專利名稱：基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記的定量檢測(cè)克倫特羅的免疫層析試紙條及其制備方法
基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記的定量檢測(cè)克倫特羅的免疫層析試紙條及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙，特別是涉及一種以上轉(zhuǎn)換熒光材料作為生物標(biāo)記物的用于定量檢測(cè)克倫特羅殘留的免疫層析試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
克倫特羅(Clenbuterol，CL)，俗稱“瘦肉精”，鹽酸克倫特羅是其鹽酸鹽，具有促進(jìn)肌肉發(fā)育和脂肪分解作用，克倫特羅可以提高肉用動(dòng)物的胴體瘦肉率。因?yàn)橄M(fèi)者對(duì)瘦肉的特殊偏好，瘦肉產(chǎn)出率高的豬可以賣(mài)個(gè)好價(jià)錢(qián)，添加“瘦肉精”給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了額外收益。因此，受不法利益的驅(qū)使，養(yǎng)殖戶常在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)添加“瘦肉精”到動(dòng)物飼料中去。但是克倫特羅是一種選擇性β 2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，副作用極大，當(dāng)攝入量較大時(shí)會(huì)造成心血管系統(tǒng)的損害和嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀。當(dāng)人們食用了含克倫特羅殘留的動(dòng)物內(nèi)臟和肉品后，會(huì)造成急性或慢性食肉中毒，危害消費(fèi)者的健康。目前為止沒(méi)有一個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)“克倫特羅”可用于動(dòng)物生產(chǎn)中，但長(zhǎng)期以來(lái)一直存在著非法使用的情況，在世界各地造成嚴(yán)重食物中毒的事件并不鮮見(jiàn)。近年來(lái)在我國(guó)多個(gè)城市也出現(xiàn)了“瘦肉精”中毒事件，極大地威脅著消費(fèi)者的身心健康。用于克倫特羅殘留檢測(cè)的方法較多，主要有(I)理化分析法，如高壓液相色譜儀、氣相色譜、薄層層析、電泳法等；(2)免疫分析法，如放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法等；(3)生物測(cè)定法，如微生物學(xué)測(cè)定法、放射受體測(cè)定法等。但這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備，需要熟練的專業(yè)人員操作，操作過(guò)程復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，限制了其應(yīng)用范圍，難以在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。免疫試紙法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待測(cè)物的初步信息，該法靈敏度高，分析過(guò)程簡(jiǎn)單，用作“瘦肉精”的篩查有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是需要優(yōu)先發(fā)展的檢測(cè)技術(shù)。上轉(zhuǎn)換熒光技術(shù)(UPT)，是一種具有高靈敏度、基于上轉(zhuǎn)磷光體(UCP)的新型生物檢測(cè)技術(shù)，UCP具有獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性，是一種完全惰性的無(wú)機(jī)發(fā)光材料，經(jīng)過(guò)表面修飾與活化后，可作為新型標(biāo)記物在生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用。經(jīng)檢索，用于檢測(cè)食品中農(nóng)藥、獸藥殘留的UCP免疫層析試紙未見(jiàn)報(bào)道，雖然膠體金試紙?jiān)诖朔矫鎽?yīng)用較廣，但其不能做到定量檢測(cè)，作為更敏感、穩(wěn)定、靈活、安全的UPT-LF的研究，是膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)的有力補(bǔ)充，亟待加強(qiáng)該方面的研究和探討。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便、能定量檢測(cè)克倫特羅殘留的免疫層析試紙條及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記的檢測(cè)克倫特羅的免疫層析試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)CL的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，還設(shè)有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡；所述熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體采用NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體。所述NaYF4:Yb:Er納米顆粒是以NaYF4為基質(zhì)、Yb3+為敏化劑，由Yb和Er共摻雜形成的直徑為50-200nm的納米顆粒。所述NaYF4: Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體由以下方法制備，具體步驟為
(O熒光納米顆粒的表面硅化
將NaYF4: Yb: Er熒光納米顆粒分散在質(zhì)量濃度為10%的乙醇溶液中，在攪拌下加入5ml濃氨水，反應(yīng)IOmin,然后加入2ml正娃酸四乙酯,室溫反應(yīng)3h ；6000rpm離心5min,水洗后用乙醇分散； (2)熒光納米顆粒的表面氨基化
將表面硅化的熒光納米顆粒加入體積比為3:5的甲醇、丙酮的混合溶液中，經(jīng)超聲波分散，加入5 μ I的Ν-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，70°C水浴反應(yīng)lh，6000rpm離心5min,將得到的沉淀用乙醇洗漆，干燥；
(3)CL抗體的標(biāo)記
將表面經(jīng)氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒用PBS緩沖溶液分散，向其中加入質(zhì)量濃度25%的戊二醛溶液，室溫反應(yīng)3小時(shí)，離心洗去多余的戊二醛，然后將反應(yīng)液分散在PBS緩沖溶液中，加入CL的單克隆抗體或多克隆抗體，4°C反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)離心洗滌，即得到NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體，置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜； 偶聯(lián)CL的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡為平行排列的“ I I ”直線式印跡，或?yàn)椤笆弊中团帕杏≯E，或?yàn)椤癟 T”字型排列印跡，或?yàn)椤癐 I”字型排列印跡，或?yàn)椤?h P’字型排列印跡，或?yàn)镠 ”字型排列印跡。在所述吸附纖維層、熒光抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在吸附纖維層與熒光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向吸附纖維層
一側(cè) O. 3-0. 7cm。所述的NaYF4:Yb:Er納米顆粒采用共沉淀法制備，具體方法如下
分別取濃度為 O. 2mol/L 的 Y(NO3) 3 20ml,O. 2mol/L 的 Yb (NO3) 3 2ml,O. 2mol/L 的Er (NO3) 3 O. 5ml、lmol/L的EDTA_Na21ml，加入燒瓶中，50°C油浴攪拌反應(yīng)lh，得到反應(yīng)液A ；
取50ml、lmol/L的NaF溶液，加入聚四氟乙烯容器中，于50°C水浴中攪拌下將反應(yīng)液A倒入NaF溶液中，反應(yīng)Imin ；6000rpm離心5min,棄去上清液得沉淀；向沉淀中加水，超聲波洗漆3次,7000rpm離心5min ;再將沉淀用無(wú)水乙醇超聲波洗漆2次，IOOOOrpm離心5min,將得到的固體置于80°C烘箱中干燥過(guò)夜；將干燥后的固體放入馬弗爐中，于500°C煅燒5h，即得到NaYF4:YbiEr熒光納米顆粒。
所述的NaYF4:Yb:Er納米顆粒也可采用水熱合成法制備，具體方法如下
分別取濃度均為 O. 2mol/L 的 Y(NO3)3 4ml、Yb (NO3) 3 O. 5ml、Er (NO3) 3 O. 1ml、EDTA-Na4ml，混合均勻并充分反應(yīng)，得到反應(yīng)液A ;稱取NaOH O. 7g，加入到8ml油酸和12ml乙醇的混合液中，混勻，在攪拌下緩慢向混合液中注入10mL、lmol/L的NaF溶液，加注完畢后，繼續(xù)攪拌至溶液呈半透明狀；將反應(yīng)液A倒入所述溶液中，混合均勻，陳化20-30min ;然后將混合物轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，130-150°C油浴反應(yīng)12-18h，得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾、洗滌、干燥，即得到NaYF4:Yb:Er熒光納米顆粒。所述免疫層析試紙條的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟
(1)CL單克隆抗體或多克隆抗體的制備；
(2)熒光抗體的制備先制備NaYF4:Yb:Er熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)以NaYF4為基質(zhì)、Yb3+為敏化劑，由Yb和Er共摻雜形成直徑50-200nm的納米顆粒；然后將CL單克隆抗體或多克隆抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記；
(3)吸附纖維層的制備吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；
(4)纖維素膜層的制備纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，烘干；
(5)試紙條的組裝將吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從右至左依次貼在涂有粘合劑的支撐層上，依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成試紙條。所述熒光標(biāo)記的具體步驟如下
Cl)熒光納米顆粒的表面硅化
將NaYF4: Yb: Er熒光納米顆粒分散在質(zhì)量濃度為10%的乙醇溶液中，在攪拌下加入5ml濃氨水，反應(yīng)IOmin,然后加入2ml正娃酸四乙酯,室溫反應(yīng)3h ；6000rpm離心5min,水洗后用乙醇分散；
(2)熒光納米顆粒的表面氨基化
將表面硅化的熒光納米顆粒加入體積比為3:5的甲醇、丙酮的混合溶液中，經(jīng)超聲波分散，加入5 μ I的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，70°C水浴反應(yīng)lh，6000rpm離心5min,將得到的沉淀用乙醇洗漆，干燥；
(3)CL抗體的標(biāo)記
將表面經(jīng)氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒用PBS緩沖溶液分散，向其中加入質(zhì)量濃度25%的戊二醛溶液，室溫反應(yīng)3小時(shí)，離心洗去多余的戊二醛，然后將反應(yīng)液分散在PBS緩沖溶液中，加入CL的單克隆抗體或多克隆抗體，4°C反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)離心洗滌，即得到NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體，置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。本發(fā)明的積極有益效果
(I)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本發(fā)明試紙條以上轉(zhuǎn)換熒光納米材料NaYF4: Yb:Er標(biāo)記CL抗體為基礎(chǔ)制成，能在紅外光下直接觀測(cè)結(jié)果，由于NaYF4:Yb:Er納米顆粒的非凡光學(xué)特性，使CL的檢測(cè)消除了背景光的干擾，靈敏度大大提高，最低可檢測(cè)到匹克級(jí)的痕量殘留。(2)穩(wěn)定性高，靈活性好。試紙條中UCP的發(fā)光現(xiàn)象是由于其結(jié)構(gòu)內(nèi)部的純粹物理過(guò)程產(chǎn)生的，完全避免了來(lái)自檢測(cè)樣品腐蝕以及自身衰變導(dǎo)致的發(fā)光淬滅；UCP具有的可自由組合的多樣化特征光譜(吸收光譜和發(fā)射光譜)使其能適用于多重分析。
(3)安全性好。試紙條中的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料具有無(wú)機(jī)惰性、紅外光激發(fā)、可見(jiàn)光發(fā)射的特點(diǎn)，使得基于UCP的檢測(cè)對(duì)于檢測(cè)者、被檢測(cè)品和環(huán)境均無(wú)任何危害。(4)簡(jiǎn)便、快速。試紙條可對(duì)全血、尿液、唾液、組織勻漿等進(jìn)行直接檢測(cè)，無(wú)須進(jìn)行樣品的預(yù)處理。使用本發(fā)明試紙條借助熒光閱讀器可直接讀值，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，可現(xiàn)場(chǎng)操作。只要將試紙條插入被檢樣品10 20秒鐘，5分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。(5)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。本發(fā)明試紙條以顯示紅色“ I ”和“ I I ”(或“十”、“丁”、“丄”、“”)印跡作為檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上顯示一條紅色“ I ”印跡，表示被檢樣品中含有CL;顯示兩條紅色“ I I ”印跡，表示被檢樣品中不含CL。此結(jié)果可用肉眼直接觀測(cè)，判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性等人為誤判。(6)適用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了基于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標(biāo)記的免疫層析技術(shù)在定量檢測(cè)CL殘留中的應(yīng)用，使CL殘留的檢測(cè)無(wú)本底干擾；該試紙條操作簡(jiǎn) 便，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、養(yǎng)殖戶以及消費(fèi)者個(gè)人等。本發(fā)明在保障食品安全、保護(hù)消費(fèi)者健康方面具有極其重要的意義，將具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。(7)本發(fā)明的試紙條制備時(shí)，熒光抗體采用NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體，標(biāo)記過(guò)程簡(jiǎn)單易行，只需將氨基化的NaYF4:Yb:Er納米顆粒直接與抗體相連，避開(kāi)了膠體金-抗體相連的繁瑣步驟，且可以通過(guò)控制摩爾濃度調(diào)整熒光納米顆粒與抗體的偶聯(lián)率，從而有效提高基于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的側(cè)流層析免疫試紙的靈敏度。


圖I為本發(fā)明的免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意 圖2為本發(fā)明的免疫層析試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意 圖3為本發(fā)明的免疫層析試紙條對(duì)CL的回歸曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的試紙條制備過(guò)程包括CL單克隆或多克隆抗體的制備、熒光抗體纖維層(結(jié)合墊)的制備、吸附纖維層(樣品墊)的制備、纖維素膜層(分析膜)的制備和試紙條的組裝等步驟。I、CL單克隆抗體或多克隆抗體的制備
單克隆抗體的制備包括CL免疫原的制備、免疫動(dòng)物(小鼠)、細(xì)胞融合、單克隆抗體的師選、單克隆抗體的制備；多克隆抗體的制備包括CL免疫原的制備、免疫動(dòng)物(兔子)、多克隆抗體的篩選、多克隆抗體的制備。(I)CL人工抗原的制備
將100 mg CL標(biāo)準(zhǔn)品溶于10mL、lmol/L的鹽酸，緩慢滴加30%的NaNO2溶液，用淀粉KI試紙檢測(cè)，加到KI試紙為棕紫色時(shí)停止滴加，攪拌反應(yīng)45 min,滴加5%的氨基磺酸銨溶液，用淀粉KI試紙檢測(cè)其反應(yīng)終點(diǎn)。用滴管將偶氮化的CL溶液緩慢滴加于溶有300 mg BSA的PBS (ρΗ7·4)中，并用I mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9. 0，4°C避光反應(yīng)24 h后，4°C透析48 h，分裝，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｍ碇苽浒辉?2) CL單克隆抗體的制備
用制得的CL人工抗原以5(^g IOOPg/只的用量免疫6 8周齡BALB/c小鼠3 4次，每次免疫間隔3 5周，確定抗體效價(jià)符合要求后超強(qiáng)免疫，之后3 4天將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽(yáng)性血清；脫頸致死，用75%的酒精浸泡小鼠5 IOmin消毒體表，無(wú)菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經(jīng)120目尼龍紗布過(guò)濾，IOOOrpm離心lOmin，收集脾細(xì)胞。將IXlO8的脾細(xì)胞與NSO骨髓瘤細(xì)胞按10:1的比例混合，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，細(xì)胞沉淀物于37°C水浴中緩緩加入O. 7 I. OmL 50%的PEG4000作用lmin，然后緩緩加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15mL，以終止PEG的作用；37°C水浴5 10 min，IOOOrpm離心IOmin棄上清，將細(xì)胞沉淀物重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔(ΙΟΟμ 200μ 7孔)，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10 14天，用間接ELISA法進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化，而后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立 雜交瘤細(xì)胞株。所制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體可特異地與CL反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)到101° 1012，輕鏈亞型為K或λ，重鏈亞型為IgG1' IgG2a, IgG2b, IgG3,針對(duì)CL特異抗原決定簇的單克隆抗體，用于制備熒光抗體玻璃纖維棉。(3) CL多克隆抗體的制備
用制得的CL人工抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200μ8 500μ8/次，背部皮下分4 6點(diǎn)注射。首免，用無(wú)菌PBS溶解CL人工抗原，與等量FCA混合，充分乳化；加強(qiáng)免疫，用無(wú)菌PBS溶解CL載體蛋白偶聯(lián)物，與等量FIA混合，充分乳化，首免后2 3周進(jìn)行，連續(xù)免疫4 5次，每次間隔2 3周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法測(cè)其定效價(jià)達(dá)到IO5以上時(shí)，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，即取I份高免血清加2份PBS (ρΗ7. 2)混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清，再以適量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33%，置4°C冰箱2h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清，以適量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS (pH7. 2)透析48 72h，中間換液數(shù)次，4°C、12000rpm離心15min，收集上清，得純化的抗CL多克隆抗體，-20°C凍存，用于制備熒光抗體玻璃纖維棉。2、熒光抗體纖維層(結(jié)合墊)的制備
熒光抗體纖維層的制備，首先需要制備NaYF4:Yb:Er納米顆粒，然后用制備的NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記CL抗體。(I) NaYF4: Yb:Er納米顆粒的制備,可采用共沉淀法或水熱合成法。a.共沉淀法
分別取濃度為 O. 2mol/L 的 Y(NO3) 3 20ml,O. 2mol/L 的 Yb (NO3) 3 2ml,O. 2mol/L 的Er (NO3) 3 O. 5ml、lmol/L的EDTA_Na21ml，加入IOOml燒瓶中，50°C油浴攪拌反應(yīng)lh，得到反應(yīng)液A ；
取50ml、lmol/L的NaF水溶液,加入聚四氟乙烯容器中，于50°C水浴中磁力攪拌下將A液倒入NaF水溶液中，水浴反應(yīng)lmin ；6000rpm離心5min,棄去上清液得沉淀，向沉淀中加水，超聲波洗漆3次，7000rpm離心5min ;用無(wú)水乙醇超聲波洗漆2次，IOOOOrpm離心5min,將得到的固體置于80°C烘箱中干燥過(guò)夜；將干燥后的固體放入馬弗爐中，于500°C煅燒5h，即得到NaYF4:YbiEr熒光納米顆粒。
b.水熱合成法
分別取濃度均為 O. 2mol/L 的 Y(NO3)3 4ml、Yb (NO3) 3 O. 5ml、Er (NO3) 3 O. 1ml、EDTA-Na4ml，混合均勻并充分反應(yīng)后，得到反應(yīng)液A ；
稱取NaOH O. 7g，加入到8ml油酸和12ml乙醇的混合液中混勻，在攪拌下緩慢向混合液中注入10mL、lmOl/L的NaF溶液，加注完畢后，繼續(xù)攪拌，至溶液呈半透明狀；將反應(yīng)液A倒入所述溶液中，混合均勻，陳化20min ;然后將混合物轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，130°C油浴反應(yīng)12h，得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾、洗滌、干燥，即得到NaYF4:Yb:Er熒光納米顆粒。(2) NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記CL抗體
標(biāo)記過(guò)程包括以下幾步NaYF4:Yb:Er納米顆粒的表面娃化、NaYF4:Yb:Er納米顆粒的表面氨基化、NaYF4: Yb:Er納米顆粒與CL抗體的偶聯(lián)。a. NaYF4:Yb:Er熒光納米顆粒的表面硅化
將NaYF4:Yb:Er熒光納米顆粒分散在質(zhì)量濃度10%的乙醇水溶液中，在磁力攪拌下加入5ml濃氨水(濃度28%),反應(yīng)IOmin,然后加入2ml正娃酸四乙酯，室溫反應(yīng)3h ；6000rpm離心5min,水洗3次,最后用乙醇分散；
b.NaYF4:Yb:Er熒光納米顆粒的表面氨基化
將表面硅化的熒光納米顆粒加到體積比為3:5的甲醇、丙酮的混合溶液中，經(jīng)超聲波分散，加入5ul的APTSA (N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷)，70°C水浴反應(yīng)lh，6000rpm離心5min,將得到的沉淀用乙醇洗漆3次,干燥,保存；c.CL抗體的標(biāo)記(戊二醛法)將表面經(jīng)氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒用pH=7. 4的PBS緩沖溶液分散，向其中加入質(zhì)量濃度25%的戊二醛，室溫反應(yīng)3小時(shí)，離心洗去多余的戊二醛，然后分散在pH=7. 4的PBS緩沖溶液，再向其中加入CL的單克隆抗體或多克隆抗體，4°C反應(yīng)3小時(shí)，再離心洗滌數(shù)次，即得到NaYF4:Yb = Er-CL的抗體偶聯(lián)物，用pH=7. 4的PBS緩沖溶液4°C保存。3、吸附纖維層(樣品墊)的制備
測(cè)試端吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制備，將纖維材料剪成寬I. 5cm規(guī)格的條帶，將其放入樣品墊封閉液中浸泡30min，于37°C烘干，備用。
4、纖維素膜層(分析膜)的制備
纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜，剪切成寬I. 5cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)CL抗原和羊抗小鼠IgG抗體(或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗體)，制作隱形的檢測(cè)印跡帶和對(duì)照印跡帶，于37°C烘干備用。其中羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體的制備方法如下
以飽和硫酸銨提取CL陰性小鼠血清IgG(或陰性兔血清IgG)，取I份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS (pH7. 2)混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清；再以適量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33%，置4°C冰箱2h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清；以適量PBS(pH7. 2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)，用PBS (ρΗ7· 2)透析48h，中間換液3次，4°C、12000rpm離心15min，收集上清，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度；以5(^g lOOPg/kg體重的小鼠血清(或兔血清)IgG經(jīng)皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3 4次，末次注射10天后，以ELISA測(cè)定其血清效價(jià)達(dá)到1:2000以上時(shí)，心臟或動(dòng)脈采血，分離收集高免血清，以飽和硫酸銨提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于CL檢測(cè)試紙條對(duì)照印跡的制備。5、免疫層析試紙條的組裝
將吸附纖維層(樣品墊)、熒光抗體纖維層(結(jié)合墊)、纖維素膜層(分析膜)、吸水材料層從右至左依次貼在帶有粘合劑的支撐層(底板)上，并切成3-4cm寬的試紙條即可。6、本發(fā)明的免疫層析試紙條的檢測(cè)反應(yīng)原理
當(dāng)試紙條測(cè)試端插入待測(cè)樣品溶液后，待測(cè)溶液通過(guò)虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)CL及熒光抗體玻璃纖維棉中的熒光抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴(kuò)散過(guò)程中，待測(cè)CL可與熒光抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉熒光抗體上CL的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止熒光抗體與纖維素膜上的CL人工抗原的檢測(cè)印跡結(jié)合，不能顯示檢測(cè)印跡，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體則可與熒光抗體結(jié)合，在紅外線激發(fā)下(或使用熒光閱讀器直接讀值)形成紅色對(duì)照印跡帶“ I ”，即一條紅色帶“ I ”印跡為陽(yáng)性表示；反之樣品溶液中無(wú)CL 時(shí)，則不能阻止熒光抗體與纖維素膜上的CL人工抗原檢測(cè)印跡結(jié)合，顯示紅色檢測(cè)印跡帶“ I ”，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體也與金標(biāo)抗體結(jié)合，顯示紅色對(duì)照印跡帶“ I ”，形成兩條紅色帶“ I I ”為陰性表示。如果纖維素膜上沒(méi)有任何紅色印跡帶顯示，則表明試紙條已失效。以下實(shí)施例具體說(shuō)明試紙條的結(jié)構(gòu)和檢測(cè)方法。實(shí)施例一參見(jiàn)圖I和圖2。圖中I為支撐層，用塑膠薄片條制成，2為吸附纖維層，用玻璃纖維棉制成，熒光抗體纖維層3上吸附有抗CL單克隆抗體的熒光抗體玻璃纖維棉，纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜，手柄端的吸水材料層5用吸水濾紙制成，將吸附纖維層2、熒光抗體纖維層3、纖維素膜層4、吸水材料層5各層從右至左依次粘貼固定在支撐層I上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層4上設(shè)有隱形檢測(cè)印跡6，用偶聯(lián)CL的牛血清白蛋白溶液(BSA)制成；隱形對(duì)照印跡7用羊抗小鼠IgG抗體溶液在纖維素膜上印跡制成“ I ”，兩條印跡帶平行排列，形成組合印跡帶“ I I ”。8-1為覆蓋在吸附纖維層2和熒光抗體纖維層3上面的樣品端白色保護(hù)膜，8-2為覆蓋在吸水材料層5上面的其它顏色保護(hù)膜(如黃色)，9為樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線位于吸附纖維層2與熒光抗體纖維層3交界處對(duì)應(yīng)的白色保護(hù)膜偏向吸附纖維層2 —側(cè)約O. 5cm處，在標(biāo)記線右側(cè)保護(hù)膜上印有箭頭及max字樣。待測(cè)樣品的制備及檢測(cè)步驟
檢測(cè)肉樣將樣品剪碎、磨細(xì)，以生理鹽水稀釋制成I :2 10的樣品懸液；
操作方法將CL試紙條樣品端插入待測(cè)樣品中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線，約10 20秒鐘取出試紙條，在980nm紅外激發(fā)下觀測(cè)結(jié)果，或通過(guò)熒光閱讀器直接讀值。結(jié)果判定(a)陽(yáng)性如果在纖維素膜上顯示有一條紅色印跡帶“ I ”，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有CL; (b)陰性如果在纖維素膜上顯示有兩條紅色印跡帶“I I ”，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含CL;(C)失效如果在纖維素膜上沒(méi)有紅色帶顯示，則表明試紙條已失效。實(shí)施例二 試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于熒光抗體纖維層3吸附有抗CL的多克隆抗體，吸附纖維層2用尼龍膜制成，纖維素膜層4采用純纖維素膜，隱形檢測(cè)印跡帶和隱形對(duì)照印跡帶均為“十”，8-2為覆蓋在吸水材料層5上面的手柄端蘭色保護(hù)膜。
檢測(cè)奶樣用生理鹽水將奶樣稀釋制成I :2 5的樣品懸液。結(jié)果判定(a)陽(yáng)性如果在纖維素膜上顯示有一條紅色印跡帶“十”，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有CL; (b)陰性如果在纖維素膜上顯示有兩條紅色印跡帶“十”，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含CL;(c)失效如果在纖維素膜上沒(méi)有紅色帶顯示，則表明試紙條已失效。操作方法同實(shí)施例一。實(shí)施例三試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于吸附纖維層2用聚偏 二氟乙烯PVDF膜制成，偶聯(lián)CL的載體蛋白溶液為雞卵清白蛋白(OVA)，隱形對(duì)照印跡7用兔抗小鼠IgG抗體溶液在纖維素膜上制成，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，8-2為覆蓋在吸水材料層5上面的手柄端綠色保護(hù)膜，隱形檢測(cè)印跡帶和隱形對(duì)照印跡帶均為“I”。用于檢測(cè)血樣提取血清并用生理鹽水將其稀釋制成I :2 10的待測(cè)樣品。結(jié)果判定和操作方法均同實(shí)施例一。實(shí)施例四試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于吸附纖維層2用聚酯膜制成，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，隱形檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)CL的載體蛋白溶液為血藍(lán)蛋白(KLH)。用于檢測(cè)尿樣，可直接取尿液作為待測(cè)樣品。檢測(cè)印跡帶和對(duì)照印跡帶均為“I”。操作方法和結(jié)果判定方法同例一。實(shí)施例五試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于隱形對(duì)照印跡7用羊抗兔IgG抗體溶液在纖維素膜上制成，吸附纖維層2用尼龍膜制成。檢測(cè)印跡帶和對(duì)照印跡帶均為“ l·”。檢測(cè)樣品、結(jié)果判定和操作方法同例一。實(shí)施例六和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于突光抗體纖維層3吸附有抗CL的多克隆抗體，檢測(cè)樣品為奶樣。檢測(cè)印跡帶和對(duì)照印跡帶均為”。實(shí)施例七和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于突光抗體纖維層3吸附有抗CL的多克隆抗體，檢測(cè)樣品為血樣。實(shí)施例八和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于突光抗體纖維層3吸附有抗CL多克隆抗體，檢測(cè)樣品為尿樣。實(shí)施例九和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于隱形檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)CL載體蛋白溶液為血藍(lán)蛋白(KLH)，檢測(cè)樣品、結(jié)果判定和操作方法同實(shí)施例一，不重述。實(shí)施例十和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于隱形檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)CL載體蛋白溶液為雞卵清白蛋白(0VA)，檢測(cè)樣品、結(jié)果判定和操作方法同實(shí)施例一，不重述。實(shí)施例十一本發(fā)明試紙條的靈敏性、特異性檢測(cè)
I、靈敏性的檢測(cè)用磷酸鹽緩沖溶液PBS (PH7. 4)或雙蒸水分別配置濃度為4、2、1、
O.5,0. 25,0. 125,0. 0625、0ng/mL的CL標(biāo)準(zhǔn)品，在本發(fā)明的試紙條上上樣80_100uL，反應(yīng)5-10分鐘后，在紫外光下觀察結(jié)果。對(duì)紫外光下反應(yīng)后的試紙條拍照，將圖片用畫(huà)圖工具打開(kāi)，用矩形工具選擇T線區(qū)域，測(cè)定其光度值(Lt)，減去T線(檢測(cè)線)和C線(對(duì)照線)之間的背景光度值(Lb)，以抑制率Lt-Lb為縱坐標(biāo)，以不同CL濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，計(jì)算該試紙條對(duì)CL的IC5tl和最低檢測(cè)限。經(jīng)測(cè)定，該試紙對(duì)CL的曲線回歸方程為y=-49·952χ + 131. 57，相關(guān)系數(shù)為R2 = O. 9929，根據(jù)回歸方程計(jì)算出該試紙對(duì)CL的IC5tl為429. 50pg/mL,該試紙的最低檢測(cè)限為107. 74pg/mL,表明試紙對(duì)CL具有較高的靈敏度。參見(jiàn)圖3。2、特異性的檢測(cè)以CL的同類藥物萊克多巴胺、西馬特羅以及磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、噁喹酸、青霉素、四環(huán)素氯霉素、新霉素、喹乙醇作為競(jìng)爭(zhēng)物，配置上述標(biāo)品的濃度為lmg/mL，用上轉(zhuǎn)換熒光試紙檢測(cè)其抑制率，以該試紙對(duì)CL的IC5tl與各競(jìng)爭(zhēng)物的IC5tl的百分比為其交叉反應(yīng)率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表I?？煽闯觯撛嚰垪l的特異性較好，與其他藥物均無(wú)交叉反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記的檢測(cè)克倫特羅的免疫層析試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其特征在于在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)CL的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，還設(shè)有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡；所述熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，突光抗體采用NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征在于所述NaYF4:Yb:Er納米顆粒是以NaYF4為基質(zhì)、Yb3+為敏化劑，由Yb和Er共摻雜形成的直徑為50_200nm的納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫層析試紙條，其特征在于所述NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體由以下方法制備，具體步驟為 (1)熒光納米顆粒的表面硅化 將NaYF4: Yb: Er熒光納米顆粒分散在質(zhì)量濃度為10%的乙醇溶液中，在攪拌下加入5ml濃氨水，反應(yīng)IOmin,然后加入2ml正娃酸四乙酯,室溫反應(yīng)3h ；6000rpm離心5min,水洗后用乙醇分散； (2)熒光納米顆粒的表面氨基化 將表面硅化的熒光納米顆粒加入體積比為3:5的甲醇、丙酮的混合溶液中，經(jīng)超聲波分散，加入5iU的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，70°C水浴反應(yīng)lh，6000rpm離心5min,將得到的沉淀用乙醇洗漆，干燥； (3)CL抗體的標(biāo)記 將表面經(jīng)氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒用PBS緩沖溶液分散，向其中加入質(zhì)量濃度25%的戊二醛溶液，室溫反應(yīng)3小時(shí)，離心洗去多余的戊二醛，然后將反應(yīng)液分散在PBS緩沖溶液中，加入CL的單克隆抗體或多克隆抗體，4°C反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)離心洗滌，即得到NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體，置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征是所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜；偶聯(lián)CL的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征是所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡為平行排列的“ I I ”直線式印跡，或?yàn)椤笆弊中团帕杏≯E，或?yàn)椤癟 T”字型排列印跡，或?yàn)椤皝A丄”字型排列印跡，或?yàn)椤?h h”字型排列印跡，或?yàn)椤癏 H，，字型排列印跡。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征是在所述吸附纖維層、熒光抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在吸附纖維層與熒光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向吸附纖維層一側(cè)0. 3-0. 7cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條,其特征在于所述的NaYF4:Yb:Er納米顆粒采用共沉淀法制備，具體方法如下分別取濃度為 0. 2mol/L 的 Y(NO3) 3 20ml,0. 2mol/L 的 Yb (NO3) 3 2ml,0. 2mol/L 的Er (NO3) 3 0. 5ml、lmol/L的EDTA_Na21ml，加入燒瓶中，50°C油浴攪拌反應(yīng)lh，得到反應(yīng)液A ； 取50ml、lmol/L的NaF溶液，加入聚四氟乙烯容器中，于50°C水浴中攪拌下將反應(yīng)液A倒入NaF溶液中，反應(yīng)Imin ；6000rpm離心5min,棄去上清液得沉淀；向沉淀中加水，超聲波洗漆3次,7000rpm離心5min ;再將沉淀用無(wú)水乙醇超聲波洗漆2次，IOOOOrpm離心5min,將得到的固體置于80°C烘箱中干燥過(guò)夜；將干燥后的固體放入馬弗爐中，于500°C煅燒5h，即得到NaYF4:YbiEr熒光納米顆粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條,其特征在于所述的NaYF4:Yb:Er納米顆粒采用水熱合成法制備，具體方法如下 分別取濃度均為 0. 2mol/L 的 Y(NO3)3 4ml、Yb (NO3) 3 0. 5ml、Er (NO3) 3 0. 1ml、EDTA-Na4ml，混合均勻并充分反應(yīng)，得到反應(yīng)液A ;稱取NaOH 0. 7g，加入到8ml油酸和12ml乙醇的混合液中，混勻，在攪拌下緩慢向混合液中注入10mL、lmol/L的NaF溶液，加注完畢后，繼續(xù)攪拌至溶液呈半透明狀；將反應(yīng)液A倒入所述溶液中，混合均勻，陳化20-30min ;然后將混合物轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯容器中，130-150°C油浴反應(yīng)12-18h，得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾、洗滌、干燥，即得到NaYF4:Yb:Er熒光納米顆粒。
9.權(quán)利要求I所述免疫層析試紙條的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟 (1)CL單克隆抗體或多克隆抗體的制備； (2)熒光抗體的制備先制備NaYF4:Yb:Er熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)以NaYF4為基質(zhì)、Yb3+為敏化劑，由Yb和Er共摻雜形成直徑50-200nm的納米顆粒；然后將CL單克隆抗體或多克隆抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記； (3)吸附纖維層的制備吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成； (4)纖維素膜層的制備纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，烘干； (5)試紙條的組裝將吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從右至左依次貼在涂有粘合劑的支撐層上，依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成試紙條。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于所述熒光標(biāo)記的具體步驟如下 (1)熒光納米顆粒的表面硅化 將NaYF4: Yb: Er熒光納米顆粒分散在質(zhì)量濃度為10%的乙醇溶液中，在攪拌下加入5ml濃氨水，反應(yīng)IOmin,然后加入2ml正娃酸四乙酯,室溫反應(yīng)3h ；6000rpm離心5min,水洗后用乙醇分散； (2)熒光納米顆粒的表面氨基化 將表面硅化的熒光納米顆粒加入體積比為3:5的甲醇、丙酮的混合溶液中，經(jīng)超聲波分散，加入5iU的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，70°C水浴反應(yīng)lh，6000rpm離心5min,將得到的沉淀用乙醇洗漆，干燥； (3)CL抗體的標(biāo)記 將表面經(jīng)氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒用PBS緩沖溶液分散，向其中加入質(zhì)量濃度25%的戊二醛溶液，室溫反應(yīng)3小時(shí)，離心洗去多余的戊二醛，然后將反應(yīng)液分散在PBS緩沖溶液中，加入CL的單克隆抗體或多克隆抗體，4°C反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)離心洗滌，即得到NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體，置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒標(biāo)記的定量檢測(cè)克倫特羅的免疫層析試紙條及其制備方法，試紙條含有支撐層、吸附層、保護(hù)層，吸附層包括吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)CL的載體蛋白溶液印制的檢測(cè)印跡以及用羊抗小鼠IgG抗體印制的對(duì)照印跡；熒光抗體采用NaYF4:Yb:Er納米顆粒標(biāo)記的CL單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了基于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標(biāo)記的免疫層析技術(shù)在定量檢測(cè)CL殘留中的應(yīng)用，使CL殘留檢測(cè)無(wú)本底干擾；該試紙條特異性強(qiáng)、靈敏度高，檢測(cè)簡(jiǎn)便、直觀、準(zhǔn)確，成本低，適用范圍廣，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/533GK102798720SQ20121028187
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者張改平, 職愛(ài)民, 宋春美, 胡驍飛, 楊繼飛, 趙東 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院