專利名稱：一種基于點(diǎn)擊化學(xué)仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及對(duì)食品過敏原的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品過敏原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種能夠檢測(cè)食品過敏原的電化學(xué)傳感器制備，本發(fā)明還涉及采用所述的仿生分子印跡技術(shù)測(cè)定樣品中痕量食品過敏原的方法。
背景技術(shù)：
食品過敏原現(xiàn)已成為一個(gè)新興的公眾性食品安全問題，特別是在發(fā)達(dá)國家，調(diào)查顯示全世界范圍內(nèi)有超過1%的成年人對(duì)食品過敏，而嬰幼兒和兒童發(fā)生率達(dá)到了 5%-10%。一般來說，食品過敏原為分別屬于不同家族的蛋白或糖蛋白，微量的食品過敏原蛋白即可 引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。近年來，國際食品法典委員會(huì)、各發(fā)達(dá)國家紛紛出臺(tái)了各種食品過敏原標(biāo)識(shí)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的實(shí)施措施，其中以美國和歐盟的尤為嚴(yán)格，已經(jīng)進(jìn)入了強(qiáng)制性實(shí)施階段，這對(duì)我國農(nóng)產(chǎn)品、食品進(jìn)出口貿(mào)易帶來了不容忽視的影響。我國也于2008年奧運(yùn)會(huì)期間正式開展了食品過敏原檢測(cè)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定工作。目前系統(tǒng)全面精確可靠的食品中過敏原檢測(cè)和分析技術(shù)體系形成迫在眉睫。過敏原反應(yīng)是由過敏原入侵人體內(nèi)而致,引起過敏反應(yīng)的反應(yīng)原一般為具有酸性等電點(diǎn)的蛋白或糖蛋白。過敏原在食品的加工處理中表現(xiàn)出極大的穩(wěn)定性，通過一般加工手段如加熱、超高壓、烘烤、干燥后其酶活性仍然存在，尚具備一定程度的致敏性，這是食品安全上的一個(gè)難題。世界糧油組織1995年報(bào)告，90%以上的食物過敏反應(yīng)是由牛奶、雞蛋、魚、貝殼海產(chǎn)品、花生、大豆、果仁和小麥8類食物引起，10%的過敏原是由170多種其他食物引起。檢測(cè)過敏原的方法主要有I)體內(nèi)檢查，如皮膚試驗(yàn)(劃痕試驗(yàn)，點(diǎn)刺試驗(yàn),皮內(nèi)注射試驗(yàn))和激發(fā)試驗(yàn)(氣道粘膜、結(jié)膜激發(fā)反應(yīng))；2)體外檢查，如嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)、放射免疫吸附試驗(yàn)(RIST)、放射變應(yīng)原吸附試驗(yàn)(RAST)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。其中應(yīng)用最為廣泛的方法是皮膚試驗(yàn)，它為過敏癥診斷可提供快速但卻是非定量的結(jié)果，而無論對(duì)醫(yī)生還是病人來講，體外診斷無疑是方便和可靠的，但由于ELISA檢測(cè)試劑盒和試條，存在復(fù)雜的抗體制備過程，價(jià)格較為昂貴；PCR技術(shù)雖具有開發(fā)前景，但是食品處理過程中DNA的變性作用和該方法的最大檢測(cè)限度限制了其在當(dāng)前的應(yīng)用和發(fā)展。迫切需要開發(fā)各種特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、成本低、檢測(cè)面廣的分析檢測(cè)方法和技術(shù)來適應(yīng)形勢(shì)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于點(diǎn)擊化學(xué)仿生分子印跡食品過敏原快速檢測(cè)傳感器的制備及應(yīng)用，本發(fā)明以仿生分子印跡膜為基礎(chǔ)，建立了食品過敏原的電化學(xué)仿生免疫傳感快速檢測(cè)方法，成功建立了快速、特異、靈敏的檢測(cè)食品過敏原的傳感器。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種基于點(diǎn)擊化學(xué)仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及對(duì)食品過敏原的檢測(cè)，其特征是包括以下步驟
(O 選擇與電極表面固定的疊氮燒基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜；
(2)通過與丙烯酸丙炔酯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，對(duì)疊氮端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化；
(3)選擇能與過敏原反應(yīng)合成過敏原仿生分子印跡聚合物(MIPs)的功能單體；
(4)利用現(xiàn)有方法制備出石墨烯材料，摻入到仿生分子印跡聚合物；
(5)按一定物質(zhì)的量比將食品過敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑混合均勻，制備分子印跡聚合物溶液；
(6 ) 將分子印跡聚合物溶液滴于經(jīng)過(2 )處理過的電極表面，紫外光引發(fā)制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物；
本發(fā)明所述食品過敏原仿生分子印跡聚合物的模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、致孔齊U、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑的物質(zhì)的量比為O. I I : I : O. 5 5 20 55 O. 05
O.2 : I. 5 30，每毫升中摻入IOmg石墨烯。本發(fā)明所述摻有石墨烯材料的仿生分子印跡聚合物制備的傳感器檢測(cè)痕量食品過敏原的方法，將按上述任意一種方法制得的分子印跡聚合物通過點(diǎn)擊化學(xué)修飾于工作電極制備電化學(xué)傳感器，對(duì)食品提取液中的食品過敏原進(jìn)行檢測(cè)，其特征是包括如下步驟
(1)含過敏原食品經(jīng)正己烷4°C浸提過夜，冷凍離心，收集上清液，用30%_50%飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)組分溶解在PBS中，分別加硫酸至pH 5. 2或pH4. 5等電點(diǎn)，離心后沉淀物溶解在PBS中，得到食品過敏原；
(2)將所用金電極(Φ=4ι πι)用O. 05 μ m的招粉進(jìn)行拋光,用piranha溶液(H2SO4/H202=3:1)浸泡5min，二次蒸餾水洗滌，氮?dú)鈿夥崭稍?，將清洗過的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，再用二次蒸餾水清洗干凈，氮?dú)鈿夥障赂稍?°C保存使用；
(3)將(2)處理過的金電極,在lmmol/L硫代癸燒和2mmol/L疊氮^ 燒基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮?dú)獯蹈桑?br> (4)將步驟(3)處理過的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有抗壞血酸和硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌，然后二次蒸餾水洗滌，晾干；
(5)將步驟(4)處理過的工作電極晾干后滴加MIPs溶液20μ L，紫外光(365nm)下誘導(dǎo)聚合反應(yīng)lh，然后將工作電極用洗脫劑洗脫10-15分鐘，在室溫下干燥5-10分鐘，成功制備過敏原仿生分子印跡膜電化學(xué)傳感器，保存在4°C的冰箱中備用；
(6)將制得的過敏原分子印跡膜電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)樣品提取液中的過敏原進(jìn)行檢測(cè)。所述的置氣燒基硫醇為置氣十一燒基硫醇，丙稀酸丙塊酷對(duì)置氣端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化。所述的仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的工作電極為金電極(Φ=4πιπι)；
所述的模板食品過敏原可以是水溶性并與功能單體、交聯(lián)單體相容；
所述的功能單體為丙烯酰胺(AM)、甲基丙烯酰胺(MAM)、丙烯酸(ΑΑ)、甲基丙烯酸(MAA)或4-乙烯基吡啶(4-VP)；
所述交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)、N、N-亞甲基二丙烯酰胺、3，5_ 二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)；
所述的引發(fā)劑是可以引起聚合反應(yīng)但不使模板蛋白發(fā)生變性的所有引發(fā)劑包括熱引發(fā)劑和光引發(fā)劑，包括偶氮二異丁腈、過硫酸鉀、過硫酸銨、二乙基二硫代氨基甲酸鈉等；所述致孔劑采用二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、異丙醇；
所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷或四氯化碳；
所述洗脫液為可以將模板蛋白從印跡膜上洗脫的緩沖溶液、鹽溶液、堿溶液和變性劑等，包括各種濃度的磷酸鹽緩沖溶液或NaCl鹽溶液和NaOH堿溶液或變性劑十二烷基硫酸鈉等。
具體實(shí)施方式
·
實(shí)施例I :花生過敏原的檢測(cè)
(1)稱取花生30g，使用組織破碎機(jī)破碎得粉末，按重量體積比g/mL為1:10浸入正己烷中脫脂，4°C浸提過夜，冷凍離心，收集上層蛋白浸液，IOmL蛋白浸液緩慢加至質(zhì)量濃度30%的飽和硫酸銨，4°C下靜置過夜，離心沉淀，對(duì)上層清液再緩慢加至質(zhì)量濃度50%飽和硫酸銨，靜置30min，離心，將30%-50%飽和度沉淀的蛋白質(zhì)組分溶解在PBS中，加硫酸至PH5. 2等電點(diǎn)，離心后沉淀物溶解在PBS中，裝入透析袋對(duì)蒸餾水透析4h，期間換透析液一次，然后轉(zhuǎn)至PBS中繼續(xù)透析，即得花生過敏原待測(cè)液，取待測(cè)液ImL加入傳感反應(yīng)池中進(jìn)行檢測(cè)；
(2)選擇能與花生過敏原合成仿生分子印跡聚合物的功能單體丙烯酰胺(AM)；
(3)石墨烯材料溶液的制備在超聲攪拌的條件下，取2mg石墨烯加入到水中，從而獲得黑色溶液；
(4)模板分子花生過敏原，功能單體丙烯酰胺(AM)，交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，致孔劑氯仿，引發(fā)劑過硫酸鉀，有機(jī)溶劑二氯甲烷按物質(zhì)的量比為
O.5 I I 40 O. I 2.0，摻入石墨烯，混合均勻，得到花生過敏原MIPs溶液；
(5)工作電極選用金電極為工作電極，將所用金電極(Φ=4πιπι)用O.05 μ m的鋁粉進(jìn)行拋光，用piranha溶液(H2S04/H202=3:1 )浸泡5min, 二次蒸懼水洗漆,氮?dú)鈿夥崭稍?將清洗過的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，再用二次蒸餾水清洗干凈，保證電極表面無雜質(zhì)；
(6)將(5)處理好的金電極,在lmmol/L硫代癸燒和2mmol/L疊氮^燒基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮?dú)獯蹈桑?br> (7)將步驟(6)制備好的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有O.lmol/L抗壞血酸和O. 05mol/L硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌2次，然后二次蒸餾水洗滌3次，晾干;
(8)將步驟(7)處理過的工作電極晾干后滴加MIPs溶液20μL，紫外光(365nm)下誘導(dǎo)聚合反應(yīng)lh，將電極在l%SDS-10%HAc混合液洗脫中浸泡10 min，直至把這一層中的模版分子花生過敏原完全洗掉，在室溫下干燥10 min，成功制備花生過敏原仿生分子印跡電化學(xué)傳感器，保存在4°C的冰箱中備用；
(9)將制得的花生過敏原分子印跡膜電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)花生樣品提取液中的花生過敏原進(jìn)行檢測(cè)，花生過敏原蛋白的最低檢測(cè)限為10ng/mL。
實(shí)施例2 :雞蛋過敏原檢測(cè)
(1)將雞蛋中蛋清與蛋黃分開，稱取蛋清30g，按重量體積比g/mL為1:10浸入正己烷中脫脂，將蛋清攪拌均勻，4°C浸提過夜，冷凍離心，收集上層蛋白浸液，IOmL蛋白浸液緩慢加至質(zhì)量濃度30%的飽和硫酸銨，4°C下靜置過夜，離心沉淀，對(duì)上層清液再緩慢加至質(zhì)量濃度50%飽和硫酸銨，靜置30min，離心，將30%_50%飽和度沉淀的蛋白質(zhì)組分溶解在PBS中，加硫酸至PH5. 2等電點(diǎn)，離心后沉淀物溶解在PBS中，裝入透析袋對(duì)蒸餾水透析4h，期間換透析液一次，然后轉(zhuǎn)至PBS中繼續(xù)透析，即得雞蛋過敏原待測(cè)液，取待測(cè)液ImL加入傳感反應(yīng)池中進(jìn)行檢測(cè)；
(2)選擇能與雞蛋過敏原合成仿生分子印跡聚合物的功能單體甲基丙烯酰胺(MAM)；
(3)石墨烯材料溶液的制備在超聲攪拌的條件下，取2mg石墨烯加入到水中，從而獲得黑色溶液；
(4)模板分子雞蛋過敏原，功能單體甲基丙烯酰胺(MAM)，交聯(lián)劑3，5_二 (丙烯酰胺)苯甲酸，致孔劑四氯化碳，引發(fā)劑偶氮二異丁腈，有機(jī)溶劑四氯化碳按物質(zhì)的量比為
O.2 I O. 5 50 O. 15 5. 0，摻入適量石墨烯，混合均勻，得到雞蛋過敏原MIPs溶液；
(5)工作電極選用金電極為工作電極，將所用金電極(Φ=4πιπι)用O.05 μ m的鋁粉進(jìn)行拋光，用piranha溶液(H2S04/H202=3:1 )浸泡5min, 二次蒸懼水洗漆,氮?dú)夥崭稍?將清洗過的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，再用二次蒸餾水清洗干凈，保證電極表面無雜質(zhì)；
(6)將處理好的金電極，在lmmol/L硫代癸烷和2mmol/L疊氮i^一烷基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮?dú)獯蹈桑?br> (7)將步驟(6)制備好的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有O.lmol/L抗壞血酸和O. 05mol/L硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌2次，然后二次蒸餾水洗滌3次，晾干;
(8)將步驟(7)中晾干的工作電極上滴加步驟(4)制備的MIPs溶液20yL，紫外光(365nm)下誘導(dǎo)聚合反應(yīng)lh，將電極在l%SDS_10%HAc混合液洗脫中浸泡lOmin，直至把這一層中的模版分子雞蛋過敏原完全洗掉，在室溫下干燥10 min，成功制備雞蛋過敏原仿生分子印跡電化學(xué)傳感器，保存在4°C的冰箱中備用；
(9)將制得雞蛋過敏原分子印跡膜電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)雞蛋樣品提取液中的雞蛋過敏原進(jìn)行檢測(cè)，雞蛋過敏原蛋白的最低檢測(cè)限為2. Ong/mL。
權(quán)利要求
1.一種基于點(diǎn)擊化學(xué)食品過敏原仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用，其特征是包括以下步驟 (O選擇與電極表面固定的疊氮燒基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜； (2)通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，對(duì)疊氮端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化； (3)選擇能與過敏原反應(yīng)合成過敏原仿生分子印跡聚合物(MIPs)的功能單體； 利用現(xiàn)有方法制備出石墨烯材料，摻入到仿生分子印跡聚合物； (5)按一定物質(zhì)的量比將食品過敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑混合均勻，制備分子印跡聚合物溶液； (6)將分子印跡聚合物溶液滴于經(jīng)過(2)處理過的電極表面，紫外光引發(fā)制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述點(diǎn)擊化學(xué)食品過敏原仿生分子印跡的制備方法，其特征是所述食品過敏原仿生分子印跡聚合物的模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑的物質(zhì)的量比為O. I I : I : O. 5 5 20 55 O. 05 O. 2 I. 5 30，每毫升中摻入IOmg石墨烯。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述點(diǎn)擊化學(xué)食品過敏原仿生分子印跡的制備方法，其特征是所述摻有石墨烯材料的仿生分子印跡聚合物MIPs修飾到傳感器檢測(cè)痕量食品過敏原的方法，其特征是包括如下步驟 含過敏原食品經(jīng)正己烷4°C浸提過夜，冷凍離心，收集上清液；用30%-50%飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)組分溶解在PBS中，分別加硫酸至pH5. 2或pH4. 5等電點(diǎn)，離心后沉淀物溶液在PBS中，得到食品過敏原； 將所用金電極(Φ=4ι πι)用O. 05 μ m的招粉進(jìn)行拋光,用piranha溶液(H2S04/H202=3:1)浸泡5min，二次蒸餾水洗滌，氮?dú)夥崭稍?，將清洗過的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，再用二次蒸餾水清洗干凈，氮?dú)夥障赂稍?°C保存使用； 將(2)處理好的金電極，在lmmol/L硫代癸烷和2mmol/L疊氮i^一烷基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮?dú)獯蹈桑? 將步驟(3 )制備好的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有抗壞血酸和硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌，然后二次蒸餾水洗滌，晾干； 將步驟(4)中晾干的工作電極上滴加MIPs溶液20yL，紫外光(365nm)下誘導(dǎo)聚合反應(yīng)lh，然后將工作電極用洗脫劑洗脫10-15分鐘，在室溫下干燥5-10分鐘，成功制備過敏原仿生分子印跡膜電化學(xué)傳感器，保存在4°C的冰箱中備用； 將制得的過敏原分子印跡膜電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)樣品提取液中的過敏原進(jìn)行檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的置氣燒基硫醇為置氣十一燒基硫醇，丙稀酸丙塊酷對(duì)置氣端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的模板食品過敏原可以是水溶性并與功能單體、交聯(lián)單體相容。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述洗脫液為可以將模板蛋白從印跡膜上洗脫的緩沖溶液、鹽溶液、堿溶液和變性劑等，包括各種濃度的磷酸鹽緩沖溶液或NaCl鹽溶液和NaOH堿溶液或變性劑十一焼基硫酸納等 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于點(diǎn)擊化學(xué)仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及對(duì)食品過敏原的檢測(cè)方法。選擇與電極表面固定的疊氮烷基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜；通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，對(duì)疊氮端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化；選擇能與過敏原反應(yīng)合成過敏原人工抗體的MIPs的功能單體；利用現(xiàn)有方法制備出石墨烯材料，摻入到人工抗體的制備；按一定物質(zhì)的量比將食品過敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑混合均勻制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物(MIPs)；將制得的分子印跡聚合物修飾工作電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)食品提取液中的食品過敏原進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/26GK102944590SQ20121047217
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者葛慎光, 顏梅, 于京華, 葛磊, 黃加棟, 張彥, 楚成超, 王盼盼, 劉芳, 劉偉艷, 孫國強(qiáng) 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)