專利名稱：一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥在控制農(nóng)作物病蟲害，保障農(nóng)產(chǎn)品穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)方面起到至關(guān)重要的作用，但是，農(nóng)藥的不合理使用，不僅造成了水環(huán)境、土壤、大氣的污染，也導致了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標，引起人體中毒以及貿(mào)易壁壘。當前，我國生產(chǎn)和使用的殺蟲劑絕大多數(shù)品種為有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，其中毒死蜱的生產(chǎn)使用逐漸增加，毒死蜱在人體中主要分布于肝臟、腎臟、脾臟等血流量較高的器官。它可以抑制膽堿酯酶活性，對人體有致畸作用，甚而對人體的中樞神經(jīng)產(chǎn)生影響。因此，建立一種快速、靈敏、安全可靠的毒死蜱農(nóng)藥 殘留的檢測方法迫在眉睫。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測主要有光譜法(紅外光譜法、熒光光譜法、紫外-可見光、化學發(fā)光法等)、色譜法(氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、高效液相色譜(HPLC))、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)，液-質(zhì)聯(lián)用(^-1^)、酶聯(lián)免疫化1^34)等。雖然這些方法的選擇性好、靈敏度高和準確度高，同時檢測多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品的前處理過程繁瑣、費時，并且對分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于現(xiàn)場快速檢測。因此，人們迫切需要快速、可靠、經(jīng)濟和適合于現(xiàn)場應用的快速檢測方法。于是，廉價、快速、可信、敏感的生物傳感器應運而生。與傳統(tǒng)的分析方法相比，生物傳感器具有如下特點(1)較高的選擇性，因此不需要對被測組分進行分離，即不用對樣品進行預處理。(2)結(jié)構(gòu)簡單，體積小，使用方便，特別是便攜式的生物傳感器，非常有利于食品質(zhì)量的市場快速評價。(3)可實現(xiàn)連續(xù)在線檢測，使食品加工過程的質(zhì)量控制變得簡便。(4)響應速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，生物傳感器制作成本低，且可反復使用。因此本文嘗試制備一種毒死蜱殘留的免疫傳感器。發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述方法的缺陷、且操作簡單、靈敏度高，選擇性好的毒死蜱農(nóng)藥殘留檢測的免疫傳感器制備方法。其技術(shù)方案為一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于制備出一種新型的納米復合物多壁碳-硫堇-殼聚糖，從而增大電極表面的電流信號，加大檢測范圍，降低免疫傳感器的檢測限。所述的一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于多壁碳納米管具有的良好的化學穩(wěn)定性，導電性和極高的機械強度；殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳納米管在溶液里的溶解性，解決了多壁碳納米管難溶解的問題；硫堇作為一種電子傳遞的媒介，可以很大程度上提高電子的傳輸，進一步增強了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物的導電性。所述的一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于實驗條件的優(yōu)化，主要包括免疫傳感器的修飾及表征過程，有關(guān)實驗參數(shù)的優(yōu)化(納米復合物中硫堇的濃度、測試底液的pH、孵育時間等);所制備出電流型免疫傳感器的工作曲線；免疫傳感器性能檢測包括重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、特異性、再生性以及免疫傳感器對蔬菜樣品加標回收率的測定。所制備的免疫傳感器的工作曲線為y = 9.5771 IgC (ng/mL) + 16. 220，(R2=O. 9964)，其檢測限為O. 046ng/mL ;免疫傳感器性能檢測包括特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、再生性以及免疫傳感器對多種果蔬樣品回收率的測定。其制備原理為本發(fā)明利用功能化的多壁碳納米管，具有羧基(-C00H)，可以提供大的外部表面面積，且可以促進電子轉(zhuǎn)移；殼聚糖富含氨基(-NH2),是多壁碳納米管很好的分散劑，具有較高的成膜性及生物相容性；硫堇作為電子傳遞的媒介，具有大量的氨基(-NH2),將三種物質(zhì)按一定比例混合，從而制備出多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物；而作為交聯(lián)劑的戊二醛可以與氨基(-NH2)結(jié)合，因此可以將多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物中殼聚糖、硫堇與毒死蜱抗體連接；用牛血清蛋白(BSA)封閉抗體上的非特異性結(jié)合位點后即可制備得到一種新型的、便捷的免疫傳感器。為達到以上目的，采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感 器制備方法，其特征在于(I)基于新型納米材料多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物，增大電流相應；(2)通過戍二醒將多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物中硫堇、殼聚糖與抗體中所含的氨基(-NH2)很好地結(jié)合，從而實現(xiàn)抗體的固定。本發(fā)明制備了新型納米材料多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物，利用多壁碳納米管具有的良好的化學穩(wěn)定性，導電性和極高的機械強度，廣泛用于電極的表面修飾，然而其溶解性很差，進而需要尋找一種良好的分散劑。殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳在溶液里的溶解性，從而解決多壁碳的難溶解的問題。另外，硫堇作為一種電子傳遞的媒介，可以很大程度上提高電子的傳輸，進而加強了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物的導電性。而戊二醛，作為交聯(lián)劑，可以很好地結(jié)合多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物中硫堇、殼聚糖與抗體中所含的氨基(-NH2),進而制備成一種新型的免疫傳感器，該免疫傳感器檢測時間較短，靈敏度高，選擇性穩(wěn)定性好，再生能力強，回收率符合要求以及可以用于實際樣品的檢測。所述一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法的制備工藝如下(I)制備多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物；(2)將6 μ L多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物修飾到清洗好的裸玻碳電極修飾上，烘干；(3)修飾3μ L 2. 5%戊二醛，烘干；(4)修飾6μ L 200ng/mL毒死蜱抗體，4°C孵育12h ；(5)將上述制備好的電極最后浸入2. 5%的BSA溶液中室溫下靜置I h，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點，室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在
4°C條件下備用。
具體實施例方式實施例(1)多壁碳-硫堇-殼聚糖(MWCNTs-TH1-CS)納米復合物的制備將
O.5g殼聚糖溶于IOOmL 1.0%的醋酸溶液中，室溫下攪拌3h，配成O. 5% CS溶液，室溫下磁力攪拌lh，使殼聚糖完全溶解；稱取5. Omg多壁碳納米管，加入5. OmL上述得到的殼聚糖溶液中，在室溫下超聲分散，直至得到穩(wěn)定的黑色分散液(多壁碳-殼聚糖納米復合材料)；再將5. Omg硫堇加入多壁碳-殼聚糖納米復合材料中，再在室溫下超聲分散12h至硫堇完全溶解，最終得到了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物。(2)免疫傳感器的制備取6 μ L上述制備好的多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物滴涂在清洗好的玻碳電極(GCE)表面，晾干，然后用ρΗ=7. 5的硫酸鹽緩沖液(PBS)沖洗表面，晾干，該修飾電極記作MWCNTs-TH1-CS/GCE ;取 3 μ L 2. 5% 戊二醛(GA)溶液滴涂在 MWCNTs-TH1-CS/GCE 表面，孵育30min，然后用pH=7. 5的PBS緩沖液沖洗表面，晾干，記作GA/MWCNTs-THI_CS/GCE ;取6 μ L 200ng/mL 毒死蜱抗體(ant1-chlorpyrifos)溶液滴涂在 GA/MWCNTs-TH1-CS/GCE 上，4°C孵育12h，然后用ρΗ=7· 5的PBS緩沖液沖洗表面，晾干，記作ant1-chlorpyrifos/GA/MWCNTs-TH1-CS/GCE ;將上述組裝好的電極浸入2. 5%的BSA溶液中室溫下lh，以封閉抗體上的非特異性結(jié)合位點，室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在4°C條件下備用。(3)對所制備的免疫傳感器的復合物中硫堇的濃度、測試底液PH值、和孵育時間三方面實驗條件進行優(yōu)化硫堇的最佳濃度為1. Omg/mL, pH值的范圍為7. 5，孵育時間的范圍為25min。IGI配置O. 1-1. OX 105ng/mL的毒死蜱標準溶液，將上述制備好的免疫傳感器分別浸入不同濃度的毒死蜱標準溶液，在常溫下孵育25min，檢測免疫前后電流變化得到其工作曲線；
(4)選5根制備好的免疫傳感器測量毒死蜱農(nóng)藥殘留，檢測其重現(xiàn)性；將制備好的免疫傳感器保存24天之后，再去檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留量，從而檢測其穩(wěn)定性；將免疫傳感器在克百威、辛硫磷、西維因、3-羥基克百威等干擾物存在的情況下對200ng/mL的毒死蜱進行測試，以檢測其選擇性；將免疫后的傳感器用甘氨酸-HCl緩沖液(pH=2. 8)解離毒死蜱農(nóng)藥5min后再次免疫，檢測其再生能力；(5)將多種果蔬樣品清洗干凈，進行實際樣品加標回收率的測試。此種阻抗型免疫傳感器檢測農(nóng)藥毒死蜱殘留的檢測方法操作工藝簡單，檢測時間較短，靈敏度高，選擇性好，穩(wěn)定性高，再生能力好和回收率符合要求，符合我國農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)發(fā)展和國際化要求。
權(quán)利要求
1.一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于制備了多壁碳-硫堇-殼聚糖(MWCNTS-TH1-CS)納米復合材料，該傳感器的組裝過程為將多壁碳_硫堇_殼聚糖納米復合物滴涂到玻碳電極表面，然后用戊二醛交聯(lián)，再在抗體溶液中孵育12小時，用BSA封閉，進而制備出一種檢測毒死蜱農(nóng)藥的免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于多壁碳納米管具有良好的化學穩(wěn)定性、導電性和極高的機械強度；殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳納米管在溶液里的溶解性，解決了多壁碳納米管難溶解的問題 ，硫堇作為一種電子傳遞的媒介，通過鍵與多壁碳納米管形成很強的作用力，很大程度上提高了復合物中電子的傳輸，進一步增強了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物的導電性；而戊二醛又可以很好地交聯(lián)復合物里硫堇、殼聚糖與抗體中的氨基(-NH2)，因此，制備的免疫傳感器靈敏度高，穩(wěn)定性好。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于免疫傳感器的修飾及表征過程，有關(guān)實驗參數(shù)的優(yōu)化，所制備的免疫傳感器的工作曲線為毒死蜱濃度O. l-105ng/mL時，檢測毒死蜱農(nóng)藥的線性范圍為y = 9. 5771 IgC (ng/mL)+ 16. 220，檢測限為O. 046ng/mL，免疫傳感器性能檢測包括重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、特異性、再生性以及免疫傳感器對蔬菜樣品加標回收率的測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于制備了一種新型納米材料多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物多壁碳納米管具有的良好的化學穩(wěn)定性，導電性和極高的機械強度，然而其溶解性很差，需要尋找一種良好的分散劑；而殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳納米管在溶液里的溶解性；另外，硫堇作為一種電子傳遞的媒介，提高了電子的傳輸，進一步增強了多壁碳-硫堇-殼聚糖納米復合物的導電性；而作為交聯(lián)劑的戊二醛可以很好地結(jié)合硫堇、殼聚糖與抗體中所含的氨基(-NH2)，進而制備成一種新型的免疫傳感器。該免疫傳感器檢測時間較短，靈敏度高，選擇性穩(wěn)定性好，再生能力強，回收率符合要求。
文檔編號G01N33/544GK103018438SQ20121058902
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者孫霞, 曹瑤瑤, 王相友, 劉君峰, 鞏智利 申請人:山東理工大學