專利名稱：一種定量檢測降鈣素原pct的膠乳增強免疫比濁試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用膠乳增強免疫比濁法定量檢測人體血液中降鈣素原PCT的試劑盒。
背景技術(shù)：
降鈣素原(procalcitonin，PCT)為降鈣素CT的前體物質(zhì)，由116個氨基酸組成，分子量13kD，由N末端-降鈣素-C末端三部分組成，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不受體內(nèi)激素水平的影響，在人體內(nèi)的半衰期為25-30小時，具有良好穩(wěn)定性。體內(nèi)產(chǎn)生PCT的主要部位在肝臟，其他如外周血單核細胞、脾、肺或小腸的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞也是產(chǎn)生PCT的重要場所。內(nèi)毒素、細胞因子可刺激PCT的釋放。
PCT作為一種臨床標(biāo)志物，具有獨特的優(yōu)勢。PCT在健康人血液中含量極低 O. 05ng/ml),0. 5ng/ml被認(rèn)為是全身性感染(膿毒癥)診斷的分界值。PCT在膿毒癥患者中濃度顯著增高，可達1000ng/ml。PCT與炎癥的嚴(yán)重程度成正比，在SIRS (系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征)、膿毒癥(敗血癥)、嚴(yán)重膿毒癥(敗血癥)及膿毒癥(敗血癥)休克病人中PCT濃度有明顯差異。PCT可在感染2小時后檢測到，在感染后12-24小時達到高峰，在炎癥消失后恢復(fù)正常。PCT在體內(nèi)、外穩(wěn)定性好，不受慢性炎癥或自身免疫疾病影響，不受臨床用藥影響(0KT3除外)，對于系統(tǒng)性細菌感染和膿毒癥等具有高度敏感性和特異性。臨床研究表明，PCT檢測在不同醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)Χ喾N疾病的診斷和治療有很高的價值，可應(yīng)用于I⑶、血液科、腫瘤科、兒科、早產(chǎn)兒及新生兒監(jiān)護室、外科、內(nèi)科、器官移植科、急診科和治療實驗室等眾多科室。與目前所應(yīng)用的診斷指標(biāo)相比，PCT在鑒別診斷和控制感染及嚴(yán)重炎癥方面提供了額外的信息，涉及下列多種疾病的診斷、治療項目對敗血癥、系統(tǒng)性嚴(yán)重細菌感染(腹膜炎或軟組織感染等)做早期診斷；對敗血癥和SIRS作鑒別診斷、細菌感染和非細菌性炎癥反應(yīng)(自身免疫性疾病等)的鑒別診斷、細菌感染和病毒感染的鑒別診斷(腦脊膜炎等)、器官移植術(shù)后鑒別診斷(細菌感染、病毒感染、排斥反應(yīng)、真菌感染等)、對不明原因發(fā)燒(UFO)診斷及對特殊感染高?；颊?重癥監(jiān)護室、器官移植術(shù)后、免疫抑制期)監(jiān)測、膿毒性休克和非膿毒性休克的鑒別診斷。PCT與其他細菌感染的傳統(tǒng)診斷指標(biāo)，如白細胞計數(shù)、血沉、C反應(yīng)蛋白、細菌培養(yǎng)等比較，可實現(xiàn)早期、快速、更高的靈敏度和特異性；作為判斷病情與預(yù)后以及療效觀察的可靠指標(biāo)更有助于醫(yī)生及時準(zhǔn)確了解患者的疾病狀況，跟進疾病的進程，準(zhǔn)確預(yù)后以及對治療方法進行指導(dǎo)，為制定合理的抗生素應(yīng)用方案提供依據(jù)，減少患者不必要的醫(yī)療支出和防止抗生素的濫用。目前，檢測PCT的方法有很多，不僅可以定性，亦可以定量，常用的方法有凝膠層析及高效液相色譜分析、酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、放射免疫測定(Radioimmunoassay，RIA)、免疫發(fā)光法和膠體金層析法。其中，凝膠層析及高效液相色譜分析費時且不易自動化；ELISA法定量準(zhǔn)確性差、操作時間長、自動化程度低，多用于定性檢測；RIA法既能檢測游離PCT，又能檢測結(jié)合型PCT，也可檢測降鈣素基因相關(guān)前體(Pro-CGRP)，此法可信敏感度為4pg/ml，能檢測正常人血清PCT，較雙抗夾心法敏感，RIA缺點是所需時間較長，檢測結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性比ELISA差，且存在放射性污染危險。金標(biāo)方法雖穩(wěn)定性較好，但靈敏度較低，一般只能定性，不能定量，特別是重復(fù)性差這一缺點限制了其在臨床上的應(yīng)用，尤其不適用于需通過準(zhǔn)確定量來幫助對疾病進行診斷的體液標(biāo)志蛋白的定量檢測。免疫發(fā)光法采用兩個抗原特異性抗體分別結(jié)合在PCT的不同位點。一株抗體是光標(biāo)記(不蹤物)，而另一株則結(jié)合于試管內(nèi)壁的包被物上。在孵育過程中，抗體與標(biāo)本中的降鈣素原分子結(jié)合形成夾心復(fù)合物，而光標(biāo)抗體則結(jié)合于試管表面的包被物。反應(yīng)完成后，清洗，將過剩的示蹤物棄去，應(yīng)用適當(dāng)?shù)墓舛扔嫼桶l(fā)光檢測試劑測量光信號，計算結(jié)合到管壁包被物上的剩余示蹤物的量。光信號強度與PCT濃度成正比。應(yīng)用已知的抗原濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過它就可求得血清或血漿中未知的PCT濃度。該方法特異性強，敏感性高，但需要昂貴的儀器設(shè)備和經(jīng)驗豐富的操作人員，一般多在特定醫(yī)療機構(gòu)使用。免疫比濁法的基本原理是當(dāng)抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)且比例合適(一般規(guī)定抗體過量)時，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑(聚乙二醇等)作用下，自液相析出，形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定時，形成的免疫復(fù)合·物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。通過測定反應(yīng)液的濁度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。膠乳顆粒增強免疫比濁法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA)是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法，在高分子膠乳微球的表面交聯(lián)特異性抗體，當(dāng)交聯(lián)有抗體的微球與抗原結(jié)合后，在短時間內(nèi)會迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的散光性能或透光性能，反應(yīng)液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)可以反映被測抗原的濃度。PETIA檢測是在均相反應(yīng)體系中進行抗原、抗體反應(yīng)及結(jié)果的測定，抗原抗體反應(yīng)后可直接測定反應(yīng)液的吸光度值，省去了 ELISA法反復(fù)孵育和洗板等煩瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結(jié)果，省時省力。免疫比濁法的靈敏度雖然比ELISA法差一些，但足以檢測到健康人血液中許多標(biāo)志蛋白的下限值，而且可用于自動化儀器檢測。目前市售各種膠乳免疫比濁檢測產(chǎn)品檢測低限多限于O. I μ g/ml，而這一檢測低限對于降鈣素原比濁產(chǎn)品應(yīng)用于臨床是遠遠不夠的，降鈣素原O. 5ng/ml是全身性感染(膿毒癥)診斷的分界值，下呼吸道細菌感染患者PCT濃度可能還低于這一臨界值(彡O. 25ng/ml且〈O. 5ng/ml),因此開發(fā)靈敏度更高、特異性更強、穩(wěn)定性更好、抗干擾能力更強的PCT免疫比濁產(chǎn)品，仍是臨床診斷產(chǎn)品研究領(lǐng)域亟需解決的重要問題。在免疫檢測技術(shù)中，采用改善的包被技術(shù)，提高檢測試劑中載體上連接的與待檢標(biāo)本發(fā)生免疫反應(yīng)的成份的濃度，是提高臨床檢測產(chǎn)品的靈敏度的重要途徑。生物素-親和素系統(tǒng)是一種在多種免疫檢測技術(shù)中連接檢測試劑中載體和檢測抗體(或抗原)的包被系統(tǒng)。生物素分子有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的主要部位環(huán)為噻吩環(huán)，C2上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)，經(jīng)化學(xué)修飾后，生物素可成為帶有多種活性基團的衍生物一活化生物素。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結(jié)合。親和素主要包括卵白親和素、鏈親和素、卵黃親和素及類親和素等。后兩種因其特異性親和力低，研究不多，前兩種目前已深入研究并得到廣泛應(yīng)用。親和素(avidin, AV)和鏈親和素(streptavidin, SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物,二者均為大分子蛋白。親和素亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的堿性糖蛋白，分子量為68kD，等電點pi為1(Γ10. 5，耐熱并耐受多種蛋白水解酶的作用。每個親和素能結(jié)合4個分子的生物素，其親和常數(shù)Ka高達1015mol/L。鏈親和素與親和素具有類似生物學(xué)特性，由Streptomyces avidin鏈霉菌在培養(yǎng)過程中分泌,分子量為65kD，每個SA分子也具有4個可與生物素分子結(jié)合的位點，其親和常數(shù)Ka與AV相同，約為抗原抗體間Ka (IO5 10nmol/L)的I萬倍以上。SA與AV的ka雖然相同，但在實際應(yīng)用中其檢測靈敏度明顯優(yōu)于AV。AV的高pi及高含糖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致在聚苯乙烯板和硝酸纖維素膜上或與組織細胞DNA結(jié)合時，易產(chǎn)生一定程度的非特異性結(jié)合，造成較高的顯色背景，而SA較AV在應(yīng)用中明顯克服了這一缺點。生物素-親和素(鏈親和素)系統(tǒng)具有以下顯著特點高特異性、高靈敏度、簡易、快速、安全、穩(wěn)定和適用性。生物素親和素的結(jié)合反應(yīng)因親和力而呈現(xiàn)高度專一性。生物素-親和素系統(tǒng)(BAS)可通過4個結(jié)合位點多價橋聯(lián)生物素化的大分子衍生物和標(biāo)記物，極大提高檢測方法的靈敏度。BAS可與多種標(biāo)記系統(tǒng)如酶、熒光素、鐵蛋白、凝集素、SPA、放射性核素等聯(lián)合用于抗原、抗體、蛋白、激素、受體、核酸系統(tǒng)等多種生物學(xué)反應(yīng)體系，也可作為親合介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。因此，BAS有著極廣的研究與應(yīng)用價值。另外，生物素化的大分子蛋白、核酸、酶等物質(zhì)不僅保持其活性不受影響，更因生物素化形成許多“觸手”的多價制劑，使整個反應(yīng)體系出現(xiàn)多級放大 效應(yīng)，因而賦予BAS極高的靈敏性。同時，BAS的高度特異性及靈敏性，使其在反應(yīng)體系應(yīng)用中用量極微，故成本低廉。生物素-親和素(鏈親和素)系統(tǒng)成為免疫學(xué)、分子生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)系統(tǒng)之一。在免疫診斷領(lǐng)域，生物素-親和素(鏈親和素)系統(tǒng)應(yīng)用于ELISA、免疫組化及放射免疫、金標(biāo)技術(shù)已開發(fā)出多種有助于靈敏度提高的檢測產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測濃度范圍達O. 2-100ng/ml，且快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強，可在半自動、全自動生化分析儀及散射比濁分析儀上應(yīng)用，適用于需要快速獲取降鈣素原PCT檢測結(jié)果的常規(guī)和急診用途的降鈣素原(PCT)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種定量檢測降鈣素原PCT的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，包括降鈣素原Rl試劑、降鈣素原R2試劑和降鈣素原校準(zhǔn)品；所述Rl試劑包含保護劑A、反應(yīng)增強劑、防腐劑和緩沖液A ;所述R2試劑包含保護劑B、防腐劑、緩沖液B和包被抗人降鈣素原抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，所述R2試劑中抗人降鈣素原抗體與聚苯乙烯膠乳顆粒之間通過鏈親和素-生物素系統(tǒng)連接；所述R2試劑中膠乳顆粒的粒徑為4(T500nm ;所述校準(zhǔn)品包含保護劑C、防腐劑、緩沖液C及降鈣素原重組蛋白。所述R2試劑中的抗人降鈣素原抗體選自多克隆抗體和單克隆抗體中的一種，優(yōu)選多克隆抗體。所述降鈣素原抗體可為鼠源、兔源或羊源抗體，優(yōu)選羊源抗體。所述R2試劑中的包被抗人降鈣素原抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒是通過分別制備生物素化抗人降鈣素原抗體、鏈親和素包被的聚苯乙烯膠乳顆粒，并將所述生物素化抗人降鈣素原抗體與所述鏈親和素包被的聚苯乙烯膠乳顆?；旌戏跤瞥桑谒錾锼鼗谷私碘}素原抗體制備中，所述抗人降鈣素原抗體與生物素的摩爾比為I 1:100，優(yōu)選 I:10。所述R2試劑中的膠乳顆粒與抗人降鈣素原抗體通過鏈親和素-生物素系統(tǒng)連接。鏈親和素-生物素系統(tǒng)可極大地提高檢測方法的靈敏度，同時不增加非特異干擾。此外，鏈親和素-生物素結(jié)合很穩(wěn)定，不會因反應(yīng)試劑的高度稀釋而受影響，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。所述聚苯乙烯膠乳顆?？蔀轸然虬被木郾揭蚁┠z乳顆粒，優(yōu)選羧基化的聚苯乙烯膠乳顆粒。羧基化膠乳顆粒經(jīng)碳化二亞胺(EDAC)活化或氨基化膠乳顆粒經(jīng)戊二醒活化后再進行鏈親和素包被，膠乳顆粒的粒徑范圍為40-500nm。上述技術(shù)方案中所述生物素一般選用已活化的產(chǎn)品，抗體的生物素標(biāo)記反應(yīng)溫和，很少抑制抗體活性，標(biāo)記抗體穩(wěn)定，能被鏈親和素結(jié)合，且背景水平很低，結(jié)合緊密迅速。生物素與抗體共價結(jié)合常見為生物素?；磻?yīng)，將生物素與N-羥 基丁二酰胺在碳化二亞胺的作用下進行縮和，生成生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(biotiny-N-hydroxy-succinimide, BNHS)。BNHS分子酯鍵中的-C=O基團可與抗體分子中賴氨酸的氨基形成肽鍵，從而使抗體標(biāo)記上生物素。生物素的分子量較小，當(dāng)與抗體或酶反應(yīng)形成生物素標(biāo)記結(jié)合物后，由于大分子蛋白的空間位阻效應(yīng)，可能對生物素與鏈親和素間的結(jié)合以及系統(tǒng)的應(yīng)用效果造成干擾。此時可通過在生物素分子側(cè)鏈上連接一定數(shù)量的基團，形成連接臂，增加生物素與被標(biāo)記大分子間的距離(如長臂活化生物素)，減少位阻效應(yīng)，增加檢測的靈敏度和特異性。生物素標(biāo)記抗體時，活化生物素與待標(biāo)記抗體應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤?，使每個抗體分子上標(biāo)記的生物素分子數(shù)量控制在一定范圍。與生物素結(jié)合后，抗體的活性可能會降低，這種情況常發(fā)生在保持抗體活性所必需的游離氨基基團和生物素過多的結(jié)合，此時，生物素化會降低或破壞抗體的抗原結(jié)合能力。本發(fā)明在所述生物素化PCT抗體制備中，所述抗人降鈣素原抗體與生物素的摩爾比優(yōu)選I :10。上述技術(shù)方案中所述R2試劑中的包被抗人降鈣素原抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒質(zhì)量體積比終濃度為O. 04、. 16%，優(yōu)選O. 05、. 1%。牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和明膠，能夠保護膠乳顆粒表面交聯(lián)的抗體。所述保護劑A選自牛血清白蛋白、卵清蛋白和明膠中的一種或多種，優(yōu)選牛血清白蛋白，所述保護劑A的濃度為l"10mg/ml,優(yōu)選2 5mg/ml ;所述保護劑B選自牛血清白蛋白和卵清蛋白中的一種或兩種，優(yōu)選牛血清白蛋白，所述保護劑B的濃度為f 10mg/ml，優(yōu)選4 8mg/ml ;所述保護劑C為牛血清白蛋白，濃度為O. 5 8mg/ml,優(yōu)選l 5mg/ml。所述降鈣素原Rl試劑中包括緩沖液A，其中所述緩沖液A選自硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液中的一種或多種，優(yōu)選Tris-HCl緩沖液或硼酸鹽緩沖液；所述緩沖液A的濃度為2(T200mM，優(yōu)選5(Tl00mM，pH為6 10，優(yōu)選8 8. 5 ;所述降鈣素原R2試劑中包括緩沖液B，其中所述緩沖液B選自硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液中的一種或多種，優(yōu)選甘氨酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液；所述緩沖液B的濃度為2(T200mM，優(yōu)選5(Tl00mM，pH為7 9，優(yōu)選8 8. 5。上述技術(shù)方案中所述反應(yīng)增強劑選自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇20000中的一種或多種，優(yōu)選聚乙二醇6000 ;所述反應(yīng)增強劑的質(zhì)量體積比為f 5%，優(yōu)選5%。聚乙二醇PEG是非離子型水溶性聚合物，有很強的親水性，可以破壞溶液中蛋白質(zhì)周圍的電子云和水化層，促進特異性的抗原和抗體分子靠近并結(jié)合形成大分子復(fù)合物。所述防腐劑選自疊氮鈉、硫柳汞和PrOClin300中的一種或多種，優(yōu)選疊氮鈉，所述防腐劑的質(zhì)量體積比為O. 03、. 2%，優(yōu)選O. 1%。上述技術(shù)方案中所述R2試劑的制備方法包括以下步驟I)膠乳粒子的活化、洗滌將商品化的聚苯乙烯膠乳溶液活化后離心，棄上清，沉淀用洗滌緩沖液重復(fù)洗滌3次；將末次沉淀重懸于所述洗滌緩沖液中，使膠乳顆粒的質(zhì)量體積比終濃度為1%，所述洗 滌緩沖液選自PBS緩沖液和MES緩沖液中的一種；2)鏈親和素包被膠乳顆粒①取Iml活化洗滌后的膠乳溶液，加入鏈親和素，使鏈親和素終濃度為O. f Img/ml ;混勻后，置4 37°C搖床以220rpm轉(zhuǎn)速包被4 18h ；②用PBS緩沖液洗滌未與膠乳粒子結(jié)合的鏈親和素，重復(fù)3次；③封閉將洗滌后的包被鏈親和素的膠乳顆粒溶于包含所述保護劑B的緩沖液B中，使所述膠乳顆粒的質(zhì)量體積比終濃度為O. Γ0. 3% ；3)抗人降鈣素原抗體的生物素化生物素選用商品化的已活化產(chǎn)品，將所述生物素與所述抗人降鈣素原抗體混合，室溫下反應(yīng)l_4h，離心，除去其中少量的沉淀物，將上清裝入透析袋中，在O 4°C下置于PBS緩沖液中透析過夜；所述抗人降鈣素原抗體與所述生物素的摩爾比為I I :100，優(yōu)選I 10 ；4)生物素化降鈣素原抗體與鏈親和素包被膠乳顆粒的連接在步驟2)中所得的鏈親和素包被的膠乳顆粒溶液中加入步驟3)中所得的生物素化抗人降鈣素原抗體，混勻后置37°C搖床孵育O. 5^2h,形成膠乳顆粒-鏈親和素-生物素-抗人降鈣素原抗體復(fù)合物；5)清洗將步驟4)中形成的膠乳顆粒-鏈親和素-生物素-抗人降鈣素原抗體復(fù)合物溶液離心，棄上清，重復(fù)清洗3次；將末次沉淀溶于含所述保護劑B和防腐劑的緩沖液B中，使所述膠乳顆粒的質(zhì)量體積比終濃度為O. 04、. 16%。所述的降鈣素原膠乳增強免疫比濁試劑盒可在半自動、全自動生化分析儀及散射比濁分析儀上用于定量檢測人體血液中降鈣素原的含量，其中所述血液包括全血、血清及血漿。當(dāng)所述試劑盒在半自動、全自動生化分析儀上用于檢測降鈣素原含量時，建議采用血清或血漿樣本進行檢測；當(dāng)所述試劑盒在散射比濁分析儀上用于檢測降鈣素原含量時，可采用全血、血清及血漿樣本進行檢測。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下特點I)本發(fā)明試劑盒在膠乳增強免疫比濁原理基礎(chǔ)上進一步采用了鏈親和素-生物素放大系統(tǒng)，大大提高了比濁試劑的檢測靈敏度，本發(fā)明試劑盒的最低檢測限可達O. 2ng/ml，滿足了臨床應(yīng)用的需求。2)本發(fā)明試劑盒可在散射比濁分析儀上實現(xiàn)多樣本類型靈活快速定量檢測。市售降鈣素原PCT檢測多采用血清或血漿進行檢測，不能滿足臨床快速檢測需求，本發(fā)明試劑盒當(dāng)在散射比濁分析儀上使用時可采用的樣本類型包括全血、血清或血漿，可在臨床多科室應(yīng)用。市售PCT檢測約需半小時左右的時間，而本發(fā)明試劑盒從樣本采集到出具檢測結(jié)果最快只需2-3分鐘，為患者爭取了更多的寶貴時間，可對患者病情進行動態(tài)檢測。3)本發(fā)明試劑盒與進口試劑盒對同一樣本的PCT含量檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計分析，結(jié)果相關(guān)性好，無顯著差異，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在臨床上可以替代進口產(chǎn)品使用，大幅降低檢測成本。


圖I為本發(fā)明降鈣素原試劑盒實施例的校準(zhǔn)曲線；圖2為本發(fā)明降鈣素原試劑盒實施例的線性范圍相關(guān)性；圖3為本發(fā)明降鈣素原試劑盒實施例與羅氏PCT試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)性比較。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種定量檢測降鈣素原PCT含量的膠乳增強免疫比濁試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或者適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。一、降鈣素原測定試劑盒的制備I、降鈣素原Rl試劑配制三羥甲基氨基甲烷(Tris)濃度為O. 2M，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為8. O。再加入BSA、PEG6000 及疊氮鈉，使終濃度為BSA5mg/ml、PEG60005% (w/v)、疊氮鈉 O. 1% (w/v)。2、降鈣素原R2試劑配制I)膠乳粒子的活化、洗滌取10. 1%羧基化聚苯乙烯膠乳顆粒溶液(Bangs Laboratories, Inc.,粒徑為200nm) 100 μ 1，向膠乳溶液中加入6mg/ml EDAC溶液I. 68ml，置于37°C往復(fù)式搖床中反應(yīng)O. 5h。12000rpm離心30min，棄上清，加入50mM pH6. 5MES緩沖液洗滌三次，將沉淀分散于50mM pH6. 5MES緩沖液中，使膠乳顆粒濃度為1% (w/v)。2)鏈親和素包被膠乳顆粒取Iml活化洗滌后的羧基化聚苯乙烯膠乳溶液，加入2mg/ml鏈親和素溶液500μ 1，混勻，置37°C往復(fù)式搖床以220rpm轉(zhuǎn)速包被16h，以12500rpm離心20min，棄上清；將沉淀物溶于O. IM pH7. 4PBS緩沖液，混勻，以12500rpm離心20min，棄上清，而后重復(fù)洗滌兩次去除未與膠乳粒子結(jié)合的鏈親和素；將鏈親和素包被的膠乳顆粒沉淀物溶于含4mg/mlBSA的20mM pH8. O甘氨酸緩沖液中，使膠乳顆粒終濃度為O. 3% (w/v)。3)生物素化降鈣素原抗體的制備用O. IM pH9. 5碳酸鹽緩沖液將6mg/ml羊抗人PCT多克隆抗體(上海葉民生物技術(shù)有限公司)稀釋成2mg/ml的抗體溶液，每毫升抗體溶液中加入二甲基甲酰胺溶解的BNHS(5mg/ml) 10 μ I，混勻，于室溫(22°C )反應(yīng)Ih，離心，除去其中少量的沉淀物，將上清裝入透析袋中，在4°C環(huán)境中置于O. IM pH7. 4PBS緩沖液透析24h。4)生物素化降鈣素原抗體與鏈親和素包被膠乳顆粒的連接在Iml步驟2)制備的鏈親和素包被膠乳顆粒溶液中加入400 μ I步驟3)制備的生物素化抗體溶液，混勻，置37°C搖床lh，形成膠乳顆粒-鏈親和素-生物素-PCT多克隆抗體連接復(fù)合物。12500rpm速度離心20min，棄上清，將沉淀物溶于O. IM pH7. 4PBS緩沖液，混勻，12500rpm離心20min，棄上清，而后重復(fù)洗滌兩次；將末次沉淀溶解于含4mg/ml BSA及O. 1%疊氮鈉的50mM pH8. O甘氨酸緩沖液中。3、PCT校準(zhǔn)品配制將市售人降鈣素原重組蛋白溶于類似人血清基質(zhì)的溶液(NaClO. 8%，BSA0. 2%，NaN3O. 4%, Tris-HCl pH8. O)中，制成不同濃度的校準(zhǔn)品。以進口的羅氏公司降鈣素原校準(zhǔn)品為原始標(biāo)準(zhǔn)，采用其降鈣素原試劑盒對不同濃度的校準(zhǔn)品分別檢測20次，求出均值，得到降鈣素原校準(zhǔn)品的濃度0. 2，1,3,10，30，100ng/ml。二、降鈣素原試劑盒的檢測方法I、生化分析儀檢測 以日立7020操作為例測定波長為600nm，分別取不同濃度的校準(zhǔn)品溶液(20 μ I )，加入降鈣素原Rl試劑(240 4 1)，混勻，371孵育5分鐘后，加入降鈣素原R2試劑(80 μ 1)，混勻，37°C孵育I分鐘后，讀取各管吸光度值A(chǔ)1,反應(yīng)4飛分鐘后，讀取各管吸光度值A(chǔ)2，計算吸光度差值A(chǔ)A=A2 — A1，每管重復(fù)測定3次，以各校準(zhǔn)管3次測得的吸光度差值Λ A的平均值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制“濃度-吸光度差值”校準(zhǔn)曲線(見圖I)。取待測血清或血漿樣本，同法測定樣本的吸光度差值，代入校準(zhǔn)曲線，即可計算出待測樣本中降鈣素原PCT的含量。如果血清或血漿中降鈣素原的濃度超出校準(zhǔn)曲線范圍，需對樣本進行稀釋后再檢測以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試劑盒不僅適用于日立7020，還適用于其它品牌和型號的半自動、全自動生化分析儀，具體參數(shù)可根據(jù)儀器進行調(diào)整。2、NORMAN系列散射比濁分析儀檢測將全血35 μ I (血清或血漿20 μ I )加入樣品反應(yīng)杯中，然后加入試劑Rl 240 μ 1，混勻，等反應(yīng)杯中的散射光強度穩(wěn)定后，加入試劑R280y 1，混勻，在1-2分鐘之內(nèi)，測定散射光強度的變化差值A(chǔ)AJf △ A代入校準(zhǔn)曲線，即可計算出待測樣本中降鈣素原的含量。三、檢測試劑盒的分析性能評估I、線性范圍用接近線性范圍上限的降鈣素原高濃度樣本(100. 20ng/ml)，用生理鹽水將其按1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64稀釋，共配制成6個稀釋濃度(xi)的溶液，用所述生化分析儀檢測方法測定各稀釋樣本濃度。每個濃度重復(fù)測定3次，分別求出測定結(jié)果的平均值(yi)。以稀釋濃度(xi)為自變量，以測定結(jié)果平均值(yi)為因變量求出線性回歸方程。按公式(I)計算線性回歸的相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果顯示回歸方程為y=1.0086x-0. 1464，相關(guān)系數(shù)r=0. 9998，表明本發(fā)明試劑盒在O. 2ng/ml-100ng/ml線性范圍內(nèi)相關(guān)性較好(見圖2)。權(quán)利要求
1.一種定量檢測降鈣素原PCT的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，包括降鈣素原Rl試劑、降鈣素原R2試劑和降鈣素原校準(zhǔn)品；所述Rl試劑包含保護劑A、反應(yīng)增強劑、防腐劑和緩沖液A ;所述R2試劑包含保護劑B、防腐劑、緩沖液B和包被抗人降鈣素原抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，所述R2試劑中抗人降鈣素原抗體與聚苯乙烯膠乳顆粒之間通過鏈親和素-生物素系統(tǒng)連接；所述R2試劑中膠乳顆粒的粒徑為4(T500nm ;所述校準(zhǔn)品包含保護劑C、防腐劑、緩沖液C及降鈣素原重組蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述R2試劑中的抗人降鈣素原抗體選自多克隆抗體和單克隆抗體中的一種，優(yōu)選多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述R2試劑中的包被抗人降鈣素原抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒是通過分別制備生物素化抗人降鈣素原抗體、鏈親和素包被的聚苯乙烯膠乳顆粒，并將所述生物素化抗人降鈣素原抗體與所述鏈親和素包被的聚苯乙烯膠乳顆?；旌戏跤瞥?，在所述生物素化抗人降鈣素原抗體制備中，所述抗人降鈣素原抗體與生物素的摩爾比為I I :100，優(yōu)選I :10。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述R2試劑中的包被抗人降鈣素原抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒質(zhì)量體積比終濃度為O. 04、. 16%，優(yōu)選O.05 O. 1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述保護劑A選自牛血清白蛋白、卵清蛋白和明膠中的一種或多種，優(yōu)選牛血清白蛋白，所述保護劑A的濃度為l"10mg/ml,優(yōu)選2、mg/ml ;所述保護劑B選自牛血清白蛋白和卵清蛋白中的一種或兩種，優(yōu)選牛血清白蛋白，所述保護劑B的濃度為l"10mg/ml,優(yōu)選4、mg/ml ;所述保護劑C為牛血清白蛋白，濃度為O. 5 8mg/ml,優(yōu)選I 5mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述緩沖液A選自硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液中的一種或多種，優(yōu)選Tris-HCl緩沖液或硼酸鹽緩沖液；所述緩沖液A的濃度為2(T200mM，優(yōu)選5(Tl(K)mM，pH為6 10，優(yōu)選8 8. 5 ;所述緩沖液B選自硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液中的一種或多種，優(yōu)選甘氨酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液；所述緩沖液B的濃度為20 200禮，優(yōu)選5(Tl00mM，pH為疒9，優(yōu)選8 8. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)增強劑選自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇20000中的一種或多種，優(yōu)選聚乙二醇6000 ;所述反應(yīng)增強劑的質(zhì)量體積比為1飛％，優(yōu)選5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述防腐劑選自疊氮鈉、硫柳萊和Proclin300中的一種或多種,優(yōu)選疊氮鈉,所述防腐劑的質(zhì)量體積比為O.03 O. 2%，優(yōu)選 O. 1%。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述R2試劑的制備方法包括以下步驟 I)膠乳粒子的活化、洗滌 將商品化的聚苯乙烯膠乳溶液活化后離心，棄上清，沉淀用洗滌緩沖液重復(fù)洗滌3次；將末次沉淀重懸于所述洗滌緩沖液中，使膠乳顆粒的質(zhì)量體積比終濃度為1%，所述洗滌緩沖液選自PBS緩沖液和MES緩沖液中的一種；2)鏈親和素包被膠乳顆粒 ①取Iml活化洗滌后的膠乳溶液，加入鏈親和素，使鏈親和素終濃度為O.rimg/ml ;混勻后，置4 37°C搖床以220rpm轉(zhuǎn)速包被4 18h ； ②用PBS緩沖液洗滌未與膠乳粒子結(jié)合的鏈親和素，重復(fù)3次； ③封閉將洗滌后的包被鏈親和素的膠乳顆粒溶于包含所述保護劑B的緩沖液B中，使所述膠乳顆粒的質(zhì)量體積比終濃度為O. Γ0. 3% ； 3)抗人降鈣素原抗體的生物素化 生物素選用商品化的已活化產(chǎn)品，將所述生物素與所述抗人降鈣素原抗體混合，室溫下反應(yīng)l_4h，離心，除去其中少量的沉淀物，將上清裝入透析袋中，在O 4°C下置于PBS緩沖液中透析過夜；所述抗人降鈣素原抗體與所述生物素的摩爾比為I I :100，優(yōu)選I :10 ； 4)生物素化降鈣素原抗體與鏈親和素包被膠乳顆粒的連接 在步驟2)中所得的鏈親和素包被的膠乳顆粒溶液中加入步驟3)中所得的生物素化抗人降鈣素原抗體，混勻后置37°C搖床孵育O. 5^2h,形成膠乳顆粒-鏈親和素-生物素-抗人降鈣素原抗體復(fù)合物； 5)清洗 將步驟4)中形成的膠乳顆粒-鏈親和素-生物素-抗人降鈣素原抗體復(fù)合物溶液離心，棄上清，重復(fù)清洗3次；將末次沉淀溶于含所述保護劑B和防腐劑的緩沖液B中，使所述膠乳顆粒的質(zhì)量體積比終濃度為O. 04、. 16%。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠乳增強免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述試劑盒可在半自動、全自動生化分析儀及散射比濁分析儀上用于定量檢測人體血液中降鈣素原的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量檢測降鈣素原PCT的膠乳增強免疫比濁試劑盒，該試劑盒包括R1試劑包含保護劑、反應(yīng)增強劑、防腐劑和緩沖液；R2試劑包含保護劑、防腐劑、緩沖液和包被抗人PCT抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒；和校準(zhǔn)品包含保護劑、防腐劑、緩沖液及PCT重組蛋白；所述R2試劑中抗人PCT抗體與聚苯乙烯膠乳顆粒之間通過鏈親和素-生物素連接；所述R2試劑中膠乳顆粒粒徑為40~500nm。所述試劑盒可在生化分析儀和散射比濁分析儀上用于定量檢測人體血液中PCT含量。本發(fā)明提供一種方便快速、靈敏度高、特異性強、定量準(zhǔn)確的PCT檢測試劑盒，它儀器兼容性強，檢測成本低，彌補了臨床上對PCT比濁產(chǎn)品的需求。
文檔編號G01N35/00GK102759631SQ20121027308
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者何仕釗 申請人:南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司