專利名稱：一種植物樣品中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物樣品中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量檢測方法，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞分裂素(cytokinins，CKs)是一類腺嘌呤衍生物，根據(jù)N_7位上的取代基的不同分為異戊烯基腺嘌呤和芳香基腺嘌呤。在植物體內(nèi)，細(xì)胞分裂素以自由堿，細(xì)胞分裂素核苷、核苷酸和細(xì)胞分裂素糖苷形式存在，現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞分裂素有四十多種。細(xì)胞分裂素在植物體整個生命中起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞的分裂與分化，根、芽的形成與生長、損傷后的再生，消除頂端優(yōu)勢等。近年來，關(guān)于細(xì)胞分裂素的生理學(xué)機(jī)能，例如CKs的生物合成、降解、代謝路徑以及與其他激素之間的相互作用的研究收到廣泛關(guān)注。但由于植物的提取液中基質(zhì)復(fù)雜且細(xì)胞分裂素的含量低，這些研究的開展受到一定限制。因此，建立高效的樣品前處理方法并結(jié)合高靈敏度的檢測方法是CKs檢測的關(guān)鍵。目前，已報道的植物中細(xì)胞分裂素的前處理方法包括液液萃取、固相萃取、磁固相萃取和液相色譜純化方法等。較其他方法相比，固相萃取因具有操作簡便，可選商品化的填料種類多而被廣泛使用。但是，這些方法一般是多步或多層不同性質(zhì)(反相型、離子交換型和混合模式型)的填料的組合，操作過程繁瑣，且細(xì)胞分裂素在實(shí)際樣品中的回收率低，消耗的植物樣品量多(一般需要200毫克)，且在處理過程中用到多種不同種類的溶劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡單、快速的植物樣品中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量檢測方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所提出的技術(shù)方案為一種植物樣品中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量檢測方法，包括以下步驟I)提取內(nèi)源性細(xì)胞分裂素準(zhǔn)確稱量植物樣品后用液氮冷凍，研磨至粉末狀，加入同位素內(nèi)標(biāo)[2H6]異戊烯基腺嘌呤，[2H6]異戊烯基腺嘌呤核苷，[2H6]異戊烯基腺嘌呤9-糖苷，[2H5]反式玉米素，[2H5]反式玉米素核苷，[2H5]反式玉米素9-糖苷，[2H3] 二氫玉米素，[2H3] 二氫玉米素核苷，然后加入乙腈，_20°C以下放置12小時以上；2)除固體將步驟I)所得樣品離心，取上清液；3)固相萃取除雜將步驟2)所得的上清液通過事先用平衡液平衡后的固相萃取小柱，清洗后收集解吸液，除去收集到的解吸液中的溶劑；4)定容檢測將步驟3)所得樣品定容后進(jìn)入高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜分析，檢測細(xì)胞分裂素。所述的固相萃取小柱填料為親水性填料。作為一種優(yōu)選，所述的固相萃取小柱填料為硅膠。本發(fā)明所述的植物樣品包括水稻、油菜、擬南芥、番茄、煙葉等植物的根、莖、葉、花、花粉等組織及其組織提取液。細(xì)胞分裂素是一類腺嘌呤的衍生物，其結(jié)構(gòu)中均含氮原子的雜環(huán)或糖苷鍵，賦予其一定的親水性。因此，我們利用親水作用來富集純化細(xì)胞分裂素。在固相萃取步驟中，硅膠是廉價易得的吸附劑，利用親水作用富集提取液中的細(xì)胞分裂素，再通過清洗步驟，除去非極性雜質(zhì)(非極性色素等)。此外，植物基質(zhì)中的極性基質(zhì)在分離過程中最先出來，實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)與目標(biāo)的細(xì)胞分裂素的分離。本發(fā)明利用親水作用通過固相萃取柱(硅膠)可以有效地富集細(xì)胞分裂素，除去非極性雜質(zhì)，需要的樣品量少，操作簡單，實(shí)現(xiàn)快速的細(xì)胞分裂素檢測方法，使細(xì)胞分裂素在實(shí)際樣品中有較高的回收率，僅在20mg植物葉片和根中實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的檢測。


圖1是應(yīng)用本發(fā)明所提供的8種細(xì)胞分裂素標(biāo)準(zhǔn)樣品的多反應(yīng)監(jiān)測譜圖，其中，I為反式玉米素9-糖苷(t-Z9G) ,2為反式玉米素(t-Z) ,3為二氫玉米素(DHZ),4為反式玉米素核苷(t-ZR)，5為二氫玉米素核苷(DHZR)，6為異戊烯基腺嘌呤9-糖苷(iP9G)，7為異戊烯基腺嘌呤(iP)，8為異戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)。圖2為檢測到的水稻葉中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素多反應(yīng)監(jiān)測譜圖，其中，I為反式玉米素9-糖苷(t-Z9G)，2為反式玉米素(t-Z)，3為二氫玉米素(DHZ)，4為反式玉米素核苷(t-ZR)，6為異戊烯基腺嘌呤9-糖苷(iP9G)，7為異戊烯基腺嘌呤(iP)，8為異戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)。圖3為檢測到的水稻根中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素多反應(yīng)監(jiān)測譜圖，其中，I為反式玉米素9-糖苷(t-Z9G), 3為二氫玉米素(DHZ), 4為反式玉米素核苷(t_ZR), 6為異戊烯基腺嘌呤9-糖苷(iP9G)，7為異戊烯基腺嘌呤(iP)，8為異戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1水稻葉中細(xì)胞分裂素的測定準(zhǔn)確稱量20mg水稻葉片液氮冷凍，置于1. 5mL離心管中，用球磨機(jī)研磨至粉末狀后，加入同位素內(nèi)標(biāo)[2H6]異戊烯基腺嘌呤，[2H6]異戊烯基腺嘌呤核苷，[2H6]異戊烯基腺嘌呤9-糖苷，[2H5]反式玉米素，[2H5]反式玉米素核苷，[2H5]反式玉米素9-糖苷，[2H3] 二氫玉米素，[2H3] 二氫玉米素核苷各O. lng，同時以2001^乙腈-201放置1211。樣品以IOOOOrpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，取上清液。然后將所得上清液通過事先經(jīng)過2mL乙腈/水(1/1，v/v)、2mL乙腈/水(9/1，v/v)和2mL乙腈平衡的固相萃取小柱。然后再以ImL乙腈清洗；最后，以乙腈/水(l/4，V/V，lmL)，解吸。收集解吸液，氮?dú)獯蹈?，定容至IOOyL,進(jìn)入高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜分析，進(jìn)樣體積為20 μ L。檢測到的水稻葉中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素，如圖2所示。為實(shí)現(xiàn)樣品中細(xì)胞分裂素的定量，本發(fā)明提供了 8種細(xì)胞分裂素的標(biāo)準(zhǔn)樣品的多反應(yīng)監(jiān)測譜圖，如圖1所示。8種細(xì)胞分裂素 的多反應(yīng)監(jiān)測模式離子對如表I所示表1. 8種細(xì)胞分裂素的多反應(yīng)監(jiān)測模式定量離子對
權(quán)利要求
1.一種植物樣品中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取內(nèi)源性細(xì)胞分裂素準(zhǔn)確稱量植物樣品后用液氮冷凍，研磨至粉末狀，加入同位素內(nèi)標(biāo)[2H6]異戊烯基腺嘌呤，[2H6]異戊烯基腺嘌呤核苷，[2H6]異戊烯基腺嘌呤9-糖苷，[2H5]反式玉米素，[2H5]反式玉米素核苷，[2H5]反式玉米素9-糖苷，[2H3] 二氫玉米素，[2H3]二氫玉米素核苷，然后加入乙腈，_20°C以下放置12小時以上； 2)除固體將步驟I)所得樣品離心，取上清液； 3)固相萃取除雜將步驟2)所得的上清液通過事先用平衡液平衡后的固相萃取小柱，清洗后收集解吸液，除去收集到的解吸液中的溶劑； 4)定容檢測將步驟3)所得樣品定容后進(jìn)入高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜分析，檢測細(xì)胞分裂素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物樣品中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量測定方法，其特征在于所述的固相萃取小柱填料為親水性填料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種植物樣品中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量測定方法，其特征在于所述的固相萃取小柱填料為硅膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物樣品中內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量檢測方法。該方法先以乙腈提取細(xì)胞分裂素，再以硅膠固相萃取小柱富集除雜后，吹干、定容，采用高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的定量檢測。該方法操作簡單快速，樣品用量少，使用溶劑種類少，有效除去了大部分植物基質(zhì)，回收率較高，可實(shí)現(xiàn)低含量的內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的檢測。
文檔編號G01N30/08GK103048404SQ20121055574
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者馮鈺锜, 蔡保東 申請人:武漢大學(xué)