專利名稱：銀雜化sba-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及應(yīng)用。具體是采用銀雜化介孔SBA-15即Ag@SBA-15復(fù)合材料，制備一種檢測多種腫瘤標(biāo)志物的無標(biāo)記型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤標(biāo)志物是腫瘤組織自身產(chǎn)生的，可以反映腫瘤的存在和生長的 一類生化物質(zhì)。它們可能不存在于正常成人組織而僅見于胚胎組織，或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量，它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，從而幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)等。腫瘤標(biāo)志物為腫瘤早發(fā)現(xiàn)提供了可能，腫瘤標(biāo)志物的檢測更被列入了體檢項目。目前檢測腫瘤標(biāo)志物的方法主要有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析及電化學(xué)免疫分析等，但是這些檢測方法存在以下不足。I、放射免疫分析具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，反應(yīng)條件要求一般，但是該技術(shù)所用試劑具有放射性，對人體有一定的危害。2、酶聯(lián)免疫分析具有很高的靈敏度，所用儀器簡單，但是該方法是一次性的，響應(yīng)時間長，并且無法重復(fù)測量。3、化學(xué)發(fā)光免疫分析具有靈敏度高、響應(yīng)時間短的特點(diǎn)，但是發(fā)光分子的發(fā)光時間較短，并且只能利用一次。4、電化學(xué)免疫分析具有操作簡便、響應(yīng)時間短和選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，一般來講其靈敏度相對電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器低一些。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種簡單、快速、靈敏度高和選擇性高的電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。經(jīng)對現(xiàn)有專利技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，目前在免疫傳感器領(lǐng)域，CN200910212772. 0公開了一種電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，使用核殼結(jié)構(gòu)的SiO2包裹發(fā)光物質(zhì)Ru(bpy)32+固載甲胎蛋白的二抗，該傳感器的線性范圍為0. 05 20ng/mL，檢測限為35pg/mL。CN201110199112. 0公開了一種磷化蛋白的電化學(xué)免疫傳感器，該傳感器的線性范圍為 0. 02 20ng/mL，檢測限為 0. 01ng/mL。CN201010524197. 0公開了一種檢測腫瘤標(biāo)志物的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研
究及應(yīng)用。以上發(fā)明均為夾心型免疫傳感器，本發(fā)明的無標(biāo)記免疫傳感器與之相比制備過程簡單易行。另外，CN201110043433. I公開了一種非標(biāo)記型電流型免疫傳感器及其制備方法及應(yīng)用，該傳感器對癌胚抗原的檢測限達(dá)到3pg/mL。本發(fā)明采用Ag@SBA-15復(fù)合材料作為傳感器構(gòu)建材料，降低了傳感器的檢出限，方法用于多種腫瘤標(biāo)志物的分析，其檢測限I. 3 I. 5pg/mL之間。由此可見，本發(fā)明將AgOSBA-15復(fù)合材料引入傳感器的制備中，使方法的靈敏度提高超過了 100%。本發(fā)明采用Ag@SBA-15復(fù)合材料構(gòu)建的無標(biāo)記型免疫傳感器，是一種低成本、高靈敏、特異性好、快速檢測腫瘤標(biāo)志物的技術(shù)，且制備過程簡單，有效克服了目前腫瘤標(biāo)志物檢測方法的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是避免傳統(tǒng)檢測方法的儀器復(fù)雜、響應(yīng)時間長、選擇性和靈敏度低等缺點(diǎn)，提供一種快速且靈敏度高的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之二是將該電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
I.本發(fā)明銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，其特征是包括以下步驟
(1)AgiSBA-15納米復(fù)合材料的制備；
(2)Ru (bpy) 32+ 與 AgOSBA-15 復(fù)合材料(Ru (bpy) 32+-Ag@SBA_15)的制備；
(3)抗體固載的Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15 免疫復(fù)合物(Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15/Ab)的制
備;
(4)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備。(I)中所述的Ag@SBA-15納米復(fù)合材料的制備,步驟如下取2mL銀納米粒子膠體溶液和4 6mg氨基化的SBA-15，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ag@SBA_15。(2)中所述的Ru (bpy)/+-AgOSBA-15的制備,步驟如下取5 15mg十二燒基磺酸鈉超聲溶解于3mL超純水中，將Ag@SBA-15加到上述溶液中，震蕩24h，離心分離，去除上清液。然后加入2mL I X 10_3mol/L Ru (bpy) 32+溶液，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15，分散在 500ML 的 PBS 溶液(pH=7. 4)中，避光保存。(3)中所述的 Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab 的制備,步驟如下
1)殼聚糖-離子液體的配制將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5%的殼聚糖溶液，然后用該殼聚糖溶液稀釋離子液體I- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，得到離子液體濃度為5 15 ng/mL的殼聚糖-離子液體；
2)取濃度10Pg/mL 的腫瘤標(biāo)志物抗體 400 600ML 和 500ML Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15的PBS溶液混合，在4°C的培養(yǎng)箱中震蕩24h，然后，在冷凍離心機(jī)中離心分離，得到Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab，將其分散在500ML的殼聚糖-離子液體中，保存在4°C的冰箱中。(4)中所述的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I.0,0. 3和0. 05Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在一 0. 2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將3 5MLRu(bpy)32+-AgiSBA-15/Ab滴涂到電極表面，4°C冰箱中保存至干燥；
3)滴涂3MLlOOl^g/mL牛血清白蛋白，4°C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，即制得腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，將其保存在4°C的冰箱中。2.本發(fā)明所述的制備的銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征是用于腫瘤標(biāo)志物的檢測,步驟如下(1)本發(fā)明將所述腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器作為工作電極，在其表面滴涂6ML不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原，4°C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干，保存在4°C的冰箱中；
(2)將Ag/AgCl參比電極、鉬絲對電極和(I)中所述滴涂上腫瘤標(biāo)志物抗原的工作電極正確連接在化學(xué)發(fā)光檢測儀的暗盒中，將電化學(xué)工作站和化學(xué)發(fā)光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設(shè)置為800 V，掃描電壓設(shè)置為0 I. 2 V ;
(3)在pH=7.4 8. 5的磷酸鹽緩沖溶液中，含有2. 5 3. 5mmol/L三乙胺，通過電化學(xué)發(fā)光法檢測腫瘤標(biāo)志物抗原滴加前后電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化；
(4)根據(jù)所得的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物抗原濃度的線性關(guān)系，繪制工作曲線。3.本發(fā)明所述的銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征是所述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、乳腺癌易感基因(CA15-3)、卵巢癌 糖類抗原(CA125)、糖蛋白抗原(CA50)、CA 19-9, CA549、CA72-4、鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原(SCC)、NMP22、CA242、前列腺特異性抗原(PSA)、細(xì)胞角蛋白、磷化蛋白(p53)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、人胎盤催乳素(HPL)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、生長激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)。本發(fā)明的有益成果
(I)采用銀納米粒子雜化介孔SBA-15得到Ag@SBA-15復(fù)合材料，既保留了兩種納米材料的優(yōu)點(diǎn)，又體現(xiàn)出優(yōu)異的協(xié)同增敏效果，顯著提高了電極表面的電子傳遞效率。(2)利用Ag@SBA-15納米復(fù)合材料具有良好的生物相容性，大的比表面積，固載更多的抗體和發(fā)光物質(zhì)；銀納米粒子的引入，促進(jìn)了 Ru(bpy)32+的發(fā)光，顯著放大了檢測信號的強(qiáng)度。(3)陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉被包覆于Ag@SBA-15納米復(fù)合材料表面，因其靜電作用在材料表面吸附更多的發(fā)光物質(zhì)Ru (bpy) 32+，使制得的傳感器具有更高的靈敏度。(4)利用電極表面的層層自組裝技術(shù)及殼聚糖-離子液體的成膜作用，將發(fā)光物質(zhì)Ru (bpy) 32+和納米復(fù)合材料牢固地修飾在電極表面，防止檢測過程中出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。(5)本發(fā)明利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)，提高了檢測方法的特異性。(6)本發(fā)明制備的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于多種腫瘤標(biāo)志物的檢測，發(fā)光物質(zhì)用量少，響應(yīng)時間短，可以實(shí)現(xiàn)簡單、快速、高靈敏和特異性檢測。


圖I為腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I
(I) AgiSBA-15納米復(fù)合材料的制備,步驟如下
I)銀納米粒子的制備在錐形瓶中加入48mL超純水,攪拌下加入ImL 50mmol/L AgNO3溶液和ImL 5%檸檬酸鈉溶液。然后，在上述溶液中加入少量的硼氫化鈉固體，持續(xù)攪拌IOmin,溶液變?yōu)樽攸S色，表明形成銀納米粒子。持續(xù)攪拌，直到銀納米粒子膠體溶液的顏色不再變化。離心分離，將上清液避光保存；
2 ) AgiSBA-15納米復(fù)合材料的制備取2mL銀納米粒子膠體溶液和4mg氨基化的SBA-15，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ag@SBA-15。(2) Ru (bpy)/+-AgOSBA-15 的制備，步驟如下
5mg十二烷基磺酸鈉超聲溶解于3mL超純水中，將Ag@SBA-15加到上述溶液中，震蕩24h，離心分離，去除上清液。然后加入2mL lX10_3mol/L Ru (bpy) 32+溶液，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15，分散在500ML的PBS溶液(pH=7. 4)中，避光保存。(3) Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab 的制備，步驟如下
1)殼聚糖-離子液體的配制將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5%的殼聚糖溶液，然后用該殼聚糖溶液稀釋離子液體I- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，得到離子液體濃度為5ng/mL的殼聚糖-離子液體；
2)取濃度lOPg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體400ML和500MLRu (bpy) 32+-Ag@SBA-15的PBS溶液混合，在4°C的培養(yǎng)箱中震蕩24h，然后，在冷凍離心機(jī)中離心分離，得到Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab，將其分散在500ML的殼聚糖-離子液體中，保存在4°C的冰箱中。(4)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，結(jié)合圖I進(jìn)行制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I.0,0. 3和0. 05Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在一 0. 2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將3MLRu(bpy)32+-AgiSBA-15/Ab滴涂在步驟I)處理的玻碳電極表面，4°C冰箱中保存至干燥；
3)滴涂3MLlOOl^g/mL牛血清白蛋白，4°C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，保存在4°C的冰箱中。實(shí)施例2
(I) AgiSBA-15納米復(fù)合材料的制備,步驟如下
1)銀納米粒子的制備在錐形瓶中加入48mL超純水,攪拌下加入ImL50mmol/L AgNO3溶液和ImL 5%檸檬酸鈉溶液。然后，在上述溶液中加入少量的硼氫化鈉固體，持續(xù)攪拌10min,溶液變?yōu)樽攸S色，表明形成銀納米粒子。持續(xù)攪拌，直到銀納米粒子膠體溶液的顏色不再變化。離心分離，將上清液避光保存；
2)AgiSBA-15納米復(fù)合材料的制備取2mL銀納米粒子膠體溶液和5mg氨基化的SBA-15，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ag@SBA-15。(2) Ru (bpy)/+-AgOSBA-15 的制備，步驟如下
IOmg十二烷基磺酸鈉超聲溶解于3mL超純水中，將Ag@SBA_15加到上述溶液中，震蕩24 h，離心分離，去除上清液。然后加入2mL IXlO-3 mol/L Ru (bpy) 32+溶液，震蕩24 h，離心分離，去除上清液，得到Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15，分散在500ML的PBS溶液(pH=7. 4)中，避光保存。(3) Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab 的制備，步驟如下1)殼聚糖-離子液體的配制將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5%的殼聚糖溶液，然后用該殼聚糖溶液稀釋離子液體I- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，得到離子液體濃度為10ng/mL的殼聚糖-離子液體；
2)取濃度lOPg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體500ML和500MLRu (bpy) 32+-Ag@SBA-15的PBS溶液混合，在4°C的培養(yǎng)箱中震蕩24h，然后，在冷凍離心機(jī)中離心分離，得到Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab，將其分散在500ML的殼聚糖-離子液體中，保存在4°C的冰箱中。(4)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，結(jié)合圖I進(jìn)行制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I.0,0. 3和0. 05Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在一 0. 2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將4MLRu(bpy)32+-Ag@SBA-15/Ab滴涂在步驟I)處理的玻碳電極表面，4°C冰箱中 保存至干燥；
3)滴涂3MLlOOl^g/mL牛血清白蛋白，4°C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，保存在4°C的冰箱中。實(shí)施例3
(I) AgiSBA-15納米復(fù)合材料的制備,步驟如下
I)銀納米粒子的制備在錐形瓶中加入48mL超純水,攪拌下加入ImL 50mmol/L AgNO3溶液和ImL 5%檸檬酸鈉溶液。然后，在上述溶液中加入少量的硼氫化鈉固體，持續(xù)攪拌10min,溶液變?yōu)樽攸S色，表明形成銀納米粒子。持續(xù)攪拌，直到銀納米粒子膠體溶液的顏色不再變化。離心分離，將上清液避光保存；
2) AgiSBA-15納米復(fù)合材料的制備取2mL銀納米粒子膠體溶液和6mg氨基化的SBA-15，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ag@SBA-15。(2) Ru (bpy)/+-AgOSBA-15 的制備，步驟如下
15mg十二烷基磺酸鈉超聲溶解于3mL超純水中，將Ag@SBA_15加到上述溶液中，震蕩24h，離心分離，去除上清液。然后加入2mL IXlO-3 mol/L Ru (bpy) 32+溶液，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15，分散在500ML的PBS溶液(pH=7. 4)中，避光保存。(3) Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab 的制備，步驟如下
1)殼聚糖-離子液體的配制將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5%的殼聚糖溶液，然后用該殼聚糖溶液稀釋離子液體I- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，得到離子液體濃度為15 ng/mL的殼聚糖-離子液體；
2)取濃度lOPg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體600ML和500MLRu (bpy) 32+-Ag@SBA-15的PBS溶液混合，在4°C的培養(yǎng)箱中震蕩24h，然后，在冷凍離心機(jī)中離心分離，得到Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab，將其分散在500ML的殼聚糖-離子液體中，保存在4°C的冰箱中。(4)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，結(jié)合圖I進(jìn)行制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I.0,0. 3和0. 05Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在一 0. 2 0. 6V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將5MLRu(bpy)32+-Ag@SBA-15/Ab滴涂在步驟I)處理的玻碳電極表面，4°C冰箱中保存至干燥；
3)滴涂3ML lOOl^g/mL牛血清白蛋白，4°C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，保存在4°C的冰箱中。實(shí)施例4
實(shí)施例I 3制備的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，用于腫瘤標(biāo)志物檢測，步驟如
下
(I)本發(fā)明將所述腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器作為工作電極，在其表面滴涂6ML不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原，4°C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干，保存在4°C的冰箱中；
(2 )將Ag/AgCl參比電極、鉬絲對電極和(I)中所述滴涂上腫瘤標(biāo)志物抗原的工作電極 正確連接在化學(xué)發(fā)光檢測儀的暗盒中，將電化學(xué)工作站和化學(xué)發(fā)光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設(shè)置為800V，掃描電壓設(shè)置為0 I. 2V ;
(3)在？11=7.4 8. 5的磷酸鹽緩沖溶液中，含有2. 5 3. 5mmol/L三乙胺，通過電化學(xué)發(fā)光法檢測腫瘤標(biāo)志物抗原滴加前后電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化；
(4)根據(jù)所得的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物抗原濃度的線性關(guān)系，繪制工作曲線。實(shí)施例5糖蛋白抗原類，CA 15-3的檢測
根據(jù)實(shí)施例I 3制備一種檢測CA15-3的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器,根據(jù)實(shí)施例4將制得的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測儀，對CA15-3抗原進(jìn)行檢測，同時采用相同的材料與方法制備了 CA15-3電化學(xué)免疫傳感器，并與其結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果見表I。表I CA15-3的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器與電化學(xué)免疫傳感器檢測效果對比
權(quán)利要求
1.銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，其特征是包括以下步驟 (1)銀雜化的SBA-15(AgiSBA-15)納米復(fù)合材料的制備；(2)Ru (bpy) 32+ 與 AgOSBA-15 復(fù)合材料(Ru (bpy) 32+-Ag@SBA_15)的制備； (3)抗體固載的Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15 免疫復(fù)合物(Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15/Ab)的制備; (4)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，其特征是所述AgiSBA-15納米復(fù)合材料的制備,步驟如下取2mL銀納米粒子膠體溶液和4 6mg氨基化的SBA-15，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ag@SBA-15。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，其特征是所述Ru(bpy)32+-Ag@SBA-15的制備，步驟如下取5 15mg十二燒基磺酸鈉超聲溶解于3mL超純水中，將Ag@SBA-15加到上述溶液中，震蕩24h，離心分離，去除上清液；然后加入2mL I X l(r3m0l/L Ru (bpy) 32+溶液，震蕩24h，離心分離，去除上清液，得到Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15，再分散于500ML的PBS溶液(pH=7. 4)中，避光保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，其特征是所述Ru (bpy) 32+-AgiSBA-15/Ab的制備,包括以下步驟 (1)殼聚糖-離子液體的配制將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5%的殼聚糖溶液，然后用該殼聚糖溶液稀釋離子液體I- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，得到離子液體濃度為5 15ng/mL的殼聚糖-離子液體； (2)取濃度lOPg/mL 的腫瘤標(biāo)志物抗體 400 600ML 和 500ML Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15的PBS溶液混合，在4°C的培養(yǎng)箱中震蕩24h，然后，在冷凍離心機(jī)中離心分離，得到Ru (bpy) 32+-Ag@SBA-15/Ab，將其分散在500ML的殼聚糖-離子液體中，保存在4°C的冰箱中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，其特征是所述電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備，包括以下步驟 (1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I.0,0. 3和0. 05Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0. 2 0. 6V掃描，峰電位差小于IlOmV ； (2)將3 5MLRu(bpy)32+-AgiSBA-15/Ab滴涂到電極表面，4°C冰箱中保存至干燥； (3)滴涂3MLlOOl^g/mL牛血清白蛋白，4°C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，保存在4°C的冰箱中。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5所述的制備的銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征是用于腫瘤標(biāo)志物的檢測，步驟如下 (1)將所述腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器作為工作電極，在其表面滴涂6ML不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原，4°C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干，保存在4°C的冰箱中； (2)將Ag/AgCl參比電極、鉬絲對電極和(I)中所述滴涂上腫瘤標(biāo)志物抗原的工作電極正確連接在化學(xué)發(fā)光檢測儀的暗盒中，將電化學(xué)工作站和化學(xué)發(fā)光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設(shè)置為800V，掃描電壓設(shè)置為0 I. 2V ; (3)在？11=7.4 8. 5的磷酸鹽緩沖溶液中，含有2. 5 3. 5mmol/L三乙胺，通過電化學(xué)發(fā)光法檢測腫瘤標(biāo)志物抗原滴加前后電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化；(4)根據(jù)所得的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物抗原濃度的線性關(guān)系，繪制工作曲線。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6所述的銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征是所述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、乳腺癌易感基因(CA15-3)、卵巢癌糖類抗原(CA125)、糖蛋白抗原(CA50)、CA 19-9, CA549、CA72-4、鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原(SCC)、NMP22、CA242、前列腺特異性抗原(PSA)、細(xì)胞角蛋白、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、人胎盤催乳素(HPL)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、生長激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)。
全文摘要
本發(fā)明涉及銀雜化SBA-15電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及應(yīng)用。本發(fā)明使用Ru(bpy)32+作為發(fā)光物質(zhì)，介孔納米材料SBA-15具有大的比表面積和良好的生物相容性，可用作固載Ru(bpy)32+和腫瘤標(biāo)志物抗體的基底材料，在SBA-15表面包覆上陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉，通過靜電作用吸附更多的Ru(bpy)32+，并在SBA-15中雜化銀納米粒子，從而促進(jìn)Ru(bpy)32+的發(fā)光。本發(fā)明所制備的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速、制備過程簡單的特點(diǎn)，適用于血清中多種腫瘤標(biāo)志物的快速檢測。
文檔編號G01N27/36GK102778453SQ20121027984
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者于海琴, 吳丹, 張勇, 曹偉, 朱寶存, 李小建, 李玉陽, 李賀, 杜斌, 羅川南, 馬洪敏, 魏琴 申請人:濟(jì)南大學(xué)