專利名稱：基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法
基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明提供一種基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，屬于生 物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥是用來防治農(nóng)業(yè)病蟲害和調(diào)節(jié)農(nóng)作物生長(zhǎng)的化學(xué)生物藥劑。農(nóng)藥在世界農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)中有著不可替代的作用。但同時(shí)，由于農(nóng)藥的不合理使用所引起的農(nóng)藥污染及其產(chǎn)生 的危害后果是嚴(yán)重的，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重威脅了人類的飲食安全。為了保護(hù)消費(fèi) 者的安全和健康，提高我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全，增強(qiáng)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題越 來越受到關(guān)注，尤其是蔬菜中農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。為了從源頭上阻止 不合格的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)，我國(guó)政府開始大力發(fā)展農(nóng)藥的各種檢測(cè)技術(shù)，加強(qiáng)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn) 地的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。由于我國(guó)生產(chǎn)和使用的殺蟲劑絕大多數(shù)品種為有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng) 藥，所以農(nóng)藥殘留檢測(cè)的重點(diǎn)也在有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥上。
目前，對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法主要是氣相色譜、液相色譜、薄層色譜、高效液相色 譜及與質(zhì)樸分析法結(jié)合等。這些方法雖然分析精度高，定量準(zhǔn)確，也是國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢 測(cè)方法。但是這些方法大多需要對(duì)被分析樣品進(jìn)行前處理，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)久且費(fèi)用昂貴， 需要熟練的專業(yè)技術(shù)人員，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)樣品的要求。我國(guó)農(nóng)藥殘留的速測(cè)方法 是酶抑制試紙法和酶抑制分光光度法(農(nóng)殘快速檢測(cè)儀)，可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥及氨基甲酸 酯類農(nóng)藥的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有較好的實(shí)用性。速測(cè)卡是通過肉眼觀察卡片的顏色變化，因 此一般只能用于定性測(cè)量嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜樣品。酶抑制分光光度法也有比較廣泛的應(yīng)用， 國(guó)內(nèi)已有多種基于此原理的農(nóng)藥殘留速測(cè)儀。分光光度法是基于吸光度值的變化進(jìn)行檢測(cè) 的，但蔬菜水果含有的大量色素會(huì)對(duì)吸光度值造成很大影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。并且 上述方法存在回收率低，錯(cuò)檢、漏檢比例較高，重復(fù)性差，難以滿足低殘留和定量檢測(cè)的要 求等。
發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷，而且操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)時(shí)間短、價(jià)格低 廉、靈敏度高的檢測(cè)農(nóng)藥殘留的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法。
其技術(shù)方案為基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，其特征 在于乙酰膽堿酯酶生物傳感器的組裝過程為將多壁碳(MWNTs)與石墨烯(GR)用聚二烯 丙基二甲基氯化銨(PDDA)溶解，形成TODA-MWCNTs-GR復(fù)合物，將此復(fù)合物滴涂到玻碳電極 (GCE)上，然后滴涂乙酰膽堿酯酶(AChE)，得到AChE/PDDA-MWCNTs-GR/GCE傳感器。
所述的基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，其特征在于玻 碳電極(d=3mm)的清洗，乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髅舾薪缑娴臉?gòu)建及其過程表征，乙酰膽堿酯 酶?jìng)鞲衅鞴ぷ髑€的建立，乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅餍阅艿臋z測(cè)，乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鲗?duì)實(shí)際 樣品的檢測(cè)。
所述的基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，其特征在 于所制備的電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鞯墓ぷ髑€為西維因農(nóng)藥的濃度在O. 5 -50 ng/mL 時(shí)，1% = O. 313c+20. 228 ;西維因農(nóng)藥的濃度在 50 - 3000 ng/mL 時(shí)，1% =O.0128C+36. 185。乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅餍阅軝z測(cè)包括準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、可再生性，以及乙酰 膽堿酯酶?jìng)鞲衅鲗?duì)蔬菜樣品回收率的測(cè)定。
其制備原理為由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥與乙酰膽堿酯酶具有較高的特異性結(jié)合， 因此常用乙酰膽堿酯酶作為檢測(cè)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分子識(shí)別元件。乙酰膽堿酯酶生物傳 感器是將乙酰膽堿酯酶固定在電極表面，酶催化底物乙酰膽堿水解生成膽堿和乙酸。農(nóng)藥 在結(jié)構(gòu)上與底物乙酰膽堿有些類似，它可以和乙酰膽堿的活性中心有效結(jié)合，抑制乙酰膽 堿酯酶的活性。膽堿是一種電活性物質(zhì)，能在一定電位下發(fā)生氧化反應(yīng)，通過伏安掃描過程 中硫代膽堿氧化峰的大小可以測(cè)定農(nóng)藥殘留的濃度。通過比較有無農(nóng)藥時(shí)酶促反應(yīng)電流信 號(hào)的變化得到農(nóng)藥對(duì)酶的抑制率，該抑制率與農(nóng)藥的濃度成對(duì)應(yīng)關(guān)系，便可測(cè)得有機(jī)磷或 氨基甲酸酯類農(nóng)藥的含量。
本發(fā)明采用多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物對(duì)玻碳電極進(jìn)行修 飾，與傳統(tǒng)的方法相比，由于多壁碳和石墨烯具有良好的導(dǎo)電性、電化學(xué)穩(wěn)定性和生物兼容 性，一直被廣泛應(yīng)用于生物傳感器，但它們的溶解性差，在普通試劑如殼聚糖、二甲基甲酰 胺等溶劑中的溶解度均不理想，通過用聚二烯丙基二甲基氯化銨來溶解多壁碳和石墨烯， 顯著提高了它們的溶解性。且將多壁碳和石墨烯混合后，因?yàn)橄嗷ラg的作用力，降低了各自 溶解時(shí)的聚合、沉降作用，進(jìn)一步促進(jìn)了它們的溶解性。將玻碳電極用上述復(fù)合物修飾后制 成的酶?jìng)鞲衅?，檢測(cè)農(nóng)藥的精度更高，范圍更廣，檢測(cè)限更低，可實(shí)現(xiàn)小型、便捷、適用于現(xiàn) 場(chǎng)檢測(cè)的目的。采用本發(fā)明制成的電流型乙酰膽堿酯酶生物傳感器可以在蔬果采收、上市 前，進(jìn)行農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定，直接對(duì)農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)進(jìn)行定量檢測(cè)，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn) 與消費(fèi)提供農(nóng)藥殘留檢測(cè)的技術(shù)支撐。
為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生 物傳感器制備方法，其特征在于(I)電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髦苽淝安Ｌ茧姌O的清洗， 活化和性能測(cè)試，當(dāng)測(cè)試循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在80 mV以下，并盡可能接近64 mV 時(shí)，所述玻碳電極可以使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求。(2)配置多壁 碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物，在清洗干凈的玻碳電極上滴涂此復(fù)合物，室 溫下自然晾干后，用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，滴涂乙酰膽堿酯酶，2h后用磷酸鹽緩沖溶 液沖洗干凈，電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髦苽浣Y(jié)束，放入冰箱里4 V條件下保存?zhèn)溆谩?br> 為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生 物傳感器制備方法，其特征在于(I)配置一系列的西維因標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行差分脈沖伏安掃 描，求出抑制率，進(jìn)一步得到上述制備的電流型乙酰膽堿酯酶生物傳感器的工作曲線、檢測(cè) 范圍和檢測(cè)限；(2)將農(nóng)藥抑制后的電極浸入解磷定溶液中12 min，測(cè)得乙酰膽堿酯酶生 物傳感器的再生性能；(3)對(duì)乙酰膽堿酯酶生物傳感器的精確度和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)；(4) 對(duì)實(shí)際果蔬樣品進(jìn)行分析得出該傳感器的回收率和重現(xiàn)性。
本發(fā)明通過制備多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物，充分利用了 多壁碳和石墨烯獨(dú)特的理化性質(zhì)，包括高的比表面積，優(yōu)異的電導(dǎo)率，極高的機(jī)械強(qiáng)度，良 好的吸附能力和優(yōu)良的生物相容性。利用聚二烯丙基二甲基氯化銨溶解多壁碳-石墨烯復(fù) 合物，有效提高了二者在溶液中的溶解度。且多壁碳和石墨烯混合后，它們之間的相互作用 力降低了二者的聚合、沉降作用，進(jìn)一步提高了它們的溶解性。多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物能夠改善電極表面的微環(huán)境，促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)中電子的傳遞，提高電極上的電流響應(yīng)，因此可作為載體材料修飾電極，用來制備較高靈敏度的電化學(xué)生物傳感器；通過羧基化的多壁碳中的羧基與乙酰膽堿酯酶中的氨基反應(yīng)，形成酰胺鍵，將乙酰膽堿酯酶固定在電極表面，提高了生物傳感器的穩(wěn)定性。
所述基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備工藝如下(I)將7μ L 多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物滴涂在預(yù)處理好的玻碳電極上，在室溫下晾干后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗未固定上的復(fù)合物，而后用氮?dú)庑⌒拇蹈桑?2)取5 yL 乙酰膽堿酯酶溶液滴涂在上述修飾有復(fù)合膜的電極上，常溫下放置2 h，然后用PH=7. O的磷酸鹽緩沖溶液沖洗表面，而后用氮?dú)獯蹈?，乙酰膽堿酯酶生物傳感器制作完成，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br> 具體實(shí)施方式
實(shí)施方式(1)多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物的制備首先將2 mg多壁碳和石墨烯的混合物(多壁碳石墨烯=3:1)溶解于4 mL濃度為O. 25%含有O.5M NaCl的聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液中超聲溶解30 min。接著將上述溶液在14000 rpm下用去離子水離心分離清洗3次。最后，將上述溶液配制成濃度為I mg/mL的溶液，每次使用前超聲5 min，即得到多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物。(2)玻碳電極的清洗玻碳電極修飾前，首先浸入“piranha”溶液(H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡 15 min，用水清洗干凈，接下來用0.3 μπι、30 nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，放入超聲水浴中清洗，每次5 min，重復(fù)二次，然后依次用6 mo I/L的HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，氮?dú)庑⌒拇蹈桑?3)玻碳電極的活化徹底清洗后，電極在0.5 mol/L H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法于范圍1. OV -1. OV下掃描活化，直至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。(4) 預(yù)處理好的玻碳電極的測(cè)試在含有O.1 mol/L KCl的lX10_3mol/L K3Fe (CN)6溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描速度50 mV/s，掃描范圍為-0.1 V 0.6 V;當(dāng)所述循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在80 mV以下，并盡可能接近64 mV時(shí)，所述玻碳電極可以使用，否則要重新返回步驟(2)中，預(yù)處理玻碳電極，直至符合要求；(5)將7yL多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物滴涂在預(yù)處理好的玻碳電極上，在室溫下晾干后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗未固定上的復(fù)合物，而后用氮?dú)庑⌒拇蹈桑?6)取5 yL乙酰膽堿酯酶溶液滴涂在上述修飾有復(fù)合膜的電極上，常溫下放置2 h，然后用PH = 7. O的磷酸鹽緩沖溶液沖洗表面，而后用氮?dú)獯蹈?，乙酰膽堿酯酶生物傳感器制作完成，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?7)將上述制備好的乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髟诤蠭禮的氯化硫代乙酰膽堿且pH = 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中以50 mV/s掃描速度進(jìn)行差分脈沖伏安法測(cè)試，電位窗口為O. 3 V^l.O V ； (8) 配置O.1 ng/mL - 4000 ng/mL的西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液，農(nóng)藥測(cè)量時(shí)，將上述乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鹘氲讲煌瑵舛鹊霓r(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中12 min，然后在含有I mM氯化硫代乙酰膽堿(ATCl) 的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安掃描，抑制率I可由下式求得其中iP，和iP，分別為測(cè)試電極未經(jīng)過農(nóng)藥抑制和經(jīng)過農(nóng)藥抑制后，在氯化硫代乙酰膽堿溶液中的峰電流，根據(jù)農(nóng)藥濃度與抑制率之間呈一定的線性關(guān)系，做出工作曲線圖，得到農(nóng)藥濃度與抑制率之間的線性關(guān)系，以及檢測(cè)限。(9)乙酰膽堿酯酶生物傳感器的精確性是通過組內(nèi)偏差和組間偏差實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究的。同一支電極進(jìn)行五次重復(fù)測(cè)定 獲得組內(nèi)變異系數(shù)，為4. 7%;用五支經(jīng)過相同修飾的電極進(jìn)行測(cè)定獲得組間變異系數(shù)，為 4.1%。當(dāng)電極不用時(shí)保存在4 °C冰箱中，根據(jù)7天和30天后電流響應(yīng)的變化得到此傳 感器的穩(wěn)定性，7天之后電流響應(yīng)值沒有明顯變化，30天之后降為原電流值的87%。(12) 將農(nóng)藥抑制后的傳感器浸在5.0 mM的碘解磷定溶液中12 min，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗 干凈，在I mMATCl的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，以檢測(cè)其再生能力，電流響應(yīng) 值能恢復(fù)到原電流值的93%。(13)把蔬菜徹底清洗干凈并用去離子水清洗3次，噴灑上 一定濃度的農(nóng)藥，放置24 h后，用10 mL丙酮/0.1 M pH 7. O磷酸鹽緩沖溶液(1/9，v/ V)做溶劑超聲處理15 min，然后再進(jìn)行離心處理(10 min, 10000 rpm)，得到的上清液用 來檢測(cè)實(shí)際樣品的回收率，其回收率可以達(dá)到92.3% -107%。
此種電流型乙酰膽堿酯酶生物傳感器檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法操作簡(jiǎn)單，便于掌握， 且檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)限低，檢測(cè)農(nóng)藥范圍廣，穩(wěn)定性好，靈敏度高，再生能力好以及對(duì)實(shí)際樣 品分析有較高的回收率和重現(xiàn)性，符合我國(guó)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展和國(guó)際化要求。
權(quán)利要求
1.基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，其特征在于多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合納米材料的制備首先將2 mg多壁碳和石墨烯的混合物(多壁碳石墨烯=3:1)溶解于4 mL濃度為O. 25%含有O. 5M NaCl的聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液中超聲溶解30 min,接著將上述溶液在14000 rpm下用去離子水離心分離清洗3次，最后，將上述溶液配制成濃度為I mg/mL的溶液，每次使用前超聲5 min，即得到多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合納米材料。
2.如權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，其特征在于用多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合納米材料修飾玻碳電極，將7 μ L多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合物滴涂在預(yù)處理好的玻碳電極上，在室溫下晾干后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗未固定上的復(fù)合物，而后用氮?dú)庑⌒拇蹈伞?br> 3.如權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，其特征在于乙酰膽堿酯酶固定與上述復(fù)合納米材料修飾的玻碳電極上，取5 UL乙酰膽堿酯酶溶液滴涂在上述修飾有復(fù)合膜的電極上，常溫下放置2 h，然后用PH = 7. O的磷酸鹽緩沖溶液沖洗表面，而后用氮?dú)獯蹈?，乙酰膽堿酯酶生物傳感器制作完成，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br> 4.如權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，其特征在于乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髅舾薪缑娴臉?gòu)建及其過程表征，乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鞴ぷ髑€的建立，乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅餍阅艿臋z測(cè)，乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鲗?duì)實(shí)際果蔬樣品的檢測(cè)，所制備的電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鞯墓ぷ髑€為當(dāng)西維因濃度為O. 5到50 ng/mL時(shí)，其線性方程為1% = O. 313c+20. 228 ;濃度為50到3000 ng/mL時(shí)，其線性方程為1% =O. 0128C+36. 185，所制備的電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鲗?duì)西維因農(nóng)藥的檢測(cè)限為O. 23 ng/mL,乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鞯男阅軝z測(cè)包括準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和再生能力，以及乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鲗?duì)實(shí)際果蔬樣品回收率的測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備方法，其特征在于多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨復(fù)合納米材料的制備，進(jìn)而制備了基于復(fù)合納米材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器。多壁碳和石墨烯具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，但其難溶于一般溶劑，通過本方法可明顯提高多壁碳和石墨烯在溶液中的溶解度。制備的復(fù)合納米材料多壁碳-石墨烯-聚二烯丙基二甲基氯化銨能夠明顯改善電極表面的微環(huán)境，提高電極表面的電流響應(yīng)，作為載體材料修飾電極，可制備較高靈敏度的電化學(xué)生物傳感器。本方法制備的電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)時(shí)間短，穩(wěn)定性好，靈敏度高，再生能力好，并可用于實(shí)際果蔬樣品有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/327GK103033548SQ20121058892
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者孫霞, 鞏智利, 王相友, 劉君峰, 曹瑤瑤 申請(qǐng)人:山東理工大學(xué)