn)生的肽的范圍信息(通常出現(xiàn)在“嵌套組”中)。鑒定表位的另一種方法是通過體外測定對重疊并且覆蓋該抗原全長的合成肽庫進(jìn)行篩選。例如，可以使用長度為15個氨基酸并且有5或10個氨基酸重疊的一些肽。用含有抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原呈遞系統(tǒng)對這些肽進(jìn)行測試。例如，該抗原呈遞系統(tǒng)可以是鼠脾細(xì)胞制品、人類扁桃體細(xì)胞制品或PBMC。作為選擇，該抗原呈遞系統(tǒng)還可含有特定的T細(xì)胞系/克隆和/或特定類型的抗原呈遞細(xì)胞。 T細(xì)胞激活可通過T細(xì)胞增殖(例如用3H-胸苷摻入法)或細(xì)胞因子產(chǎn)量來加以測定。舉例來說，THl型⑶4+T細(xì)胞的激活可通過IFN Y產(chǎn)量來檢測，其檢測可采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，如ELISP0T測定法。對重疊肽的研究一般會指明抗原中的表位定位區(qū)域。然后可測量對截短肽的應(yīng)答，以評定特定T細(xì)胞的最小表位。舉例來說，如果對重疊庫中含有第1-15位殘基的肽產(chǎn)生了應(yīng)答，則可以用兩端截短的肽組(即1-14、1-13、1-12等和2-15、3-15、4-15等)來確定最小表位。本發(fā)明人認(rèn)為，通過體外測定(特別是利用T細(xì)胞系)對抗原免疫優(yōu)勢區(qū)進(jìn)行檢測的方法會產(chǎn)生不對稱的肽活性模式。實施例中描述的用于確定MBP表位的研究是采用動力學(xué)應(yīng)答測定法，該方法是測量由MS患者和健康個體獲得的PBMC在重疊肽庫作用下的增殖。該方法的依據(jù)是，盡管由健康個體和MS患者獲得的T細(xì)胞對純化蛋白抗原的應(yīng)答方式類似，但它們對基于MBP序列的肽的應(yīng)答方式不同。與正常的健康供體相比，由MS患者獲得的T細(xì)胞對肽抗原的應(yīng)答具有更高的數(shù)量級和更快的動力學(xué)速度。因而能夠篩選和鑒定使特定患者在特定時間產(chǎn)生應(yīng)答的表位。在本文描述的研究中，該方法已揭示了利用常規(guī)技術(shù)未能確定的大量含有表位的區(qū)域。此外，該研究還說明，T細(xì)胞識別可表現(xiàn)為一種循環(huán)模式，在某一時間點出現(xiàn)，消退，繼而在后一時期重新出現(xiàn)。本發(fā)明人描述的動力學(xué)測定法可作為一種重要的工具，因為該方法可揭示患者在特定時間正在應(yīng)答的表位。該信息可用于為特定患者量身定制一種將apitope給藥的治療方法，即確定相關(guān)表位的apitope (如果存在)，并將其給藥。該信息還可用于擬定疾病的一般發(fā)展模式，從而可以對治療性組合物進(jìn)行設(shè)計，使其含有與可能在疾病的特定時期呈遞的表位相對應(yīng)的apitope?？乖庸し且蕾囆猿蔬f系統(tǒng)(APIPS)一旦確定了表位，下一步是要檢測其是否也具有apitope的作用。apitope必須在無需抗原加工的條件下被呈遞至T細(xì)胞。在確定了含有T細(xì)胞表位的肽之后，可以用一種無加工系統(tǒng)來確定apitope?？梢杂每乖庸し且蕾囆猿蔬f系統(tǒng)(APIPS)對截短肽和肽類似物的激活作用進(jìn)行測試。APIPS的實例包括a)固定的APC (含有或不含抗⑶28抗體)；b)含有I類或II類MHC分子的脂質(zhì)膜(含有或不含抗CD28抗體)；以及c)結(jié)合于平板的純化的天然或重組MHC (含有或不含抗⑶28抗體)。已知可以用固定的APC來研究T細(xì)胞應(yīng)答，例如在檢測多肽的最小表位的研究中，可以測量對截短肽的應(yīng)答(Fairchild et al (1996) Int. Immunol. 8 :1035-1043)。APC 的固定可采用，例如，甲醛(通常是多聚甲醛)或戊二醛。脂質(zhì)膜(可以是平面膜或脂質(zhì)體)的制備可采用人工脂，也可以是APC的質(zhì)膜/微粒體組分。 在使用時，可以將APIPS添加到組織培養(yǎng)板的孔中。然后添加肽抗原，并添加選定的T細(xì)胞系或克隆，以檢測該肽與APIPS的MHC部分的結(jié)合。T細(xì)胞系或克隆的激活可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來測定，如3H-胸苷摻入法或細(xì)胞因子分泌法。肽本發(fā)明的第二方面涉及一種肽。從正常意義上來說，術(shù)語“肽”是指一連串殘基，通常是L-氨基酸，這些殘基一般是通過相鄰氨基酸的α-氨基和羧基之間的肽鍵相繼連接。該術(shù)語還包括修飾的肽和合成的肽類似物。本發(fā)明的肽可以是無需進(jìn)一步加工即能夠與I類或II類MHC分子結(jié)合的任何長度。與I類MHC分子結(jié)合的肽的長度一般為7-13個氨基酸，更常見的是8_10個氨基酸。該肽的兩個末端可通過肽主鏈原子與所有I類MHC分子的肽結(jié)合溝不變位點之間的接觸而使其結(jié)合保持穩(wěn)定。在肽結(jié)合溝的兩端均有與肽氨基端和羧基端結(jié)合的不變位點。通過肽骨架的扭曲可以適應(yīng)不同的肽長度，這種扭曲通常出現(xiàn)在能夠滿足所需柔性的脯氨酸殘基或甘氨酸殘基。與II類MHC分子結(jié)合的肽的長度一般為8-20個氨基酸，更常見的是10_17個氨基酸，并且還可以長得多。這些肽沿著兩端開口的(與I類MHC肽結(jié)合溝不同)11類MHC肽結(jié)合溝以伸展的構(gòu)象存在。該肽主要是通過主鏈原子與沿著肽結(jié)合溝排列的保守殘基的接觸而保持在適當(dāng)?shù)奈恢?。本發(fā)明的肽可通過化學(xué)方法來制備(《肽化學(xué)實踐手冊》Mikos Bodansky,Springer-Verlag, Berlin)。舉例來說，肽的合成方法可以是固相技術(shù)(Roberge JY etal (1995) Science 269 :202-204)，從樹脂上裂解，并通過制備性高效液相色譜進(jìn)行純化(如 Creighton(1983)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理，WH Freeman and Co, New York NY)。還可以用，例如，ABI 431A肽合成儀(Perkin Elmer)根據(jù)廠商提供的說明來實現(xiàn)自動合成。作為選擇，還可采用重組方法或從較長多肽上剪切的方法來制備肽。例如，可采用從靶抗原上剪切的方法來獲得肽。肽的成分可通過氨基酸分析或測序(如Edman降解法)來加以確認(rèn)。在一項優(yōu)選實施方案中，該肽來源于一種靶抗原。靶抗原是指能夠在疾病過程中被APC加工并被T細(xì)胞識別的一種分子(如蛋白或糖蛋白)。當(dāng)然，靶抗原應(yīng)取決于目標(biāo)疾病。優(yōu)選的是該肽來源于一種通過APC對該抗原的天然加工而產(chǎn)生的抗原片段。出于實際應(yīng)用的目的，該肽還應(yīng)具有其他多種特性。例如，該肽應(yīng)能夠以允許體內(nèi)應(yīng)用的濃度溶解。優(yōu)選的是該肽能夠以最高達(dá)O. 5mg/ml的濃度溶解，更優(yōu)選的是該肽能夠以高達(dá)lmg/ml的濃度溶解，最優(yōu)選的是該肽能夠以高達(dá)5mg/ml的濃度溶解。就鼻內(nèi)給藥而言，可通過當(dāng)前方法被吸收的最大體積劑量約為每個鼻孔200 μ I。如果該肽能夠以lmg/ml的濃度溶解,則每個鼻孔使用加倍劑量時,可將800μ g給藥于患者。在任何單一劑量中給藥超過5mg的情況并不常見。該肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性也很重要，這種穩(wěn)定性應(yīng)足以將其應(yīng)用于治療。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)條件下，給藥后30分鐘的測試肽總量降至約50%，給藥后4小時的量降至約 30%，但5天后仍能夠檢測到這種肽(約5% )。該肽的體內(nèi)半衰期至少應(yīng)為10分鐘，優(yōu)選的是至少30分鐘，更優(yōu)選的是至少4小時，最優(yōu)選的是至少24小時。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻內(nèi)給藥后，引流淋巴結(jié)中的肽量峰值出現(xiàn)在給藥后約4小時，但在5天后仍能夠檢測到該肽(水平約為最大值的5% )。優(yōu)選的是該肽具有足夠的穩(wěn)定性，使其在引流淋巴結(jié)中以治療活性濃度存在的時間足以發(fā)揮其療效。此外，該肽應(yīng)在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物利用度。該肽還應(yīng)在體內(nèi)保持一種使其能夠與細(xì)胞表面MHC分子無障礙結(jié)合的構(gòu)象。目標(biāo)疾病在一項實施方案中，本發(fā)明第二方面所描述的肽可用于疾病的治療和/或預(yù)防。II類MHC的apitope可能特別適用于由⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答介導(dǎo)的疾病。例如，由不適當(dāng)?shù)幕蜻^量的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答導(dǎo)致或維持的疾病。這種肽可能特別適用于過敏性病癥的治療。過敏性反應(yīng)包括(i)由針對無毒外源物的不適當(dāng)應(yīng)答導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)；(ii)由針對自身組織抗原的應(yīng)答導(dǎo)致的自身免疫疾病；以及(iii)由針對移植物的應(yīng)答導(dǎo)致的移植排異。變態(tài)反應(yīng)的實例包括，但不局限于枯草熱、外源性哮喘、昆蟲咬傷及刺傷變態(tài)反應(yīng)、食物及藥物變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘、慢性支氣管炎、過敏性綜合征、蕁麻疹、血管性水腫、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、結(jié)節(jié)性紅斑、多形紅斑、Stevens-Johnson綜合征、鼻結(jié)膜炎、結(jié)膜炎、皮膚壞死性微靜脈炎、炎性肺病和大皰性皮膚病。自身免疫疾病的實例包括，但不局限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、重癥肌無力(MG)、多發(fā)性硬化癥(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、Graves病、炎性腸病、自身免疫性色素層視網(wǎng)膜炎、多發(fā)性肌炎和某些類型的糖尿病、系統(tǒng)性血管炎、多發(fā)性肌炎-皮肌炎、系統(tǒng)性硬化病(硬皮病)、Sjogren病、強(qiáng)直性脊柱炎和相關(guān)的脊柱關(guān)節(jié)病、風(fēng)濕熱、過敏性肺炎、變應(yīng)性支氣管肺部曲霉病、無機(jī)灰塵致塵肺、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血、免疫性血小板病癥、諸如冷沉纖維蛋白原血癥等寒冷病，以及自身免疫性多內(nèi)分泌腺病。在臨床醫(yī)學(xué)中，通?？梢詫Χ喾N組織進(jìn)行移植，其中包括腎、肝、心肺、皮膚、角膜和骨髓。目前，除角膜以外的所有移植以及某些骨髓移植通常都需要長期的免疫抑制。在本發(fā)明該方面的一項實施方案中，可以將肽用于糖尿病的治療和/或預(yù)防。該實施方案中的這種肽可來源于靶抗原IA2。
在本發(fā)明該方面的另一項實施方案中，可以將肽用于多發(fā)性硬化癥(MS)的治療和/或預(yù)防。多發(fā)性硬化癥(MS)是一種慢性炎性疾病，其特征是整個CNS白質(zhì)中散布有多處脫髓鞘性病變，該疾病可以在不同部位和不同時間出現(xiàn)(McFarlin and McFarland, 1982New England J. Medicine 307 :1183-1188 和 1246-1251)。MS 被認(rèn)為是由自反應(yīng)性 T 細(xì)胞介導(dǎo)的。該實施方案中的肽可來源于一種自身抗原，具體地說，是髓磷脂堿性蛋白(MBP)或蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)。MBP可能比PLP更合適，因為PLP具有強(qiáng)疏水性，來源于該蛋白的肽傾向于凝集在一起。MBP具有免疫原性，并且MBP特異性T淋巴細(xì)胞在動物體內(nèi)具有致腦炎活性(Segal et al. , 1994 J. Neuroimmunol. 51 :7-19 ；Voskuhl et al. , 1993J. Neuroimmuno142 187-192 ；ZamviI et al. ,1985 Nature 317 :355-8)。在一項優(yōu)選實施方案中，使用的肽來源于MBP的免疫優(yōu)勢區(qū)之一，即1_24、30-54、75-99、90-114、105-129、120-144、135-159 和 150-170。 在一項特別優(yōu)選的實施方案中，使用的肽選自本發(fā)明人證明可充當(dāng)apitopes的MBP 肽，其中包括以下的肽:30-44、80-94、83-99、81-95、82-96、83-97、84-98、110-124、130-144、131-145、132-146 和 133-147。I類MHC的apitopes可用于，例如，以耐受原性方式對抗病毒性⑶8+應(yīng)答進(jìn)行修飾。藥物組合物本發(fā)明人認(rèn)為，盡管存在“旁觀者抑制”，但為了有效地誘導(dǎo)耐受性，還是必需以多種不同的T細(xì)胞克隆為目標(biāo)。因此，為了預(yù)防或治療疾病，可以將多種肽給藥于個體。第三方面，本發(fā)明涉及含有多種apitopes的一種藥物組合物。該藥物組合物可含有,例如，2-50種apitopes,優(yōu)選的是2_15種apitopes。這些apitopes可來源于相同或不同的祀抗原。優(yōu)選的是這些apitopes都無需進(jìn)一步加工即能夠與I類MHC結(jié)合，或都無需進(jìn)一步加工即能夠與II類MHC結(jié)合。在一項優(yōu)選實施方案中，該藥物組合物中的所有apitopes都無需進(jìn)一步加工即能夠與I類或II類MHC結(jié)合。該藥物組合物可采用試劑盒的形式，其中單獨(dú)提供了用于同時、單獨(dú)或序貫給藥的一些或所有apitopes。作為選擇(或除此之外)，如果要以多劑量方式將該藥物組合物(或其任意部分)給藥，可以將每劑單獨(dú)包裝。該藥物組合物可含有治療有效劑量或預(yù)防有效劑量的一種或所有apitope，并且可選擇性地含有一種藥學(xué)容許的載劑、稀釋劑或賦形劑。此外，在本發(fā)明的藥物組合物中，可以將一種或每種apitope與任何適當(dāng)?shù)囊环N或多種粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、涂布劑或增溶劑相混合。給藥在不使用佐劑的情況下，本發(fā)明的肽應(yīng)以溶液形式給藥。優(yōu)選的是通過粘膜將肽給藥。研究表明，當(dāng)以溶液形式進(jìn)行腹膜內(nèi)(i.p·)、靜脈內(nèi)(i.v.)或鼻內(nèi)(i.n.)給藥時，肽可以誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受性(上文Anderton and Wraith (1998)；上文Liu andWraith(1995) ；Metzler and Wraith(1999)Immunology 97 :257-263)。
優(yōu)選的是將肽進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。用小鼠進(jìn)行的研究表明，誘導(dǎo)耐受性所需的肽給藥持續(xù)時間取決于接受者的T細(xì)胞前體頻率(上文Burkhart et al (1999))。許多實驗的研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)耐受性需要將肽進(jìn)行重復(fù)給藥(上文Burkhart et al (1999))。因此，肽的確切劑量和給藥次數(shù)應(yīng)取決于個體，但在優(yōu)選實施方案中是進(jìn)行多次給藥。如果同時將多種肽給藥，這些肽可采用適合于單次或多次給藥的“混合物”形式。作為選擇，優(yōu)選的是進(jìn)行多次給藥，但每次給藥的肽相對濃度不同。在一項優(yōu)選實施方案中，可以采用“劑量遞增”法，也就是以遞增的濃度對患者進(jìn)行多次給藥。該方法已用于，例如，對蜂毒變態(tài)反應(yīng)的免疫治療應(yīng)用中的磷脂酶A2肽給藥(Miiller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101 :747-754 和 Akdis et al (1998)J.Clin. Invest. 102 :98-106)。
實施例 以下實施例用于對本發(fā)明進(jìn)行說明，但不應(yīng)被認(rèn)為是本發(fā)明的限制。本發(fā)明尤其涉及這些實施例中描述的特別實施方案。實施例I——確定MBP中的T細(xì)胞表位材料與方法抗原按Deibler et al. (Deibler et al. ,1972制備生物化學(xué)2 :139)的描述由腦白質(zhì)制備人MBP，并通過SDS-PAGE確定其純度。增殖測定是以前人確定的最佳濃度用MBP和結(jié)核分支桿菌純化蛋白衍生物(PPD)來進(jìn)行(UK central Veterinary Laboratory, Surrey)；每種抗原的最佳濃度為50 μ g/mlo利用標(biāo)準(zhǔn)的F-moc化學(xué)劑在Abimed AMS422多重肽合成儀(Abimed, Langenfeld, German)上合成一組覆蓋全MBP分子的含15個殘基的重疊肽。每種肽有5個氨基酸殘基被替換，有10個氨基酸殘基重疊。我們產(chǎn)生了 33種肽，其合并成3組,并以50 μ g/ml的最佳濃度對合并物進(jìn)行測試，以使每種肽的體外濃度為16. 6 μ g/mlo患者和對照主體該項研究的主體包括12名臨床確診或?qū)嶒炇掖_定為MS的患者(Poser et al.，1983)，年齡為29-51歲。12名患者中的8名參與β -干擾素試驗，而其他所有MS患者在該研究開始前至少3個月內(nèi)未接受任何皮質(zhì)類固醇治療。對照組包括13名健康個體，年齡為25-55歲，并且在取血樣前至少3個月內(nèi)均未接受任何免疫抑制治療。組織培養(yǎng)基使用的組織培養(yǎng)基為補(bǔ)加20mM HEPES(Sigma,Poole,UK)、青霉素(100U/ml)、硫酸鏈霉素(100mg/ml)和 4mM L-谷氨酸胺(均購于 Life Technologies, Paisley, Scotland)的RPMI-1640培養(yǎng)基。淋巴樣細(xì)胞和TCL的清洗采用無血清培養(yǎng)基。在所有培養(yǎng)條件和測定中，使用的培養(yǎng)基均添加10%熱滅活的自體血漿。培養(yǎng)條件和T細(xì)胞增殖測定在獲得被告知的書面同意之后，通過靜脈穿刺從每個主體中收集檸檬酸化周圍血(50-100ml)。通過Histopaque-1077 (Sigma, Poole, UK)上的密度離心從血液中分離周圍血單核細(xì)胞(PBMC)，并以I. 5ml體積和IxlO6細(xì)胞/ml的濃度培養(yǎng)在含有PPD、MBP或MBP肽的24孔組織培養(yǎng)板上(Nunc International, Costar)。在5% C02/95%空氣的潮濕環(huán)境中將板37°C保溫。在第5和第14天之間，從每種培養(yǎng)物中吸取2份100 μ I的試樣，轉(zhuǎn)移到96 孔圓底微量滴定板中，并用 O. 4 μ Ci 的[3H]胸苷(Amersham International, Amersham,UK)進(jìn)行脈沖標(biāo)記。18 小時后，用 Machlll 收集器 96(Tomtec,Orange,New Jersey,USA)將細(xì)胞收集在玻璃纖維墊上(LKB-Wallac, Turku, Finland)。用Microbeta液體閃爍計數(shù)器(LKB-Wallac)進(jìn)行胸苷量摻入測定。當(dāng)δ cpm > 1000，并且刺激指數(shù)(SI) > 3時，含有抗原的測試孔被認(rèn)為是陽性結(jié)果，其中SI =含抗原培養(yǎng)物CPM/無抗原培養(yǎng)物CPM。T細(xì)胞系和T細(xì)胞克隆的產(chǎn)生MBP特異性T細(xì)胞系(TCL)產(chǎn)生于8名MS患者和2名健康對照供體。按上文所述由每個主體分離PBMC，并在MBP存在(50 μ g/ml)的條件下以IxlO6細(xì)胞/ml的濃度鋪在6孔板中；將每個主體的部分PBMC進(jìn)行常規(guī)冷凍和保存，用于隨后的再刺激。7天后，用含有2% IL-2 (Lymphocult-HT ；Biotest LTD. ,Birmingham,UK)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并在培養(yǎng)的第12天用抗原對所有細(xì)胞進(jìn)行再刺激，抗原為IL-2以及作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)的經(jīng)過照射(2500Rad)的自體PBMC，細(xì)胞比率為IT細(xì)胞5APC。每3_4天在IL-2中擴(kuò)增細(xì) 胞，并在第14天如上文所述用抗原IL-2和PBMC進(jìn)行再刺激。在首次再刺激時，檢測細(xì)胞對MBP的特異性增殖。簡單地說，是在MBP存在的條件下將2xl04個T細(xì)胞和IxlO5個經(jīng)過照射的自體PBMC培養(yǎng)在96孔圓底平板中，一式三份。將細(xì)胞培養(yǎng)2天，并用0. 4 μ Ci/孔的[3H]胸苷進(jìn)行18個小時的脈沖標(biāo)記。然后如上所述收集細(xì)胞，δ cpm > 1000并且SI >3的TCL被認(rèn)為具有MBP特異性。進(jìn)行3次再刺激/擴(kuò)增循環(huán)之后，在作為APC的經(jīng)過照射的自體PBMC存在的條件下，用PHA(Sigma，Poole，Dorset，UK)將TCL克隆。在有限稀釋條件下以0. I細(xì)胞/孔、0.3細(xì)胞/孔和I細(xì)胞/孔的濃度將T細(xì)胞鋪板，并培養(yǎng)在含有IxlO4個經(jīng)過照射的PBMC、5 μ g/ml PHA和2% IL-2的Terasaki平板中。10-12天后，將陽性生長細(xì)胞擴(kuò)增到含有IxlO5個經(jīng)過照射的PBMC、5 μ g/ml PHA和IL-2的96孔圓底平板中。3天后，添加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，第7天時，將克隆擴(kuò)增到含有5x105個經(jīng)過照射的PBMC、PHA和IL-2的48孔板中；此時利用增殖測定法檢測克隆對MBP的特異性應(yīng)答。I周后，用含有PHA或Dynabeads (Dynal，UK)以及IL-2的IxlO6個經(jīng)過照射的PBMC將MBP特異性克隆擴(kuò)增到24孔板中?；景瓷衔乃鲇?-10天的再刺激/擴(kuò)增循環(huán)將克隆維持在24孔板中。按上文所述用增殖測定法檢測T細(xì)胞克隆(TCC)對一組MBP肽的識別能力。結(jié)果在MS患者和健康個體中的MBP-肽識別本發(fā)明人利用動力學(xué)應(yīng)答測定法檢測了 MS患者及健康個體的PBMC對覆蓋全長人MBP的一組含有15個殘基的合成肽的應(yīng)答能力。對來自各培養(yǎng)物的PBMC的增殖應(yīng)答測定是在2周時間內(nèi)分5個時間點進(jìn)行，并且將MBP和肽的應(yīng)答動力學(xué)曲線與PH)的應(yīng)答進(jìn)行比較，后者代表一種次級應(yīng)答/記憶抗原。在PBMC對MBP和/或肽的應(yīng)答方面，β干擾素組患者與未處理組患者之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差別(數(shù)據(jù)未顯示)。MS患者和健康對照對MBP的應(yīng)答峰均遲于對PH)的應(yīng)答，因而符合非記憶抗原應(yīng)答的動力學(xué)特征。圖I顯示MS患者和健康個體對pro和MBP的動力學(xué)曲線的典型實例。如圖2所示，能夠被MS患者最普遍識別的兩種肽為90-114和75_99(各有6/12患者)，然后是區(qū)域 30-54、135-159 和 150-170 (5/12 患者)，以及 1-24 和 105-129 (4/12 患者)。有3名患者對aa 15-39和120-144產(chǎn)生應(yīng)答。有2名患者識別45-69，沒有一名患者對區(qū)域60-84產(chǎn)生應(yīng)答。根據(jù)圖10，當(dāng)所有患者都呈HLA-DR2陽性時，能夠被MS患者最普遍識別的兩種肽為 90-114 和 75-99(各有 6/11 患者)，然后是區(qū)域 120-144、135-159 和 150-170(5/12 患者)，以及1-24、15-39、30-54和105-129(4/11患者)。有3名患者對aa 45-69產(chǎn)生應(yīng)答，并且仍沒有一名MS患者對區(qū)域60-84產(chǎn)生應(yīng)答。相比之下，能夠被健康個體識別的肽要少得多，只有2名對照主體對2種以上的肽產(chǎn)生應(yīng)答(C和J ;圖3)。只有C和J這2名對照個體識別aa 60-84,該區(qū)域在該組的患者中未被識別。有趣的是，這2名個體均表達(dá)DRB1*0701等位基因。所有健康供體均不能識別區(qū)域45-69和105-129，而識別75-99和150-170的健康個體有4名；識別135-159的健康 個體有3名；識別1-24、30-54、60-84和120-144的健康個體有2名；識別15-39和90-114的個體有I名?？傮w上，有8/13的健康個體對所有重疊肽均不產(chǎn)生應(yīng)答，而始終不識別MBP肽的MS患者只有1/12 (MS19)。值得注意的是，該患者是唯一不對MBP肽產(chǎn)生應(yīng)答的患者。圖11也顯示健康個體對MBP肽的應(yīng)答。在該研究中，只有I名對照主體對2種以上的肽產(chǎn)生應(yīng)答(Nil)。Nll也是識別aa 60-84的唯一個體，該區(qū)域在該組的患者中未被識別。所有健康供體均不能識別區(qū)域15-39、45-69和105-129，而識別120-144和135-159的健康個體有2名；識別1-24、30-54、60-84、75-99、90-114和150-170的個體有I名?？傮w上，有9/12的健康個體對所有重疊肽均不產(chǎn)生應(yīng)答?？偟膩碚f，在對MBP和/或肽產(chǎn)生應(yīng)答的峰值出現(xiàn)時間方面，健康個體與患者之間沒有明顯的差別，并且這兩組的動力學(xué)曲線均類似于初級抗原應(yīng)答。此外，在對MBP和肽的應(yīng)答強(qiáng)度方面，患者和健康個體之間沒有差別。對MBP-肽的識別隨時間而改變在確定MS患者能夠?qū)V泛類型的MBP肽產(chǎn)生應(yīng)答之后，本發(fā)明人決定檢測相同個體中的PBMC識別是否集中在大約4-12個月的時間內(nèi)并保持穩(wěn)定。如圖2、圖10和圖3所示，MS患者和健康個體均未表現(xiàn)出相同的肽識別模式。圖4顯示一名MS患者(MS49)的實例，該患者在2個不同的時間點對多種肽產(chǎn)生應(yīng)答，但在4個月之后測量的第二時間點期間的識別曲線明顯不同。也就是說，在第二次動力學(xué)測定中，PBMC仍保持對aa 15-39,30-54和150-170的應(yīng)答，但是對75-99和105-129的應(yīng)答消退，并且改變成對90-114和135-159的應(yīng)答。圖5(MS60)顯示一名患者的實例，該患者的主要表位應(yīng)答在4個月的時間內(nèi)消退成一種集中應(yīng)答。第二次測試的健康個體未對任何肽產(chǎn)生應(yīng)答(圖3)?？偟膩碚f,這些結(jié)果說明MS患者未能表現(xiàn)出固定的識別模式。如MS49患者所示，在每名患者中，PBMC對幾種肽的應(yīng)答可以保持、消退，以及改變成對MBP新區(qū)域的應(yīng)答。肽識別循環(huán)當(dāng)在12個月的時間內(nèi)分3個或更多個不同時間點分析PBMC對肽的應(yīng)答時，可以發(fā)現(xiàn)某些患者中的表位識別表現(xiàn)為波動起伏，而不是不可逆地改變成對新肽區(qū)域的應(yīng)答。舉例來說，如圖2和圖10所示，患者M(jìn)S 60對aa 120-144和135-159的識別表現(xiàn)為一種循環(huán)模式；也就是在第一測試時間點時，在眾多被識別的區(qū)域中包括殘基120-144和135-159，在第二時間點時，對這2個區(qū)域的應(yīng)答消退，而在4個月后的第三測試時間點時重新出現(xiàn)。與此類似，患者M(jìn)S41的動力學(xué)曲線表明，對aa 135-159的識別在幾個時間點的過程中表現(xiàn)為波動起伏(見圖2和圖10)。在健康對照組中(圖3)，有I名個體(M)對區(qū)域75-99和135-159的應(yīng)答表現(xiàn)為波動起伏，另I名個體(F)在3次分析時間點中有2次表現(xiàn)為能夠識別區(qū)域75-99，還有I名個體(D)對殘基15-39的應(yīng)答表現(xiàn)為循環(huán)模式。MBP應(yīng)答的精確制圖由8名MS患者和2名健康個體獲得TCC，并用于闡明在動力學(xué)應(yīng)答測定中確定的肽區(qū)域的精確特異性。各TCC特異性的測試方法是檢測其對含有15個殘基的一組肽的增殖應(yīng)答。克隆SD A7識別區(qū)域1-24，而在該區(qū)域中，該TCC對aa 5-19產(chǎn)生應(yīng)答。識別區(qū)域30-54的有4種克隆(MS49 :D3、MS49 :C8、MS49 :A8、MS49 B6)，而該區(qū)域中的表位為30-44。有一種來自MS患者的克隆(MS39 D7)能夠識別肽60-74，有趣的是，在我們的動力 學(xué)應(yīng)答測定中，有I名健康個體對該區(qū)域(60-84)產(chǎn)生應(yīng)答。有5種克隆(MS43 :A7、MS41 B6、MS41 :A2、MS41 :C6、N5 :8)能夠識別含有區(qū)域75-99的aa 83-99。一名患者產(chǎn)生了對aa 110-124具有特異性的TCC(MS60 :A2、MS60 :B3)，該區(qū)域包含在105-129合并物中，該患者產(chǎn)生的另一種TCC對120-144區(qū)域中包含的130-144具有特異性(MS60 E1)。有5名個體產(chǎn)生了能夠識別區(qū)域135-159中所含表位的克隆MS60 :F7、MS60 :D1、MS59 F1和N5 :19可識別aa 140-154 ；MS57 A1對140-149具有特異性，而TCC MS17 A3能夠?qū)π蛄?30-144產(chǎn)生應(yīng)答。該組克隆清楚地說明，在MBP的135-159區(qū)域中至少存在2種T細(xì)胞表位。最后，區(qū)域150-170能夠被2種對aa 156-169具有特異性的克隆識別。所有TCC的特異性總結(jié)于圖6。實施例2-確定MBP中的apitopes材料與方法利用APIPS講行抗原旱遞測定將肽呈遞至T細(xì)胞克隆的檢測是利用增殖方法來進(jìn)行。在O. 5%多聚甲醛中將APC固定，并以IxlO5細(xì)胞/孔的濃度鋪在96孔組織培養(yǎng)板中。以2xl04細(xì)胞/孔的濃度將T細(xì)胞克隆鋪在含有含有不同濃度肽的板中。37°C培育48小時，然后利用16-20小時的[3H]胸苷摻入方法進(jìn)行增殖測定。將結(jié)果與T細(xì)胞對或APC呈遞的表位產(chǎn)生應(yīng)答的能力進(jìn)行比較。將肽呈遞至由DR2 :MBP82-100轉(zhuǎn)基因小鼠分離的T細(xì)胞的測定方法基本如上文所述，只是APC的鋪板濃度為5x10s細(xì)胞/孔，T細(xì)胞的鋪板濃度為IxlO5細(xì)胞/孔，并且在添加[3H]胸苷之前培育72小時。結(jié)果該實驗可檢測上述實施例中確定為表位的肽被APIPS呈遞的能力。結(jié)果顯示于圖7b。在目前已檢測的5種表位中，發(fā)現(xiàn)有4種是apitopes (30-44、80-94、110-124和130-144)，有I種可作為表位，但不能作為apitope (156-170)。實施例2A-對 MBP 肽 30-44、110-124、130-144 和 156-170 的研究為了研究多種MBP肽是否為apitopes，對這些肽被固定的APC呈遞至T細(xì)胞的能力進(jìn)行檢測。在含有肽的血清或只在血清中將活體的或預(yù)脈沖標(biāo)記的Mgar (HLA-DR2+ve)細(xì)胞進(jìn)行3. 5小時的預(yù)脈沖標(biāo)記。然后將過量的肽去除，并添加適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞克隆。利用[3H]胸苷攝取方法檢測T細(xì)胞的增殖應(yīng)答。如圖8和圖9所示，肽30-44(圖8A)、110-124(圖8B)和130-144(圖9A)無需進(jìn)一步加工即可被固定的APC呈遞。因此，這些肽被確定為apitopes。另一方面，肽156-170需要進(jìn)一步加工才可被呈遞至T細(xì)胞(圖9B)。固定的APC不能將該表位呈遞至T細(xì)胞，因而 156-170 不是一種 apitope。實施例2B-確定 MBP 區(qū)域 77-100 和 125-148 中的 apitopes對任何給定的表位而言，都可能存在一種或多種無需進(jìn)一步加工即可被呈遞至APC的apitopes。對兩種MBP區(qū)域內(nèi)的apitopes存在情況進(jìn)行檢測，方法是在含有MBP區(qū)域77-100(圖12)和區(qū)域125-148(圖13)的重疊肽的血清或只在血清中培育活體的或多聚甲醛固定的Mgar (HLA-DR2+ve)細(xì)胞。培育72小時(圖12)或48小時(圖13)后，添加T細(xì)胞，并利用[3H]胸苷攝取方法檢測T細(xì)胞的增殖應(yīng)答。用于MBP77-100的T細(xì)胞分離自DR2 =MBP 82-100轉(zhuǎn)基因小鼠，用于MBP130-144的是T細(xì)胞克隆MS17 :A3。 在MBP區(qū)域77-100中，以下的肽被確定為apitopes MBP 83-99ENPVVHFFKNIVTPRTPMBP 80-94TQDENPVVHFFKNIVMBP 81-95QDENPVVHFFKNIVTMBP 82-96DENPVVHFFKNIVTPMBP 83-97ENPVVHFFKNIVTPRMBP 84-98MPVVHFFKNIVTPRT能夠被來源于DR2 MBP 82-100轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞識別的最小MBP序列為區(qū)域85-94。在MBP區(qū)域125-148中，以下的肽被確定為apitopes MBP 130-144RASDYKSAHKGFKGVMBP I3I-I45ASDYKSAHKGFKGVDMBP 132-146SDYKSAHKGFKGVDAMBP 133-147DYKSAHKGFKGVDAQ能夠被T細(xì)胞克隆MS17 A3識別的最小MBP序列為區(qū)域133-144。實施例2C——對MBP區(qū)域89-101的研究本發(fā)明人此前發(fā)現(xiàn)，與其他髓磷脂T細(xì)胞表位不同的是，以可溶形式將肽89-101給藥不能防止小鼠被完整髓磷脂或肽89-101本身誘導(dǎo)產(chǎn)生實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)(Anderton and Wraith(1998)Eur. J. Tmmunol. 28 :1251)。MBP 89-101含有3個T細(xì)胞表位為了研究T細(xì)胞對MBP區(qū)域81-111的反應(yīng)性，在體外用81-111刺激已被81-111致敏的小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞，并用覆蓋81-111區(qū)域且依次錯位2個殘基的一組含有10個殘基的重疊肽(即:81-90、83-92、85-94、87-96、89-98、91-100、93-102、95-104、97-106、99-108和101-111)對這些細(xì)胞進(jìn)行測試。對覆蓋89-101的肽的應(yīng)答模式說明，有5種相鄰的肽(N端87-96至95-104)具有刺激能力，這表明至少存在2種(可能是3種)不同的表位。為了對該區(qū)域做進(jìn)一步研究，由最初的81-111應(yīng)答性T細(xì)胞系產(chǎn)生了 3種亞細(xì)胞系，并用覆蓋84-106區(qū)域且依次錯位I個殘基的一組含有10個殘基的重疊肽對這些細(xì)胞系再次進(jìn)行測試。結(jié)果說明89-101序列中存在3種不同但又重疊的T細(xì)胞表位89-94、92-98 和 95-101(見圖 14)。MBP妝92-98是一種隱蔽表位當(dāng)測試對89-101肽和整個重組MBP的反應(yīng)性時，這3種表位特異性T細(xì)胞系(TCL)表現(xiàn)出十分有趣的差異。所有3種TCL都能夠?qū)﹄?89-101)產(chǎn)生應(yīng)答，但只有89-94特異性TCL和95-101特異性TCL能夠?qū)ν暾腗BP產(chǎn)生應(yīng)答。這說明完整MBP的抗原加工優(yōu)先產(chǎn)生89-94識別性T細(xì)胞和95-101識別性T細(xì)胞的配體，而不產(chǎn)生92-98識別性T細(xì)胞的配體。這表明92-98表位是隱蔽的(即不能通過天然抗原加工產(chǎn)生)。MBP的89-101肽似乎能參與3種不同的與MHC分子的相互作用，從而產(chǎn)生被3種獨(dú)立T細(xì)胞群識別的肽/MHC配體。但是對MBP的加工只產(chǎn)生被其中2種T細(xì)胞群識別的配體(見圖14)。誘導(dǎo)EAE要求T細(xì)胞能夠識別CNS中由于完整MBP降解而表達(dá)的自身抗原性表位。用只含有上述3種T細(xì)胞表位之一的肽對小鼠進(jìn)行免疫的結(jié)果說明，只有包含天然加工表 位(89-94或95-101)的肽才能夠誘導(dǎo)EAE。這進(jìn)一步支持92-98為隱蔽表位的結(jié)果。MBP At 92-98 是 MBP 區(qū)域 89-101 的優(yōu)勢表位如上所述，區(qū)域89-101含有3種不同但又重疊的肽。其中，肽92_98似乎在該區(qū)域占有優(yōu)勢。例如，當(dāng)由98-101肽致敏的小鼠產(chǎn)生T細(xì)胞克隆時，產(chǎn)生的所有6種克隆都能夠?qū)?2-98產(chǎn)生應(yīng)答。通過使用在每個位置含有單個丙氨酸取代的89-101肽類似物，發(fā)現(xiàn)將92-98的任一位置取代都會導(dǎo)致應(yīng)答性喪失，這說明92-98核心中任何殘基的改變都會對該表位的識別產(chǎn)生總體上的影響。MBP肽89-101不能使識別天然加工MBP表位的EAE相關(guān)T細(xì)胞獲得耐受件總之，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)a) 89-101序列有可能產(chǎn)生3種T細(xì)胞表位；b)對完整MBP的抗原加工(包括體內(nèi)和體外)只能產(chǎn)生其中的2種表位(89-94和95-101) ；c)能有效誘導(dǎo)EAE的肽只有包含天然加工表位的肽，而不是包含隱蔽表位的肽；d)在肽治療實驗中，89-101肽不能預(yù)防EAE。這些信息可作為依據(jù)，用于研究89-101肽不能與疾病相關(guān)T細(xì)胞直接結(jié)合因而無法誘導(dǎo)EAE耐受性的假設(shè)。為了證明該假設(shè)，這種肽(89-101)應(yīng)該不能誘導(dǎo)對致腦炎性表位(89-94)的耐受性，因為它不能與適當(dāng)構(gòu)象的MHC限制性因子(I-As)直接結(jié)合。換句話說，89-101將不能作為對89-94產(chǎn)生應(yīng)答的T細(xì)胞的apitope。為了檢測這種可能性，用89-101肽和87-96肽進(jìn)行耐受性實驗(圖15A & B)。87-96肽含有誘導(dǎo)EAE最有效的表位(89-94)。方法使小鼠在第-8、-6和-4天接受含有200 μ g肽的PBS或只接受PBS，然后在第O天接受與弗氏完全佐劑混合的100 μ gjft。10天后，將引流淋巴結(jié)細(xì)胞(6xl05每孔)培養(yǎng)在補(bǔ)加5xl0_5 M 2-巰基乙醇和2M L-谷胺酰胺并且含有或不含抗原的X-Vivo 15培養(yǎng)基中。最后用O. 5 μ Ci [3H]胸苷對培養(yǎng)物進(jìn)行16個小時的脈沖標(biāo)記，然后用液體閃爍計數(shù)器進(jìn)行摻入量測定。結(jié)果表示為3份培養(yǎng)物的每分鐘計數(shù)的平均值。結(jié)果用87-96致敏的結(jié)果是誘導(dǎo)了一種對其本身的強(qiáng)記憶應(yīng)答和一種對89-101的較弱應(yīng)答(分別為圖15A及B的□和〇)。這說明需要經(jīng)過抗原加工由89-101產(chǎn)生89-94。在用87-96致敏之前用87-96作為耐受原的結(jié)果是同時抑制了對87-96和89-101的記憶應(yīng)答(圖15A的■和·)。這說明89-94反應(yīng)性T細(xì)胞一旦在體內(nèi)獲得無反應(yīng)性，將不能在體外對89-96或89-101產(chǎn)生的89-94產(chǎn)生應(yīng)答。但重要的是，在用87-96致敏之前將
89-101作為耐受原不能抑制對87-96和89-101的記憶應(yīng)答(圖15B A的■和·)。這些數(shù)據(jù)說明，將肽89-101以耐受原形式給藥不能產(chǎn)生對基于89-94序列的天然加工致腦炎性表位的耐受性89-101肽不能作為89-94表位的apitope。盡管不希望受理論的約 束，但本發(fā)明人相信，這些觀測結(jié)果可通過肽89-101在MHC肽結(jié)合位點中的位置來加以解釋。如果該肽可優(yōu)先結(jié)合，并使92-98區(qū)域位于肽結(jié)合袋中，則能夠被MBP 92-98特異性T細(xì)胞識別。這可用于解釋為何用MBP 89-101致敏小鼠時，產(chǎn)生的所有T細(xì)胞克隆都能夠識別MBP 92-98表位。同樣，當(dāng)用89-101使T細(xì)胞獲得耐受性時，主要是識別MBP92-98表位的T細(xì)胞獲得耐受性。如果MBP92-98是一種隱蔽表位，則不能由完整抗原的天然加工過程產(chǎn)生，因而在體內(nèi)可能不存在識別該表位的T細(xì)胞。即使體內(nèi)確實存在MBP92-98特異性T細(xì)胞，這種T細(xì)胞也與該疾病無關(guān)。因此，89-101不能預(yù)防由完整MBP誘導(dǎo)的EAE。實施例3-用于MS小鼠模型的肽治療方法本發(fā)明人此前發(fā)現(xiàn)，通過腹膜內(nèi)(Liu and Wraith (1995) Int Immuno18 1255-1263)或鼻內(nèi)(Metzler and Wraith (1993) 5 :1159-1165)途徑進(jìn)行單劑量肽抗原全身給藥的方法能夠有效地保護(hù)小鼠在長達(dá)3個月的時間內(nèi)不患實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE) (Metzler and Wraith(1999) Immunology 97:257-263)。在表達(dá) EAE 特異性T 細(xì)胞受體(Liu et al (1995) Immunity 3:407-415)的 Tg4_ 轉(zhuǎn)基因小鼠(Burkhart etal (1999) 11 :1625-1634)中誘導(dǎo)耐受性至少需要5劑肽。最近的工作表明，對Tg4小鼠而言，鼻內(nèi)(IN)途徑比腹膜內(nèi)(IP)途徑更安全，但在非轉(zhuǎn)基因小鼠中，這兩種方法的安全性相同。對MBP肽83-99的測試是在Fug/D6轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行，這種小鼠能夠同時表達(dá)適當(dāng)?shù)腍LA-DR2 II類MHC分子和來源于對該肽具有特異性的人T細(xì)胞克隆的TCR。根據(jù)處理Tg4轉(zhuǎn)基因小鼠所采用的標(biāo)準(zhǔn)劑量(Tg4方案)或用于治療變態(tài)反應(yīng)患者的肽劑量遞增脫敏方案(脫敏方案)，用肽對小鼠進(jìn)行治療。Tg4方案對多組小鼠進(jìn)行處理，方法是用總體積25 μ I的肽83-99 (以4mg/ml的濃度溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS))或只用PBS進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。每周的第I和第5天對小鼠進(jìn)行處理，持續(xù)5周，共10次給藥。在第6周開始時，用混合于弗氏完全佐劑(CFA)的肽83-99對每只小鼠進(jìn)行注射，此外還在第I和第3天用百日咳毒素(200ng)進(jìn)行IP注射。脫敏方案對多組小鼠進(jìn)行處理，方法是用總體積25μ I的遞增劑量的肽83-99或只用PBS進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。遞增劑量從O. Iyg開始，再依次為1、3、6、12、50^，然后是3次IOOygo每周的第I和第5天對小鼠進(jìn)行處理，持續(xù)5周，共10次給藥。在第6周開始時，用混合于弗氏完全佐劑(CFA)的肽83-99對每只小鼠進(jìn)行注射，此外還在第I和第3天用百日咳毒素(200ng)進(jìn)行IP注射。對EAE的進(jìn)展情況至少監(jiān)測30天。實施例4-將一種apitope混合物鼻內(nèi)給藥于MS患者制備一種含有MBP 肽 30-44、83-99、110_124 和 130-144 (即已被確定為 apitopes的某些MBP表位)的疫苗。在Phase Ia/Ib試驗中，將該疫苗給藥于35名患者。該試驗為單交叉試驗，其中的患者保持3個月的非治療狀態(tài)，然后接受單劑量的肽(la)。為評定安全性，在單劑量疫苗給藥后，對患者進(jìn)行3個月的監(jiān)測。此外，該治療還包括兩次鼻內(nèi)沉積給藥，每周一次。對每名患者用磁共振成像法分析臨床活性，每月一次；用增殖動力學(xué)應(yīng)答測定法監(jiān)測免疫活性；并用基于細(xì)胞的ELISA法監(jiān)測細(xì)胞因子產(chǎn)量。該試驗最初涉及對5名慢性進(jìn)展性疾病(CP)患者的治療。這些患者是根據(jù)低MRI活性來挑選的，并且首先用最高劑量的肽進(jìn)行處理。從CP患者組開始治療的原因是，他們最可能通過MRI活性的提高來表明任何可能的不良影響。在確定對CP組的單劑量和多劑量治療均具有安全性之后，即可開始對復(fù)發(fā)緩解患者的治療。在這一較大的組中，30名復(fù)發(fā)緩解患者的挑選依據(jù)是他們在3個月的監(jiān)測期內(nèi)出現(xiàn)MRI病變加強(qiáng)。這些患者被分為3組，分別用高、中或低劑量肽進(jìn)行治療。
權(quán)利要求
1.一種耐受原性肽髓磷脂堿性蛋白(MBP)83-99在制備用于治療和/或預(yù)防多發(fā)性硬化的藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
提供一種方法，用于通過選擇一種無需進(jìn)一步加工即能夠與I類或II類MHC分子結(jié)合的肽的方法來選擇耐受原性肽。此外還提供由該方法選擇的肽，及其在藥物組合物和用于治療和/或預(yù)防疾病中的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/50GK102784385SQ20121015667
公開日2012年11月21日 申請日期2001年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月21日
發(fā)明者D·C·弗賴斯, G·馬扎, H·B·斯特雷特, M·龐斯福特, S·M·安德頓 申請人:阿皮托普技術(shù)(布里斯托爾)有限公司