可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種可實現(xiàn)對血紅蛋白在較大濃度范圍內(nèi)快速、靈敏檢測的可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器，是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，所述工作電極按照如下步驟的方法制成：將玻碳電極做為工作電極的三電極體系放入含石墨烯、甲苯胺藍(lán)的pH5.0醋酸鈉?醋酸緩沖溶液中，在?0.8～1.3V的電位范圍內(nèi)，以100mV／s掃速循環(huán)伏安掃描25圈，制得石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極；再將所制備的石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極做為工作電極的三電極體系放入含氯鉑酸及氯化鈉的水溶液中，在工作電極與參比電極之間施加?0.7~?0.8V恒定電勢，施加時間60～240s。
【專利說明】
可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)傳感器，尤其是一種可實現(xiàn)對血紅蛋白在較大濃度范圍內(nèi)快速、靈敏檢測的可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]血紅蛋白是高等生物體內(nèi)的一種重要蛋白質(zhì)，它負(fù)責(zé)運載氧，參與血液中二氧化碳的運輸以及血液PH值的調(diào)節(jié)，臨床上，血紅蛋白的檢測可為肺部疾病、心血管疾病以及一些腫瘤疾病提供診斷依據(jù)，因此，快速、靈敏地檢測血液中血紅蛋白含量具有重要意義。以往血紅蛋白的常用檢測方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法等，這些方法都需要制備生物抗體，利用血紅蛋白與其生物抗體的特異反應(yīng)(即免疫反應(yīng))進(jìn)行檢測，生物抗體制備周期較長，提純技術(shù)繁瑣。不僅如此，放射免疫技術(shù)還需要特殊實驗室，而酶聯(lián)免疫技術(shù)耗時較多。因此，探索一種不用抗體的蛋白質(zhì)檢測方法具有重要科學(xué)價值和實際意義。從分子結(jié)構(gòu)來看，每一血紅蛋白分子由四分子的珠蛋白和四分子亞鐵血紅素組成，每個血紅素又由4個吡咯環(huán)構(gòu)成，在吡咯環(huán)中央有一個鐵原子，通常這個鐵是正三價的(Fe( ΙΠ ))，若三價的鐵變成二價的鐵(Fe( Π ))會產(chǎn)生電化學(xué)信號。
[0003]電化學(xué)傳感器是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，是一種利用電化學(xué)信號變化對被測樣品進(jìn)行檢測的裝置，具有靈敏度高、制備簡便、成本低、易于微型化、適合現(xiàn)場檢測等特點，是迄今為止最為成熟的生物傳感技術(shù)之一。金松子等利用天然卵磷脂一月桂酸膜修飾玻碳電極為工作電極，構(gòu)建電化學(xué)傳感器，該電化學(xué)傳感器對血紅蛋白響應(yīng)靈敏，檢測限低，受干擾少(化學(xué)學(xué)報2002，60，1269—1273);林麗等將納米銀粒子修飾的銀盤為工作電極，構(gòu)建電化學(xué)傳感器，用于血紅蛋白的檢測，在一定濃度范圍內(nèi)，電化學(xué)檢測峰電流與血紅蛋白濃度呈良好的線性關(guān)系(分析化學(xué)，2006，34(1):31 —34.)。
[0004]上述電化學(xué)傳感器雖能夠?qū)ρt蛋白進(jìn)行很好的檢測，但其檢測范圍較窄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種可實現(xiàn)對血紅蛋白在較大濃度范圍內(nèi)快速、靈敏檢測的可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器，是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，其特征在于所述工作電極按照如下步驟的方法制成:
a.將玻碳電極做為工作電極，將與參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含石墨烯、甲苯胺藍(lán)的PH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液中，所述石墨烯、甲苯胺藍(lán)與pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液的用量比為3?40yg:0.3-1.5 mmol: 1L;在-0.8?1.3 V的電位范圍內(nèi)，以100mV/s掃速循環(huán)伏安掃描25圈，制得石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極；
b.將a步驟制備的石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極用二次蒸餾水沖洗后做為工作電極，將與參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含氯鉑酸及氯化鈉的水溶液中，所述氯鉑酸、氯化鈉與水的用量比為10?25 mmol:0.1 mol: 1L，在工作電極與參比電極之間施加-0.7?-0.8V恒定電勢，施加時間60?240s，取工作電極用二次蒸餾水沖洗。
[0007]本發(fā)明是以納米鉑/甲苯胺藍(lán)/石墨烯復(fù)合物修飾玻碳電極為電化學(xué)傳感器的工作電極，能夠催化還原血紅蛋白并利用催化還原血紅蛋白過程中的電化學(xué)信號變化，實現(xiàn)對血紅蛋白在較大濃度范圍內(nèi)的快速、靈敏檢測，制備簡單、成本低。
【附圖說明】
[0008]圖1是本實施例1與不同工作電極構(gòu)成的電化學(xué)傳感器在含有0.lmmol/L的[Fe(CN)6]3V4—的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安圖。
[0009]圖2為實施例1與不同工作電極構(gòu)成的電化學(xué)傳感器在含有0.lmmol/L的[Fe(CN)6]3—/4—的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中的電化學(xué)交流阻抗圖。
[0010]圖3為本發(fā)明實施例1的掃描電鏡觀察到的工作電極表面形貌圖。
[0011 ]圖4為本實施例1與不同工作電極構(gòu)成的電化學(xué)傳感器在含有血紅蛋白的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中的電化學(xué)循環(huán)伏安圖。
[0012]圖5是利用示差脈沖伏安法(DPV)考察本發(fā)明實施例1的電化學(xué)傳感器對濃度為1.0X 10—4g/mL的不同蛋白質(zhì)的選擇性。
[0013]圖6為本發(fā)明實施例1的DPV曲線響應(yīng)電流變化值與血紅蛋白濃度的關(guān)系。
【具體實施方式】
[0014]實施例1:
本發(fā)明的可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器，同現(xiàn)有技術(shù)是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，其特征在于所述工作電極按照如下步驟的方法制成:
a.首先按照現(xiàn)有技術(shù)，利用溴化物修飾電極表面，將玻碳電極做為工作電極，飽和甘汞電極做參比電極、鉑電極做對電極，將工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含石墨烯、甲苯胺藍(lán)的PH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液中，所述石墨烯、甲苯胺藍(lán)與pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液的用量比為3yg:0.3 mmol:lL；在-0.8?1.3V的電位范圍內(nèi)，以100mV/s掃速循環(huán)伏安掃描25圈，制得石墨稀/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極；
b.將a步驟制備的石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極用二次蒸餾水沖洗后做為工作電極，與飽和甘汞電極、鉑電極構(gòu)成三電極體系，放入含氯鉑酸及氯化鈉的水溶液中，所述氯鉑酸、氯化鈉與水的用量比為1 mmol: 0.1 mo 1:1L，在工作電極與參比電極之間施加_0.7V恒定電勢，施加時間60s，取工作電極用二次蒸餾水沖洗。
[0015]實施例2:
本發(fā)明的可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器，同現(xiàn)有技術(shù)是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，其特征在于所述工作電極按照如下步驟的方法制成:
a.首先按照現(xiàn)有技術(shù)，利用溴化物修飾電極表面，將玻碳電極做為工作電極，銀/氯化銀電極做參比電極、鉑電極做對電極，將工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含石墨烯、甲苯胺藍(lán)的PH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液中，所述石墨烯、甲苯胺藍(lán)與pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液的用量比為1yg:0.5 mmol:1L;在-0.8?1.3V的電位范圍內(nèi)，以10mV/s掃速循環(huán)伏安掃描25圈，制得石墨稀/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極； b.將a步驟制備的石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極用二次蒸餾水沖洗后做為工作電極，與銀/氯化銀電極、鉑電極構(gòu)成三電極體系，放入含氯鉑酸及氯化鈉的水溶液中，所述氯鉑酸、氯化鈉與水的用量比為20 mmol: 0.1 mo 1:1L，在工作電極與參比電極之間施加_0.8V恒定電勢，施加時間240s，取工作電極用二次蒸餾水沖洗。
[0016]實施例3:
本發(fā)明的可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器，同現(xiàn)有技術(shù)是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，其特征在于所述工作電極按照如下步驟的方法制成:
a.首先按照現(xiàn)有技術(shù)，利用溴化物修飾電極表面，將玻碳電極做為工作電極，銀/氯化銀電極做參比電極、鉑電極做對電極，將工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含石墨烯、甲苯胺藍(lán)的PH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液中，所述石墨烯、甲苯胺藍(lán)與pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液的用量比為20yg:0.8 mmol: IL;在-0.8?1.3V的電位范圍內(nèi)，以10mV/s掃速循環(huán)伏安掃描25圈，制得石墨稀/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極；
b.將a步驟制備的石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極用二次蒸餾水沖洗后做為工作電極，與銀/氯化銀電極、鉑電極構(gòu)成三電極體系，放入含氯鉑酸及氯化鈉的水溶液中，所述氯鉑酸、氯化鈉與水的用量比為15 mmol: 0.1 mo 1:1L，在工作電極與參比電極之間施加_0.8V恒定電勢，施加時間120s，取工作電極用二次蒸餾水沖洗。
[0017]實施例4:
本發(fā)明的可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器，同現(xiàn)有技術(shù)是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，其特征在于所述工作電極按照如下步驟的方法制成:
a.首先按照現(xiàn)有技術(shù)，利用溴化物修飾電極表面，將玻碳電極做為工作電極，飽和甘汞電極做參比電極、鉑電極做對電極，將工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含石墨烯、甲苯胺藍(lán)的PH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液中，所述石墨烯、甲苯胺藍(lán)與pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液的用量比為30yg:1 mmol: IL;在-0.8?1.3V的電位范圍內(nèi)，以100mV/s掃速循環(huán)伏安掃描25圈，制得石墨稀/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極；
b.將a步驟制備的石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極用二次蒸餾水沖洗后做為工作電極，與飽和甘汞電極、鉑電極構(gòu)成三電極體系，放入含氯鉑酸及氯化鈉的水溶液中，所述氯鉑酸、氯化鈉與水的用量比為20 mmol: 0.1 mo 1:1L，在工作電極與參比電極之間施加_0.7V恒定電勢，施加時間120s，取工作電極用二次蒸餾水沖洗。
[0018]實施例5:
本發(fā)明的可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器，同現(xiàn)有技術(shù)是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，其特征在于所述工作電極按照如下步驟的方法制成:
a.首先按照現(xiàn)有技術(shù)，利用溴化物修飾電極表面，將玻碳電極做為工作電極，飽和甘汞電極做參比電極、鉑電極做對電極，將工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含石墨烯、甲苯胺藍(lán)的PH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液中，所述石墨烯、甲苯胺藍(lán)與pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液的用量比為40yg: 1.5 mmol: IL;在-0.8?1.3V的電位范圍內(nèi)，以10mV/s掃速循環(huán)伏安掃描25圈，制得石墨稀/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極；
b.將a步驟制備的石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極用二次蒸餾水沖洗后做為工作電極，與飽和甘汞電極、鉑電極構(gòu)成三電極體系，放入含氯鉑酸及氯化鈉的水溶液中，所述氯鉑酸、氯化鈉與水的用量比為25 mmol: 0.1 mo 1:1L，在工作電極與參比電極之間施加_0.8V恒定電勢，施加時間240s，取工作電極用二次蒸餾水沖洗。
[0019]實驗:
本實施例1與不同工作電極構(gòu)成的電化學(xué)傳感器在含有0.lmmol/L的[Fe(CN)6]3V4—的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安圖如圖1所示，掃速為100mV/s ο圖1中a為裸玻碳電極，b為聚甲苯胺藍(lán)修飾玻碳電極，c為聚甲苯胺藍(lán)/石墨稀復(fù)合物修飾玻碳電極，d為本發(fā)明實施例1的納米鈾/甲苯胺藍(lán)/石墨稀復(fù)合物修飾玻碳電極。
[0020]從圖1中可以看出玻碳電極的CV曲線出現(xiàn)了一對較為對稱的氧化還原峰(曲線a)，說明[Fe(CN)6]3—/4—在電極上的反應(yīng)是準(zhǔn)可逆的；玻碳電極表面被聚甲苯胺藍(lán)修飾后，其氧化還原電流有了明顯的降低(曲線b)，說明甲苯胺藍(lán)已成功聚合到電極表面上;在甲苯胺藍(lán)溶液中添加石墨烯實施聚合后，氧化還原峰電流增大(曲線C)，這是因為石墨烯具有良好的導(dǎo)電性，石墨烯的添加大大提高了電極的電子傳遞性能;本發(fā)明實施例1的納米鉑/甲苯胺藍(lán)/石墨烯復(fù)合物修飾玻碳電極，氧化還原峰電流比添加石墨烯增加更多(曲線d)，這是因為納米鉑具有較好的電子傳遞能力，說明納米鉑成功的沉積到電極表面。
[0021]本實施例1與不同工作電極構(gòu)成的電化學(xué)傳感器在含有0.lmmol/L的[Fe(CN)6]3—/4—的磷酸鹽緩沖液中的電化學(xué)交流阻抗圖(EIS)如圖2所示。圖2中a為裸玻碳電極，b為聚甲苯胺藍(lán)修飾玻碳電極，c為聚甲苯胺藍(lán)/石墨稀復(fù)合物修飾玻碳電極，d為本發(fā)明實施例1的納米鈾/甲苯胺藍(lán)/石墨稀復(fù)合物修飾玻碳電極。
[0022]從圖2可以看出，裸玻碳電極的EIS圖譜呈現(xiàn)一個直徑很小的半圓(曲線a)，表明[Fe(CN)6]3—/4—探針離子在玻碳電極上電荷傳遞電阻(Rct)很小;玻碳電極表面被聚甲苯胺藍(lán)修飾后(曲線b)，半徑明顯增大，即Rct增大，說明甲苯胺藍(lán)已成功聚合到電極上;添加石墨烯后(曲線C)，半徑明顯減小，即Rct減小，說明電極表面的電子傳遞電阻減小，表明石墨烯成功添加到聚合物中;沉積納米鉑后(曲線d)，Rrt減小更多，表明電極的電子傳遞電阻減小很多，表明納米鉑的成功沉積。
[0023]本發(fā)明實施例1的掃描電鏡觀察到的工作電極表面形貌圖如圖3所示。從圖3中可以看出工作電極表面有球狀物(納米鉑粒子)，可以看出納米鉑的粒徑約為50nm。
[0024]本實施例1與不同工作電極構(gòu)成的電化學(xué)傳感器在含有血紅蛋白的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中的電化學(xué)循環(huán)伏安圖如圖4所示，掃速為100mV/S，血紅蛋白在檢測前需在35°C下孵育5min。圖4中a為裸玻碳電極，b為聚甲苯胺藍(lán)修飾玻碳電極，c為聚甲苯胺藍(lán)/石墨稀復(fù)合物修飾玻碳電極，d為本發(fā)明實施例納米鈾/甲苯胺藍(lán)/石墨稀復(fù)合物修飾玻碳電極，e為本發(fā)明實施例1納米鉑/甲苯胺藍(lán)/石墨烯復(fù)合物修飾玻碳電極在空白磷酸鹽緩沖液中的電化學(xué)循環(huán)伏安圖。
[0025]從圖4可以看出，血紅蛋白在裸玻碳電極(曲線a)、聚甲苯胺藍(lán)修飾玻碳電極(曲線b)、石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)復(fù)合物修飾玻碳電極(曲線c)表面都沒有氧化還原峰，而血紅蛋白在納米鉑/石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)復(fù)合物修飾玻碳電極(曲線d)上則有明顯的氧化還原峰，再與不含血紅蛋白的空白溶液中循環(huán)伏安曲線相對比，進(jìn)一步表明制備的納米鉑/石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)復(fù)合物修飾玻碳電極對血紅蛋白有良好的催化還原性能。
[0026]圖5是利用示差脈沖伏安法(DPV)考察本發(fā)明實施例1的電化學(xué)傳感器對濃度為1.0X 10—4g/mL的不同蛋白質(zhì)的選擇性。a為檢測血紅蛋白的DPV曲線，b為在空白磷酸鹽緩沖溶液的DPV曲線，c為檢測人免疫球蛋白的DPV曲線，d為檢測溶菌酶的DPV曲線，e為檢測人血清白蛋白的DPV曲線，f為檢測牛血清白蛋白的DPV曲線。
[0027]從圖5中可以看出，傳感器檢測血紅蛋白時DPV峰電流較高，而檢測另外幾種物質(zhì)時，峰電流很小，表明傳感器對血紅蛋白具有很好的識別性。
[0028]本發(fā)明實施例1的印跡聚合物修飾電極的示差脈沖伏安法(DPV)響應(yīng)電流變化值與血紅蛋白濃度的關(guān)系如圖6所示。從圖6中可以看出，蛋白質(zhì)濃度增加，峰電流減小，且峰電流與蛋白質(zhì)濃度對數(shù)成正比，經(jīng)分析可見，該發(fā)明實施例1制備的印跡聚合物修飾電極能夠?qū)ρt蛋白在1.0X 10—9mg/mL?1.0X 10—3mg/mL的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.9887ο
[0029]總之，本發(fā)明的電化學(xué)傳感器具有較好的識別性，可用于對血紅蛋白的檢測。
【主權(quán)項】
1.一種可催化還原血紅蛋白的電化學(xué)傳感器，是由工作電極、參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系，其特征在于所述工作電極按照如下步驟的方法制成: a.將玻碳電極做為工作電極，將與參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含石墨烯、甲苯胺藍(lán)的PH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液中，所述石墨烯、甲苯胺藍(lán)與pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖溶液的用量比為3~40yg:0.3-1.5 mmol: 1L;在-0.8?1.3 V的電位范圍內(nèi)，以100mV/s掃速循環(huán)伏安掃描25圈，制得石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極； b.將a步驟制備的石墨烯/聚甲苯胺藍(lán)修飾電極用二次蒸餾水沖洗后做為工作電極，將與參比電極及對電極構(gòu)成的三電極體系放入含氯鉑酸及氯化鈉的水溶液中，所述氯鉑酸、氯化鈉與水的用量比為10?25 mmol:0.1 mol: 1L，在工作電極與參比電極之間施加-0.7?-0.8V恒定電勢，施加時間60?240s，取工作電極用二次蒸餾水沖洗。
【文檔編號】G01N27/30GK105866221SQ201610062085
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年1月29日
【發(fā)明人】孫越, 蘭玉廷, 張家萌, 李娟 , 杜洪瑩, 馮春梁
【申請人】遼寧師范大學(xué)