專利名稱：一種地溝油快速檢測試紙的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及地溝油檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種地溝油快速檢測試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
地溝油也被稱為潲水油、泔水油或餐桌回收油脂，是人們對于各種劣質(zhì)油脂的總稱；地溝油經(jīng)歷了多次高溫反復(fù)油炸與下水道的氧化腐敗過程，質(zhì)量、衛(wèi)生極差，成分發(fā)生變化，產(chǎn)生了如黃曲霉毒素、苯并芘等多種有毒物質(zhì)，并含有洗滌劑成分等后期污染物，如長期食用必然會引發(fā)身體的疾病。輕則引起消化不良、腹瀉，嚴(yán)重的會引發(fā)貧血、中毒性肝病等癥狀，長期食用有誘發(fā)癌癥的危險(xiǎn)，危害極大；近年來地溝油事件屢見不鮮據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有200-300萬噸地溝油回流市場，其中大部分并沒有用于煉制生物柴油等合法途徑，而是回流到餐桌，地溝油占據(jù)的食用油市場份額比例高達(dá)10%，而且現(xiàn)在的“地溝油”精煉程度已經(jīng)很高，一些肉眼可見污染物，完全可以通過精煉去掉。目前，根據(jù)地溝油的特征成分，地溝油的檢測方法主要有水分含量測定法、酸價(jià)測定法、膽固醇含量測定法、近紅外光譜法、電導(dǎo)率與極性物質(zhì)測定法、重金屬含量測定法；上述方法在應(yīng)用上各有優(yōu)勢，一定程度上都能進(jìn)行地溝油的定性定量檢測，但也存在缺陷如食用油中摻入地溝油的比例普遍需要達(dá)到相對較高的程度才能被檢出；電導(dǎo)率法的檢出下限為地溝油添加量達(dá)20%以上，膽固醇法的缺陷在于其檢出下限為地溝油的添加量在10%以上，而且在檢測中出現(xiàn)假陽性的可能性比較大；薄層層析法對于一些未經(jīng)純化油和加入其他成分的油，容易出現(xiàn)假陽性；對于一些檢測精度相對于上述方法比較高的，如深圳藥檢所，HPLC檢測膽固醇含量，最低檢測限20 μ g/ml ;深圳藥檢所，LC-MS法檢測DBS (十二烷基苯磺酸鈉)，檢出限為20 μ g/ml ;清華大學(xué)，順磁共振波譜法，檢測自由基等，需要大型貴重檢測儀器，并且耗時(shí)較長，更適用于實(shí)驗(yàn)室的確證檢驗(yàn)而不適于現(xiàn)場快速篩查的使用；上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增動(dòng)物特有基因片段定性檢測地溝油，靈敏度高(可檢測出最低1%。的含量)，但是整個(gè)操作過程繁瑣，需要非常專業(yè)的人員去操作；廣州市疾病預(yù)防控制中心利用免疫熒光學(xué)檢測方法檢測細(xì)菌脂溶性蛋白和脂多糖，但此法僅能從泔水中含有大量細(xì)菌方面對地溝油作出判斷；因此，開發(fā)新的快速檢測技術(shù)，用于食用油中地溝油的定性、定量檢測迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種地溝油快速檢測試紙的制備方法，包括如下步驟:A)免疫彩色乳膠微球的制備(a)彩色乳膠微球的預(yù)處理分別取紅色、黃色、藍(lán)色、綠色四色乳膠微球溶液，用超聲波處理后，用超純水調(diào)節(jié)濃度，離心，取沉淀用MES緩沖液清洗兩次，得到洗好的乳膠，用預(yù)冷的MES緩沖液分別將EDC和NHS配置成溶液加入到所述洗好的乳膠中，在室溫下緩慢混勻，孵育結(jié)束后離心，取沉淀用MES緩沖液清洗兩次，得到乳膠微球溶液；(b)抗體標(biāo)記用MES緩沖液將鼠抗黃曲霉毒素單克隆抗體、鼠抗
3苯并芘單克隆抗體、鼠抗茴香胺單克隆抗體和鼠抗DBS單克隆抗體稀釋，之后分別緩慢加入到用磁力攪拌器攪拌的紅色、黃色、藍(lán)色和綠色的所述乳膠微球溶液中，室溫輕柔攪拌后用PBS離心洗滌，沉淀用PBS-TBN溶解，超聲波處理后，加入PBS-TBN至標(biāo)記前體積，置4°C保存?zhèn)溆茫籅)免疫彩色膠乳反應(yīng)墊的制備將玻璃纖維膜浸泡于反應(yīng)墊處理液中，水浴處理后平鋪于紗網(wǎng)上干燥3-4h，將標(biāo)記后的彩色乳膠微球按照效價(jià)實(shí)驗(yàn)匹配的結(jié)果，以體積比為紅黃藍(lán)綠=2 2 4 5混合均勻，按照每毫升乳膠溶液鋪50cm2涂覆玻璃纖維膜，干燥16h后置4°C密封保存?zhèn)溆茫籆)NC膜的制備將抗原黃曲霉毒素-0VA，苯并芘-0VA，茴香胺-OVA和DBS-OVA用包被緩沖液分別稀釋至O. 3,0. 4,0. 4和O. 2mg/ml，用噴膜儀按I. O、O. 8,0. 8和I. 5 μ 1/cm分別噴涂于同一條NC膜上的不同區(qū)域作為檢測線，每條檢測線相距4-10mm,將濃度為2. Omg/ml的兔抗鼠IgG用噴膜儀按O. 5 μ 1/cm噴涂于質(zhì)控區(qū)作為質(zhì)控線，用封閉液封閉NC反應(yīng)膜，再用PBST洗脫，然后室溫晾干備用；D)彩色膠乳試紙條的的組裝將樣品墊放入處理液中處理后干燥備用，將干燥后的樣品墊、反應(yīng)墊、NC反應(yīng)膜和吸水濾紙按順序裝配在PVC底板上，用帶mark膠帶繞背板覆蓋在樣品墊、反應(yīng)墊及吸水濾紙上，然后用切條機(jī)切割成2-10mm寬的試紙條，制成地溝油彩色膠乳微球免疫層析檢測試紙條。利用本發(fā)明制備的地溝油檢測試紙?jiān)诔叵驴杀Ｙ|(zhì)兩年，有效延長保質(zhì)期并降低保存條件；非專業(yè)人士用該檢測試紙即可完成全程檢測，操作簡單，有利于該法的推廣和普及；整個(gè)檢測過程最快可以在IOmin內(nèi)完成，更適合于現(xiàn)場快速篩選。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟A)中乳膠微球的直徑為lOOnm，變異系數(shù)< 10%，此時(shí)乳膠遷移速度及靈敏度均為最佳，且粒徑接近，重現(xiàn)性好。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述超聲波的頻率為80Hz，經(jīng)過超聲波脫氣處理后的乳膠顆粒會增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述地溝油彩色膠乳微球免疫層析檢測試紙條各組分的尺寸為吸水濾紙2. 5cm, NC膜3. 5cm,反應(yīng)墊Icm,樣品墊3cm, PVC底板9cm,各部件比例適中，結(jié)果判讀更可靠、清晰。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明制備的地溝油檢測試紙檢測靈敏度高，可以同時(shí)檢測多個(gè)指標(biāo)，為地溝油檢測提供更全面、系統(tǒng)的檢測方法，相對縮小檢測成本；該檢測試紙?jiān)诔叵驴杀Ｙ|(zhì)兩年，有效延長保質(zhì)期并降低保存條件；非專業(yè)人士用該檢測試紙即可完成全程檢測，操作簡單，有利于該法的推廣和普及；整個(gè)檢測過程最快可以在IOmin內(nèi)完成，更適合于現(xiàn)場快速篩選。


圖I為地溝油彩色膠乳微球免疫層析檢測試紙條的組裝示意圖2為地溝油預(yù)處理裝置示意圖3為四條檢測線均顯色示意圖4為黃曲霉毒素超標(biāo)意圖5為試紙失效不意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例一免疫彩色乳膠微球的制備。I、彩色乳膠微球的預(yù)處理。分別取直徑在IOOnm左右，顆粒大小均勻，變異系數(shù)< 10%的紅色、黃色、藍(lán)色、綠色四色乳膠微球溶液，用80Hz超聲波處理5min后，用超純水調(diào)節(jié)濃度為1%，IOOOOgX IOmin離心，取沉淀用25mM，pH6. O MES緩沖液清洗兩次備用。分別用預(yù)冷的25mM，pH6. O MES緩沖液將EDC和NHS均配置成50mg/ml的溶液備用，按每毫升乳膠加入165 μ IDEC溶液和165 μ I NHS溶液將EDC和NHS加入到洗好的乳膠中。在室溫下緩慢混勻30min ；孵育結(jié)束后IOOOOgX IOmin離心，取沉淀用等體積的25mM，pH6. O MES緩沖液清洗兩次。2、抗體標(biāo)記。用25mM，pH6. O MES緩沖液將抗體A (鼠抗黃曲霉毒素單克隆抗體)稀釋至
O.6mg/ml,抗體B (鼠抗苯并花單克隆抗體)稀釋至O. 8mg/ml,抗體C (鼠抗茴香胺單克隆抗體)稀釋至1.0mg/ml，抗體D (鼠抗DBS單克隆抗體)稀釋至O. 5mg/ml ;分別取上述四種顏色乳膠微球溶液用磁力攪拌器攪拌，在紅色溶液中緩慢加入抗體A(每毫升乳膠加入O. 33ml抗體)使抗體終濃度為O. 6mg/ml，在黃色溶液中緩慢加入抗體B(每毫升乳膠加入O. 33ml抗體)使抗體終濃度為O. 8mg/ml，在藍(lán)色溶液中緩慢加入抗體C (每毫升乳膠加入O. 33ml抗體)使抗體終濃度為O. 8mg/ml，在綠色溶液中緩慢加入抗體D (每毫升乳膠加入O. 33ml抗體)使抗體終濃度為O. 4mg/ml ;室溫輕柔攪拌2h后用O. IM pH7. O PBS 4次離心洗滌，每次分別用IOOOOgX IOmin離心；沉淀用PBS-TBN溶解，80Hz超聲波5min處理后，加入PBS-TBN使達(dá)到標(biāo)記前體積，置4°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例二彩色膠乳微球免疫層析檢測試紙條的性能評價(jià)。I、試紙條最低檢出限的測定。
室溫條件下，將黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品、苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品、茴香胺標(biāo)準(zhǔn)品和DBS標(biāo)準(zhǔn)品分別配成系列濃度(l_243ng/ml)的溶液，取100 μ I加入酶標(biāo)板微孔中，用地溝油彩色膠乳微球免疫層析檢測試紙條進(jìn)行依次分析，重復(fù)3次；通過肉眼觀察，檢測條檢測線顏色明顯淺于陰性對照條檢測線顏色時(shí)的最小標(biāo)準(zhǔn)品濃度，即為該試紙條的肉眼判定檢測限；其中黃曲霉毒素檢測限為7ppb,苯并花檢測限為9ppb,茴香胺檢測限為9ppb, DBS檢測限為5ppb。結(jié)果如表一所示+表示微顯色，++表示顯色，+++表示顯著顯色，一表示不顯色。
權(quán)利要求
1.一種地溝油快速檢測試紙的制備方法，其特征在于包括如下步驟 A)免疫彩色乳膠微球的制備(a)彩色乳膠微球的預(yù)處理分別取紅色、黃色、藍(lán)色、綠色四色乳膠微球溶液，用超聲波處理后，用超純水調(diào)節(jié)濃度，離心，取沉淀用MES緩沖液清洗兩次，得到洗好的乳膠，用預(yù)冷的MES緩沖液分別將EDC和NHS配置成溶液加入到所述洗好的乳膠中，在室溫下緩慢混勻，孵育結(jié)束后離心，取沉淀用MES緩沖液清洗兩次，得到乳膠微球溶液；(b)抗體標(biāo)記用MES緩沖液將鼠抗黃曲霉毒素單克隆抗體、鼠抗苯并芘單克隆抗體、鼠抗茴香胺單克隆抗體和鼠抗DBS單克隆抗體稀釋，之后分別緩慢加入到用磁力攪拌器攪拌的紅色、黃色、藍(lán)色和綠色的所述乳膠微球溶液中，室溫輕柔攪拌后用PBS離心洗滌，沉淀用PBS-TBN溶解，超聲波處理后，加入PBS-TBN至標(biāo)記前體積，置4°C保存?zhèn)溆茫? B)免疫彩色膠乳反應(yīng)墊的制備將玻璃纖維膜浸泡于反應(yīng)墊處理液中，水浴處理后平鋪于紗網(wǎng)上干燥3 4h，將標(biāo)記后的彩色乳膠微球按照效價(jià)實(shí)驗(yàn)匹配的結(jié)果，以體積比為紅黃藍(lán)綠=2 2 4 5混合均勻，按照每毫升乳膠溶液鋪50cm2涂覆玻璃纖維膜，干燥16h后置4°C密封保存?zhèn)溆茫? ONC膜的制備將抗原黃曲霉毒素-0VA，苯并芘-0VA，茴香胺-OVA和DBS-OVA用包被緩沖液分別稀釋至O. 3、0. 4、0. 4和O. 2mg/ml，用噴膜儀按I. O、O. 8、O. 8和I. 5 μ I /cm分別噴涂于同一條NC膜上的不同區(qū)域作為檢測線，每條檢測線相距4-10mm，將濃度為2. Omg/ml的兔抗鼠IgG用噴膜儀按O. 5 μ 1/cm噴涂于質(zhì)控區(qū)作為質(zhì)控線，用封閉液封閉NC反應(yīng)膜，再用PBST洗脫，然后室溫晾干備用； D)彩色膠乳試紙條的的組裝將樣品墊放入處理液中處理后干燥備用，將干燥后的樣品墊、反應(yīng)墊、NC反應(yīng)膜和吸水濾紙按順序裝配在PVC底板上,用帶mark膠帶繞背板覆蓋在樣品墊、反應(yīng)墊及吸水濾紙上，然后用切條機(jī)切割成2-10mm寬的試紙條，制成地溝油彩色膠乳微球免疫層析檢測試紙條。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種地溝油快速檢測試紙的制備方法，其特征在于步驟A)中所述乳膠微球的直徑為lOOnm，變異系數(shù)< 10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種地溝油快速檢測試紙的制備方法，其特征在于步驟A)中所述超聲波的頻率為80Hz。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種地溝油快速檢測試紙的制備方法，其特征在于步驟B)中所述水浴的溫度為37°C，處理時(shí)間為30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種地溝油快速檢測試紙的制備方法，其特征在于步驟D)中所述地溝油彩色膠乳微球免疫層析檢測試紙條各組分的尺寸為吸水濾紙2. 5cm, NC膜.3.5cm,反應(yīng)墊Icm,樣品墊3cm, PVC底板9cm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種地溝油快速檢測試紙的制備方法，包括如下步驟A)免疫彩色乳膠微球的制備；B)免疫彩色膠乳反應(yīng)墊的制備；C)NC膜的制備；D)彩色膠乳試紙條的的組裝。利用本發(fā)明制備的地溝油檢測試紙檢測靈敏度高，可以同時(shí)檢測多個(gè)指標(biāo)，為地溝油檢測提供更全面、系統(tǒng)的檢測方法，相對縮小檢測成本；該檢測試紙?jiān)诔叵驴杀Ｙ|(zhì)兩年，有效延長保質(zhì)期并降低保存條件；非專業(yè)人士用該檢測試紙即可完成全程檢測，操作簡單，有利于該法的推廣和普及；整個(gè)檢測過程最快可以在10min內(nèi)完成，更適合于現(xiàn)場快速篩選。
文檔編號G01N33/577GK102928600SQ20121044031
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者李攀, 談?dòng)钋?申請人:深圳市寶凱侖科技有限公司