專利名稱：一種快速測(cè)定食品中生物胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速測(cè)定食品中生物胺的方法，屬于食品分析和安全技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物胺是一類含氮的低分子量堿性有機(jī)化合物；含有蛋白質(zhì)和氨基酸的食品，在一定條件下經(jīng)過(guò)發(fā)酵或生化反應(yīng)便可產(chǎn)生生物胺。目前已發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品、肉制品、乳制品、葡萄酒、啤酒、蔬菜、水果、干果和巧克力等食品中均含有多種生物胺。過(guò)量的生物胺被證明對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生一些不良的生理反應(yīng)，在食品保藏學(xué)中，生物胺往往是在食品腐爛或發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生；食物中毒的發(fā)作和某些毒理學(xué)特性與組胺和酪胺有密切聯(lián)系。美國(guó)FDA通過(guò)對(duì)爆發(fā)組胺中毒大量數(shù)據(jù)的研究，確定組胺的危害作用水平為:500mg/kg食品。歐美及我國(guó)已經(jīng)對(duì)部分食品中組胺含量做了限量要求，美國(guó)FDA要求進(jìn)口水產(chǎn)品組胺不得超過(guò)50mg/kg;歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺含量不得超過(guò)100mg/kg;其它食品中組胺不得超過(guò)100mg/kg，酪胺不得超過(guò)10(T800 mg/kg。其它胺類的控制也逐步提上議事日程，我國(guó)2008年出臺(tái)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于食品中生物胺的限量提出了要求，主要涉及色胺、￠-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺，液體樣本中一般要求小于10U g/kg,固體樣本中一般要求小于50 u g/kg。目前食品中生物胺的檢測(cè)一般采用高效液相色譜(HPLC)，毛細(xì)管電泳(CE)，生物傳感器等方法。這些方法均有一定的應(yīng)用，也各有優(yōu)缺點(diǎn)；如最常用的RP-HPLC法，一般認(rèn)為其具有檢測(cè)靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確和柱效高等優(yōu)點(diǎn)，且有多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法基于該技術(shù)實(shí)施；但是該方法需要高效液相色譜 ，且儀器預(yù)熱平衡和分析等過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，速度較慢，靈活性較差。CE因無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，且具有靈敏度較高、分離速度快、成本較低、無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)；但是相對(duì)而言對(duì)于一些中性物質(zhì)較難分離，且檢測(cè)限相對(duì)較高。生物傳感器由于其具有在線監(jiān)測(cè)的能力被推崇，但是現(xiàn)有技術(shù)仍不是非常成熟，市場(chǎng)較少有可靠的成套裝備，且價(jià)格較昂貴。因此在食品加工和流通等環(huán)節(jié)迫切需要一種無(wú)需昂貴的分析儀器，費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)便、快捷，檢測(cè)限能夠達(dá)到ng級(jí)別，能夠滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要的方法，切實(shí)保障食品安全。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種快速測(cè)定食品中生物胺的方法，本發(fā)明設(shè)計(jì)巧妙、易操作、成本低、速度快、適于大規(guī)模應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案:一種快速測(cè)定食品中生物胺的方法，包括以下步驟:
(I)食品樣品中生物胺的提取:取2-50g食品樣品，用水、酸性或有機(jī)相介質(zhì)中提取食品樣品中生物胺，提取兩次；最終用5%的三氯乙酸稀釋至IOOmL ；
酸性介質(zhì)選用HC1、HC104、TCA中的一種，酸性介質(zhì)的濃度在0.lmol/L-lmol/L ;有機(jī)相介質(zhì)選用甲醇、丙酮、乙腈-高氯酸、二氯甲烷-高氯酸中的一種或幾種復(fù)合；
根據(jù)不同的樣品采取不同的介質(zhì)提取，針對(duì)奶制品和豆制品較佳的采用0.1mol/L-lmol/L的鹽酸提取或采用乙腈-高氯酸提??；針對(duì)肉類、水產(chǎn)等較佳的采用0.1mol/L-lmol/L高氯酸或三氯乙酸提取，也可采用二氯甲烷一高氯酸提?。蛔罱K用5%的三氯乙酸稀釋至lOOmL。
(2)生物胺提取液的凈化，首先用等比例的正己烷萃取脫去脂肪，然后進(jìn)行液-液萃?。换静襟E:樣品液或樣品提取液先用鹽飽和，較佳的采用NaCl、Na2C03、Na2SO4中的一種或幾種，然后調(diào)PH至堿性。最后用有機(jī)溶劑萃取，較佳的有機(jī)溶劑指的是正丁醇、氯仿、異丁醇、異戊醇和乙醚中的一種或幾種。最后氮?dú)獯蹈刹⒓尤?.lmol/L的鹽酸溶解殘留物。有機(jī)溶劑的選擇和配比必需按照產(chǎn)品的特性進(jìn)行。( 3 )生物胺提取液衍生化:將凈化后的提取液用衍生劑進(jìn)行衍生以利于紫外檢測(cè)，將衍生劑加入到ImL凈化后的提取液中，衍生劑與提取液的體積比在1: 20— 1: 3之間，然后在40-70°C下反應(yīng)30min，然后加入2ml超純水，40°C氮?dú)獬ヅ渲蒲苌鷦┧鶐氲谋＜尤?ml乙醚進(jìn)行萃取，獲得的有機(jī)相用氮?dú)獯蹈桑尤隝mL甲醇，過(guò)濾后待用。較佳的衍生劑為丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、苯甲酰氯、9-芴基甲基-氯甲酸酯和苯基異硫氰酸鹽中的一種；
(4)展開(kāi)劑的優(yōu)化和薄層層析分析:將待測(cè)液點(diǎn)在表面涂有0.25mm厚硅膠板上；采用二次展開(kāi)技術(shù)，兩種展開(kāi)系統(tǒng)，所述兩種不同展開(kāi)系統(tǒng)，第一種是氯仿-苯-三乙胺、氯仿_乙醚_ 二乙胺，氯仿_ 二乙胺中的一種；第二種系統(tǒng)是苯_丙酮_ 二乙胺、氯仿_ 二乙胺、乙醚-丙酮-三乙胺中的一種；
展開(kāi)顯色應(yīng)當(dāng)遵循薄層層析一般操作程序，顯色采用碘蒸汽或噴霧顯色；也可不顯色。顯色后于360nm紫外條件下對(duì)色譜板進(jìn)行觀察，以確定樣品中是否存在目標(biāo)生物胺。然后，采用島津色譜掃描儀在254nm條件下對(duì)色譜板進(jìn)行掃描，根據(jù)每個(gè)斑點(diǎn)的吸光值進(jìn)行定量計(jì)算。所述的及涉及的化學(xué)品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)當(dāng)滿足GB/T 5009.208-2008標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的有益效果:
相較而言薄層色譜(TLC)是一種簡(jiǎn)便、快速的分析方法。該方法應(yīng)用于測(cè)定魚類、肉類和奶酪樣品中生物胺含量的前期篩選簡(jiǎn)便快捷。與其它分析方法相比，TLC法無(wú)需昂貴的分析儀器，費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)便、快捷，可對(duì)食品中生物胺的定性與半定量測(cè)定，檢測(cè)限能夠達(dá)到ng級(jí)別，方便可靠，完全能夠滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，可有效降低監(jiān)控成本，提高我國(guó)食品中生物胺的監(jiān)測(cè)水平，保障人民群眾的身體健康。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
鯡魚50g用攪拌器打碎，并用5%的三氯醋酸(TCA)提取生物胺，然后4000g離心5min，取上清并定容至IOOmL提取液。取IOmL提取液加入到IOmL正己烷中，振蕩5min除去油脂，重復(fù)兩次；棄去有機(jī)相加入5mL飽和NaCl溶液，調(diào)pH值至11，加入5mL正丁醇-氯仿(1:1)萃取，振蕩51^11，4000 g離心lOmin，吸取上層有機(jī)相，重復(fù)三次，合并萃取液，40°C下氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL、l mol/L鹽酸制得凈化液。
實(shí)施例2
奶酪50g用攪拌器打碎,并用0.5mol/L的鹽酸提取生物胺,然后4000g離心5min,取上清并定容至IOOmL提取液。取IOmL提取液加入到IOmL正己烷中，振蕩5min除去油脂，重復(fù)兩次；棄去有機(jī)相加入5mL飽和Na2SO4溶液，調(diào)pH值至11，加入5mL乙醚萃取，振蕩5min，4000 g離心lOmin，吸取上層有機(jī)相，重復(fù)三次，合并萃取液，40°C下氮?dú)獯蹈?，加?.0mL,I mol/L鹽酸制得凈化液。實(shí)施例3
國(guó)產(chǎn)葡萄酒5mL，15°C超聲波30min處理，加0.5mol/L的高氯酸定容到50mL ;取IOmL提取液加入到IOmL正己烷中，振蕩5min除去油脂，重復(fù)兩次；棄去有機(jī)相加入5mL飽和Na2CO3溶液，調(diào)pH值至11，加入5mL異戊醇萃 取，振蕩5min，4000 g離心lOmin，吸取上層有機(jī)相，重復(fù)三次，合并萃取液，40°C下氮?dú)獯蹈?，加入l.0mLU mol/L鹽酸制得凈化液。實(shí)施例4
將制得的凈化液0.5mL加入1.5mL碳酸氫鈉溶液，1.0mL丹磺酰氯衍生液(0.lmol/L),混勻40°C下反應(yīng)30min，取出加入100 y L的50 g/L飽和碳酸氫鈉溶液，振蕩混勻，保溫15min,加入ImL超純水。加入3mL乙醚振蕩2min,吸取有機(jī)相,重復(fù)萃取兩次,合并乙醚萃取液，氮?dú)獯蹈伞＜尤?.0mL甲醇使殘留物溶解，振蕩混勻，0.22 過(guò)濾待用。實(shí)施例5
制備混標(biāo)，含有八種胺，分別為色胺、腐胺、尸胺、亞精胺、組胺、精胺、酪胺和￠-苯乙
胺，濃度梯度為(0.50 mg/L, 1.00 mg/L, 2.50 mg/L, 5.00 mg/L, 10.0 mg/L, 15.0 mg/L,
25.0mg/L,50.0 mg/L)。取10 y L樣液點(diǎn)在30 X 30cm表面涂有0.25mm厚硅膠板上，吹干
后，用氯仿-苯-三乙胺(6:4:1)，展開(kāi)15cm后，第二種系統(tǒng)是苯-丙酮-三乙胺(6:4:1)
中的一種，再展開(kāi)15cm ;室溫下干燥20min再用吹風(fēng)機(jī)吹干；360nm下定性檢測(cè),在島津色
譜掃描儀254nm下檢測(cè)并半定量。所得到的混標(biāo)的線性方程如表I所示:
表I混標(biāo)的線性方程
權(quán)利要求
1.一種快速測(cè)定食品中生物胺的方法，其特征在于步驟為: (1)食品樣品中生物胺的提取:取2-50g食品樣品，用水、酸性或有機(jī)相介質(zhì)提取食品樣品中生物胺，提取兩次，最終用5%的三氯乙酸稀釋至IOOmL ； 酸性介質(zhì)選用HC1、HC104、TCA中的一種，酸性介質(zhì)的濃度在0.lmol/L-lmol/L ;有機(jī)相介質(zhì)選用甲醇、丙酮、乙腈-高氯酸、二氯甲烷-高氯酸中的一種或幾種復(fù)合； (2)生物胺提取液凈化:首先用與提取液等比例的正己烷萃取脫去脂肪，然后進(jìn)行液-液萃??；基本步驟:樣品液或樣品提取液先用鹽飽和，然后調(diào)pH至堿性，最后用有機(jī)溶劑萃取，氮?dú)獯蹈刹⒓尤?.lmol/L的鹽酸溶解殘留物； 所述的飽和鹽選用NaCl、Na2C03、Na2S04中的一種；有機(jī)溶劑選用正丁醇、氯仿、異丁醇、異戊醇、乙醚中的一種或幾種的復(fù)合，有機(jī)溶劑的選擇和配比必需按照產(chǎn)品的特性進(jìn)行； (3)生物胺提取液衍生化:將凈化后的提取液用衍生劑進(jìn)行衍生以利于紫外檢測(cè)，將衍生劑加入到ImL凈化后的提取液中，衍生劑與提取液的體積比在1: 20 — I: 3之間，在40-70°C下反應(yīng)30min，然后加入2mL超純水，40°C氮?dú)獬ヅ渲蒲苌鷦┧鶐氲谋尤?mL乙醚進(jìn)行萃取，獲得的有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，加入ImL甲醇，過(guò)濾后待用； 所述衍生劑選用丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、苯甲酰氯、9-芴基甲基-氯甲酸酯、苯基異硫氰酸鹽中的一種； (4)展開(kāi)劑的優(yōu)化和薄層層析分析:將待測(cè)液點(diǎn)在表面涂有0.25mm厚硅膠板上；采用二次展開(kāi)技術(shù)，兩種展開(kāi)系統(tǒng)， 所述兩種不同展開(kāi)系統(tǒng)，第一種是氯仿-苯-三乙胺、氯仿-乙醚-三乙胺、氯仿-三乙胺中的一種；第二種系統(tǒng)是苯-丙酮-三乙胺、氯仿-三乙胺、乙醚-丙酮-三乙胺中的一種；展開(kāi)顯色應(yīng)當(dāng)遵循薄層層析一般操作程序，顯色采用碘蒸汽或噴霧顯色；也可不顯色； 顯色后于360nm紫外條件下對(duì)色譜板進(jìn)行觀察，以確定樣品中是否存在目標(biāo)生物胺；然后，采用島津色譜掃描儀在254nm條件下對(duì)色譜板進(jìn)行掃描，根據(jù)每個(gè)斑點(diǎn)的吸光值進(jìn)行定量計(jì)算； 所述的涉及的化學(xué)品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)當(dāng)滿足GB/T 5009.208-2008標(biāo)準(zhǔn)。
全文摘要
一種快速測(cè)定食品中生物胺的方法，屬于食品分析和安全技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括以下步驟(1)食品樣品中生物胺的提取；(2)生物胺提取液凈化；(3)生物胺提取液衍生化；(4)展開(kāi)劑的優(yōu)化和薄層層析分析。本發(fā)明所提供快速測(cè)定食品中生物胺的方法，可用于魚類、肉類、奶酪、酒類和醋類等產(chǎn)品中生物胺含量的快速測(cè)定。與其它分析方法相比，本方法無(wú)需昂貴的分析儀器，費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)便、快捷，能有效降低食品生產(chǎn)流通中的監(jiān)控成本。
文檔編號(hào)G01N30/90GK103149317SQ20121056105
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者夏小樂(lè), 張斌, 張無(wú)疾, 夏梅芳, 王武 申請(qǐng)人:江南大學(xué), 南通白蒲黃酒有限公司