專利名稱：一種牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，屬于食用菌風(fēng)味分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和氣相色譜-嗅覺測量技術(shù)。
背景技術(shù)：
牛肝菌為肉質(zhì)大型真菌，是菌物界中大型擔(dān)子菌的重要類群，其典型的外觀特征為:具有菌蓋及菌柄、肉質(zhì)，與傘菌(蘑菇)外形相似，但菌蓋下面的子實(shí)體層是密集的菌管而非片狀菌褶。牛肝菌子實(shí)體粘軟多汁，香滑可口，富含蛋白質(zhì)維生素多糖類物質(zhì)氨基酸和多種礦物元素，其提取物具有增強(qiáng)免疫力抗癌抗輻射等功能。除營養(yǎng)和藥用外，食用牛肝菌的的風(fēng)味也引人關(guān)注，其所特有的風(fēng)味區(qū)別于芳香植物和一般食品。近年來，隨著生活水平的提高和消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，人們在追求攝入食品營養(yǎng)的同時(shí)，對食品風(fēng)味的追求日益增加。野生食用牛肝菌滿足了消費(fèi)者對于營養(yǎng)和風(fēng)味的雙重需求，在中外消費(fèi)市場中越來越受到重視。在云南及其他一些省份，很多餐館開始用野生食用牛肝菌做湯，其味道鮮美，深受消費(fèi)者喜愛。同時(shí)，牛肝菌是倍受歐洲市場歡迎的珍稀食品，其在意大利、法國、瑞士、德國等尤為推崇，是我國遠(yuǎn)銷歐美各國的暢銷上特產(chǎn)品。因此，對于野生食用牛肝菌風(fēng)味成分的研究，對于闡明其呈味機(jī)理并且為開發(fā)新一代調(diào)味品奠定理論基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。目前，關(guān)于牛肝菌營養(yǎng)成分的研究較多，而對于其揮發(fā)性成分研究較少。頂空固相微萃取(headspace-solid phase micro-extraction, HS-SPME)是 20 世紀(jì) 90 年代新發(fā)展起來的一種用于食品風(fēng)味物質(zhì)分析檢測的技術(shù)。這種方法最大的特點(diǎn)是把取樣、萃取、富集、進(jìn)樣等過程在同一個(gè)裝置完成，減少了實(shí)驗(yàn)的繁瑣。與其他分離方法相比，此方法選擇性好，不需要溶劑，所需樣品用量少，且操作簡單、快速、費(fèi)用低，并可與氣相色譜或液相色譜直接聯(lián)用。目前已有國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)分析了金針菇、草菇、香菇等食用菌的揮發(fā)性物質(zhì)。以上方法只是對食品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定，但是不能確定哪種成分對食品風(fēng)味有貢獻(xiàn)，這是因?yàn)樵诖罅康膿]發(fā)性化合物中，往往只有一小部分成分影響食品的風(fēng)味，而且有些呈味物質(zhì)閾值很低、在食品中含量很小，單純使用GC-MS技術(shù)往往不能將這些痕量風(fēng)味物質(zhì)檢測出來，氣相色譜-嗅覺測量法(GC-O)使食品風(fēng)味的研究有了很大的突破。本實(shí)驗(yàn)以美味牛肝菌為原料，通過HS-SPME技術(shù)萃取樣品中的揮發(fā)性成分，并將GC-MS與GC-O以及Kovats保留指數(shù)(Kovats retention indices, KI)三種方法結(jié)合起來,對樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性、定量分析，同時(shí)鑒定樣品中的風(fēng)味成分，為牛肝菌調(diào)味品的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明申請相關(guān)的公開專利文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是:
一種鑒定牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的方法，具體步驟是:(I)將牛肝菌干品粉碎，過40目篩；(2)采用頂空固相微萃取方法對揮發(fā)性成分進(jìn)行吸附萃??；(3)利用氣相色譜-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定；(4)利用嗅覺辨別法對進(jìn)一步確定揮發(fā)性成分，同時(shí)通過氣味強(qiáng)度確定各物質(zhì)對牛肝菌風(fēng)味貢獻(xiàn)的大小。而且，所述步驟(2)中采用65 μ m PDMS/DVB萃取頭，最佳萃取時(shí)間為30min，最佳
萃取溫度為45 °C。而且，所述步驟(3)中氣相色譜條件為:色譜柱型號為VF-5ms(30mX0.25mmX0.25 μ m)，載氣為高純度氦氣(99.999% )，流速為 lml/min，進(jìn)樣口溫度為250°C，進(jìn)樣時(shí)以分流方式進(jìn)樣。采用兩段式程序升溫:起始溫度為40°C，保持3min，然后以4.0°C min升溫至150°C,并保持lmin,再以8V /min升溫至250°C,保持6min。質(zhì)譜條件為:電離源為EI，離子阱溫度為220°C，GC-MS傳輸線溫度為280°C，EI電子能量為70eV，溶劑延遲時(shí)間1.5min。掃描方式為全掃描(f μ μ )，范圍為43_500m/z。而且，所述步驟(4)中的嗅覺辨別法具體步驟為:質(zhì)譜與嗅覺計(jì)的分流比設(shè)置為1:1。本實(shí)驗(yàn)選擇3名有經(jīng)驗(yàn)的感官評價(jià)員進(jìn)行嗅覺分析，記錄風(fēng)味特征和強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)過程中至少有兩名感官評價(jià)員在同一嗅聞時(shí)間處能得到相同的感官描述，則將該記錄記入最終結(jié)果，氣味的強(qiáng)度以星號個(gè)數(shù)做記號。本發(fā)明建立的方法能夠簡單快速的分析牛肝菌中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，采用HS-SPME方法不需有機(jī)溶劑，操作簡單，避免了樣品在加熱過程中的揮發(fā)和生產(chǎn)其它物質(zhì)，能有效地收集揮發(fā)性成分；利用質(zhì)譜譜圖分析、保留指數(shù)和嗅覺辨別三種方法結(jié)合準(zhǔn)確鑒定了待測揮發(fā)性化合物，提高了結(jié)果的可信度；同時(shí)通過嗅覺測量法分析揮發(fā)性化合物的氣味強(qiáng)度，確定對牛肝菌整體風(fēng)味的影響。


圖1是牛肝菌揮發(fā)性成分的總離子色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)敘述本發(fā)明的實(shí)施例，需要說明的是，本實(shí)施例是敘述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測方法，步驟是:(I)將牛肝菌干品粉碎，過40目篩；(2)稱取樣品粉末2.0g于15ml頂空樣品瓶中，用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封，置于45°C水浴鍋中平衡30min后，將經(jīng)過老化處現(xiàn)的固相微萃取頭通過瓶蓋的橡皮墊插入到樣品瓶中大約Icm處，推出纖維頭，于45°C水浴中萃取30min，然后抽回纖維頭，從樣品瓶中取出萃取頭后迅速插入GC-MS聯(lián)用儀的進(jìn)樣口，于250°C下解析15min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)；(3) GC-MS 分析條件色譜條件:色譜柱型號為VF-5ms(30mX0.25mmX0.25 μ m)，載氣為高純度氦氣(99.999% )，流速為lml/min，進(jìn)樣口溫度為250°C，進(jìn)樣時(shí)以分流方式進(jìn)樣。采用兩段式程序升溫:起始溫度為40°C，保持3min，然后以4.0°C min升溫至150°C，并保持lmin，再以8°C /min 升溫至 250°C,保持 6min。質(zhì)譜條件:電離源為EI，離子阱溫度為220°C，GC-MS傳輸線溫度為280°C，EI電子能量為70eV，溶劑延遲時(shí)間1.5min。掃描方式為全掃描(f μ μ )，范圍為43-500m/z。(4)定性分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由Xaclbiur軟件系統(tǒng)完成，未知化合物纖計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NSIT05譜庫(107k compounds)相匹配,僅當(dāng)正反匹配度均大于800 (最大值為1000)的鑒定結(jié)果才予以報(bào)道。采用相同的升溫程序，以C6-C2tl的正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，以其保留時(shí)間計(jì)算樣品測試中的化合物的保留指數(shù)，再通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，與文獻(xiàn)中的化合物的保留指數(shù)(RI)相比較，與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果共同定性?；衔锉Ａ糁笖?shù)RI計(jì)算公式: RI 樣品=RI 前 + (Rt 樣品-Rt 前)X 100/ (Rt 后-Rt 前)式中RI #p——樣品色譜峰的RI ;RI w——樣品色譜峰前面烷烴標(biāo)樣的RI ; Rt樣品——樣品色譜峰的Rt ；Rtw—前面烷烴標(biāo)樣的Rt ；Rt后——后面烷烴標(biāo)樣的Rt ;Rt——色譜峰的保留時(shí)間。(5)定量分析通過Xaclbiur工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，從而得出各化學(xué)成分在牛肝菌物質(zhì)中的相對百分含量。(6) GC-O 分析質(zhì)譜與嗅覺計(jì)的分流比設(shè)置為1:1。本實(shí)驗(yàn)選擇3名有經(jīng)驗(yàn)的感官評價(jià)員進(jìn)行嗅覺分析，記錄風(fēng)味特征和強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)過程中至少有兩名感官評價(jià)員在同一嗅聞時(shí)間處能得到相同的感官描述，則將該記錄記入最終結(jié)果，氣味的強(qiáng)度以星號個(gè)數(shù)做記號。表I為牛肝菌中特 征性揮發(fā)性化合物的分析及鑒定結(jié)果。表I牛肝菌中特征性揮發(fā)性化合物的分析及鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種牛肝菌揮發(fā)性性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定方法，其特征在于:采用頂空固相微萃取技術(shù)提取牛肝菌中的揮發(fā)性成分，然后通過氣相色譜-質(zhì)譜儀對待測成分進(jìn)行定量和定性分析，結(jié)合保留指數(shù)鑒定牛肝菌中的揮揮發(fā)性化合物，最后利用氣相色譜-嗅覺測量法進(jìn)一步確定揮發(fā)性組成成分，同時(shí)通過感官描述和氣味強(qiáng)度確定各化合物對牛肝菌整體風(fēng)味貢獻(xiàn)的大小。
2.根據(jù) 權(quán)利要求1所述的牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定方法，其特征在于:所述頂空固相微萃取步驟中，萃取時(shí)間為20-40分鐘，確定為30分鐘，萃取溫度為30°C -60°C，優(yōu)選45°C，使用65μπι PDMS/DVB萃取頭。取Ig樣品置于15ml頂空瓶中，45°C水浴平衡30min后，將經(jīng)過老化處理的固相微萃取頭通過瓶蓋的橡皮墊插入到樣品瓶中大約Icm處，推出纖維頭，于45 °C水浴中萃取30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定方法，其特征在于:氣相色譜-質(zhì)譜檢測步驟中，萃取完成后將萃取頭插入到氣相色譜的進(jìn)樣口，于250°C下解析5min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。色譜柱型號為VF-5ms(30mX0.25mmX0.25 μ m)，載氣為高純度氦氣(99.999% )，流速為lml/min，進(jìn)樣口溫度為250°C，進(jìn)樣時(shí)以分流方式進(jìn)樣。采用兩段式程序升溫:起始溫度為40°C，保持3min，然后以4.(TC min升溫至150°C，并保持lmin，再以8°C /min升溫至250°C，保持6min。質(zhì)譜條件:電離源為EI，離子阱溫度為220°C，GC-MS傳輸線溫度為280°C，EI電子能量為70eV，溶劑延遲時(shí)間1.5min。掃描方式為全掃描(f.μ μ)，范圍為 43-500m/z。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肝菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定方法，其特征在于:特征性風(fēng)味物質(zhì)鑒定步驟中，質(zhì)譜與嗅覺計(jì)的分流比設(shè)置為1:1。本實(shí)驗(yàn)選擇3名有經(jīng)驗(yàn)的感官評價(jià)員進(jìn)行嗅覺分析，記錄風(fēng)味特征和強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)過柞中至少有兩名感官評價(jià)員在在同一嗅聞時(shí)間處能得到相同的感官描述，則將該記錄記入最終結(jié)果，氣味的強(qiáng)度以星號個(gè)數(shù)做記號。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定方法，其特征在于:揮發(fā)性成分的定性分析步驟中，利用質(zhì)譜譜圖分析、保留指數(shù)和嗅覺辨別三種方法結(jié)合準(zhǔn)確鑒定了待測揮發(fā)性化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定牛肝菌中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的方法，方法如下(1)采用頂空固相微萃取(HS-SPME)方法對牛肝菌中的揮發(fā)性成分進(jìn)行萃??；(2)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合Kovats保留指數(shù)(KI)對萃取到的揮發(fā)性成分進(jìn)行分離鑒定；(3)利用氣相色譜-嗅覺測量法(GC-O)對牛肝菌中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定。該發(fā)明建立的方法能夠簡單快速的分析牛肝菌中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，采用HS-SPME方法不需有機(jī)溶劑，避免了樣品在加熱過程中的揮發(fā)和產(chǎn)生其它物質(zhì)，有效地收集揮發(fā)性成分；利用質(zhì)譜譜圖分析、保留指數(shù)和嗅覺辨別三種方法結(jié)合準(zhǔn)確鑒定了待測揮發(fā)性化合物，提高了結(jié)果的可信度。
文檔編號G01N30/06GK103105440SQ20121043700
公開日2013年5月15日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者劉安軍, 鄭捷, 陳影, 曹蓓, 杜佳佳 申請人:天津科技大學(xué)