一種農(nóng)田土壤中漆酶活性測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種農(nóng)田土壤中漆酶活性測(cè)定方法，本發(fā)明在傳統(tǒng)分光光度法檢測(cè)漆酶活性的基礎(chǔ)上，通過(guò)確定土壤漆酶活性的最適pH、緩沖液、底物、土壤漆酶浸提液三者的添加比例、紫外分光光度計(jì)掃描時(shí)間，建立了一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好的農(nóng)田土壤漆酶活性測(cè)定方法。該方法適用性廣，適合于旱地、水田、水旱輪作、菜園、果園等農(nóng)田土壤樣品中漆酶活性測(cè)定，其操作簡(jiǎn)便、快速，技術(shù)要求相對(duì)較低，適合大批量樣品的分析測(cè)定。
【專利說(shuō)明】一種農(nóng)田土壤中漆酶活性測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物化學(xué)與環(huán)境領(lǐng)域，涉及一種土壤中漆酶活性的測(cè)定方法，尤其是涉及一種農(nóng)田土壤中漆酶活性的測(cè)定方法。適合于科研、教學(xué)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等部門(mén)對(duì)農(nóng)田土壤中有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵酶活性研究。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中漆酶主要來(lái)源于真菌中的擔(dān)子菌、半知菌、子囊菌和一些細(xì)菌，其最主要的生產(chǎn)者是擔(dān)子菌中的白腐菌。土壤中有機(jī)物質(zhì)的主要組成是木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，這些化合物的分解轉(zhuǎn)化對(duì)土壤固碳減排、養(yǎng)分釋放等生態(tài)功能具有重要意義。漆酶催化氧化的物質(zhì)范圍廣，包括多聚苯酚、甲氧基苯酚(木質(zhì)素類物質(zhì))、芳香胺等。在對(duì)木質(zhì)素類物質(zhì)的降解過(guò)程中，漆酶主要攻擊其苯酚結(jié)構(gòu)單元，并可將木質(zhì)素徹底降解為CO2和水。因此，漆酶是土壤有機(jī)物質(zhì)中木質(zhì)素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶之一。對(duì)于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，漆酶對(duì)農(nóng)田土壤中秸桿、腐殖質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化有重要貢獻(xiàn)，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)力，測(cè)定農(nóng)田土壤中漆酶活性對(duì)研究農(nóng)田土壤有機(jī)質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化機(jī)制具有重大意義。
[0003]一般采用分光光度法檢測(cè)漆酶活性，利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的不同，可直接測(cè)定反應(yīng)混合物中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。常用的底物是包括ABTS(以2，2’ -連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛連氮、鄰甲聯(lián)苯胺和愈創(chuàng)木酚。目前，測(cè)定由純培養(yǎng)菌株產(chǎn)生以及堆肥、森林生態(tài)系統(tǒng)等漆酶濃度較高環(huán)境中的漆酶活性，其研究較廣泛，測(cè)定方法較為成熟且穩(wěn)定。然而，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤中漆酶活性相對(duì)較低，一般占森林土壤的1/3?1/5。測(cè)定農(nóng)田土壤漆酶活性過(guò)程中，一方面底物(ABTS等)快速消耗，難以把握酶促反應(yīng)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，另一方面受人為干擾，如施肥、土地利用方式轉(zhuǎn)變等影響，漆酶浸提液穩(wěn)定性難以控制，這對(duì)漆酶活性測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性造成很大影響。因此，測(cè)定農(nóng)田土壤漆酶活性時(shí)，確定土壤漆酶活性的最適pH、緩沖液、底物、土壤漆酶浸提液三者的添加比例、紫外分光光度計(jì)掃描時(shí)間是關(guān)鍵。據(jù)此，迫切需要建立一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好的農(nóng)田土壤漆酶活性測(cè)定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是在于提供了一種農(nóng)田土壤中漆酶活性的測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，技術(shù)要求相對(duì)較低，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適合于批量農(nóng)田土壤漆酶活性的精確測(cè)定。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0006]一種農(nóng)田土壤中漆酶活性測(cè)定方法，其步驟如下:
[0007]A、土壤漆酶浸提液的提取
[0008](I)稱取3?5g待測(cè)土壤樣品(過(guò)2mm篩的風(fēng)干土)于無(wú)菌離心管中，加6ml50mM磷酸緩沖液(pH =7.1),渦旋混勻，每個(gè)樣品三次平行。[0009](2)于室溫(20~25°C，以下相同)超聲波水浴10~20min。
[0010](3) 4000~8000 X g離心10~20min，收集上清液，獲得土壤漆酶浸提液，置于4°C保存待用。B、酶活性測(cè)定
[0011](I)最適pH值的確定
[0012]①采用電位法(GB7859)測(cè)定一批土地利用方式(水田或旱地或菜園地等)一致的土壤樣品的PH值(水土比為2.5:1，v:w)，將pH相近(±0.2個(gè)pH單位)(樣品的最大和最小PH的差值不超過(guò)0.4個(gè)pH單位)的土壤樣品歸為一類，同時(shí)選其中pH居中的樣品用于測(cè)定該類土壤中漆酶的最適pH。
[0013]②配制步驟①中選取的土壤樣品pH±2范圍內(nèi)的所有伯瑞坦-羅比森緩沖液(B-R緩沖液)；③測(cè)定前將土壤漆酶浸提液置于25~30°C水浴中20~30min以恢復(fù)酶活性，測(cè)定時(shí)環(huán)境溫度保持25~30°C。同時(shí)，做兩個(gè)陰性對(duì)照，分別為無(wú)反應(yīng)底物2，2-聯(lián)氮基-雙- (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)對(duì)照(用于檢測(cè)底物ABTS是否被氧化)和熱變性漆酶浸提液對(duì)照(用于檢測(cè)漆酶的最適溫度)。
[0014]④以雙蒸水為空白，在紫外分光光度計(jì)上420nm處校零。將B-R緩沖液、底物30mMABTS溶液、漆酶浸提液按(17:2:1，V: V: V)的比例添加到離心管至終體積3mL，迅速混勻后，倒入比色皿內(nèi)，立即放入紫外分光光度計(jì)，并掃描5min(掃描時(shí)間為吸光值經(jīng)快速增長(zhǎng)后達(dá)到平臺(tái)期時(shí)為止)，每個(gè)平行樣品測(cè)定四次。 [0015]⑤待測(cè)液中漆酶酶活性的計(jì)算:以U/L表示酶活性濃度，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定在線


ΛΑ V X IO6
性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化(AAMmin)計(jì)算:TJ/L = — xf



amui € X y X ￡
[0016]式中:V為反應(yīng)體系體積(ml)，ε為摩爾消光系數(shù)(cm2.moF1)，V為樣品量(ml)，L為比色杯光徑(cm), Δ A為計(jì)時(shí)開(kāi)始到最大吸光值時(shí)吸光度變化，Δη?η為吸光值最大與最小時(shí)的時(shí)間差，IO6為將mol換算成μπιο?。
[0017]每克干土中漆酶活性=酶活性濃度/干土質(zhì)量。
[0018]⑥掃描曲線平滑、完整且酶活性最大時(shí)對(duì)應(yīng)的伯瑞坦-羅比森緩沖液的pH值為該批次土壤漆酶的最適PH值，同時(shí)最適pH值對(duì)應(yīng)的漆酶活性即為該土壤的漆酶活性。
[0019](2) pH相近土壤的漆酶活性測(cè)定
[0020]采用步驟B (I)⑥得到最適pH的B-R緩沖液，根據(jù)步驟B (I)③~④測(cè)定該批次pH相近的土壤樣品的漆酶活性。
[0021]本發(fā)明所述方法適合于旱地、水田、水旱輪作、菜園、果園等農(nóng)田土壤樣品中漆酶活性測(cè)定。本發(fā)明方法適用于漆酶活性> 1.5U/g干土的土壤環(huán)境樣品，檢測(cè)結(jié)果線性關(guān)系良好。而且漆酶活性越大，越容易測(cè)定，目前 申請(qǐng)人:測(cè)得的農(nóng)田土壤中漆酶最大活性遠(yuǎn)未達(dá)到本發(fā)明所述方法的檢測(cè)最大值。
[0022]進(jìn)一步的:
[0023]本發(fā)明所述方法在檢測(cè)的同時(shí)可由以下步驟進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性:
[0024]稱取0.03OOg 純漆酶(≥ 50units/mg, sigma，貨號(hào) L2I57-1OKU)于 Iml5OmM 磷酸緩沖液(pH = 7.1)中，渦旋振蕩至充分溶解。分別吸取150、75、38、19、10μ I漆酶溶液，至用于測(cè)定最適PH的土壤漆酶提取液中，在最適pH條件下，利用上述步驟B(I)中③~④測(cè)定漆酶活性。根據(jù)米氏方程:V = VmaxX[S]/(Km+[S])，其中V為反應(yīng)速度(用某一時(shí)間段吸光值的差值A(chǔ)ABS來(lái)指示)，Km值稱為米氏常數(shù)，Vmax是酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，[S]為底物濃度(用添加漆酶溶液的體積V。來(lái)指示)，換算后1/V = (Km/Vmax) X (1/[S])+1/Vmax,即1/\與1/AABS應(yīng)符合線性關(guān)系，表示該方法測(cè)定漆酶活性準(zhǔn)確、可靠。
[0025]所述的50mM磷酸緩沖液配制(pH = 7.1)方法如下:
[0026]50mM 磷酸二氫鈉(NaH2PO4.H2O)貯液:稱 8.907g NaH2PO4.2H20 溶于于足量水中，使終體積為IL ；
[0027]50mM磷酸氫二鈉(Na2HPO4)貯液:稱17.907g Na2HPO4.12H20溶于足量水中，使終體積為IL ；
[0028]50mM磷酸緩沖液(pH = 7.1)配制:量取50mM磷酸二氫鈉330ml及50mM磷酸氫二鈉670ml，使其最終pH值為7.1。
[0029]所述的伯瑞坦-羅比森緩沖液(B-R緩沖液)，配制方法為:于100mL三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸的濃度均為0.04mol/L)中，加入表中指定體積的0.2mol/L NaOH,即得相應(yīng)pH值的B-R緩沖液。
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種農(nóng)田土壤中漆酶活性測(cè)定方法，其步驟如下: A、土壤漆酶浸提液的提取 (1)稱取3~5g待測(cè)土壤樣品于無(wú)菌離心管中，加6ml50mMpH = 7.1的磷酸緩沖液，渦旋混勻，每個(gè)樣品三次平行； (2)于室溫超聲波水浴10~20min； (3)4000~8000 X g離心10~20min，收集上清液，獲得土壤漆酶浸提液，置于4°C保存待用；B、漆酶活性測(cè)定 (1)最 適pH值的確定 ①采用電位法測(cè)定一批土地利用方式一致的土壤樣品的PH值，水土比為2.5:1，v:w,將PH相近的土壤樣品歸為一類，同時(shí)選其中pH居中的樣品用于測(cè)定該類土壤中漆酶的最適PH ;②配制步驟①中選取的土壤樣品pH±2范圍內(nèi)的所有伯瑞坦-羅比森緩沖液； ③測(cè)定前將土壤漆酶浸提液置于25~30°C水浴中20~30min以恢復(fù)酶活性，測(cè)定時(shí)環(huán)境溫度保持25~30°C ;同時(shí)，做兩個(gè)陰性對(duì)照，分別為無(wú)反應(yīng)底物2，2-聯(lián)氮基-雙- (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽對(duì)照和熱變性漆酶浸提液對(duì)照； ④以雙蒸水為空白，在紫外分光光度計(jì)上420nm處校零，將B-R緩沖液、底物30mMABTS溶液、漆酶浸提液按17:2:1(V:V:V)的比例添加到離心管至終體積3mL，迅速混勻后，倒入比色皿內(nèi)，立即放入紫外分光光度計(jì)，并掃描5min，每個(gè)平行樣品測(cè)定四次； ⑤待測(cè)液中漆酶酶活性的計(jì)算:以U/L表示酶活性濃度，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定在線性范
圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化(Δ A/ Amin)計(jì)算
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B(I)①中，pH相近的土壤樣品為不同的土壤樣品，其最大pH值與最小pH值的差值不超過(guò)0.4個(gè)pH單位。
【文檔編號(hào)】G01N21/33GK104020122SQ201410279257
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】陳香碧, 馮書(shū)珍, 蘇以榮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所