專利名稱：一種利用超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測多組分微囊藻毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水質(zhì)檢測領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種利用超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測多組分微囊藻毒素(以LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY為代表)的方法。
背景技術(shù)：
隨著環(huán)境污染和富營養(yǎng)化程度加劇，淡水流域中有害藻類水華尤其是藍藻水華頻繁發(fā)生，現(xiàn)已成為國內(nèi)外普遍關(guān)注的環(huán)境問題。許多藍藻能產(chǎn)生以微囊藻毒素(microcystin MC)為代表的毒素，目前已發(fā)現(xiàn)60多種異構(gòu)體，它是一類具有強烈促癌作用的肝毒素。MC是一類單環(huán)七肽物質(zhì)，一般結(jié)構(gòu)為環(huán)D-丙氨酸-L-X-赤-8-甲基-D異天冬氨酸-L-Y-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸。其中Adda為一種特殊的氨基酸，結(jié)構(gòu)為3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯-4，6-二烯酸，它是MCs生物活性表達所必需的，研究發(fā)現(xiàn)去除Adda后藻毒素的毒性降低。X、Y為兩個可變的氨基酸殘基，這兩個可變的L 一氨基酸的更替及其它氨基酸的去甲基化，衍生出眾多的毒素類型，至今已發(fā)現(xiàn)MCs有60多種異構(gòu)體，其中存在最普遍也是含量較多的是LR、RR、YR，其中L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸。由于環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，微囊藻毒素具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，加熱到300°C很長時間仍未能使之分解，而且盡管它們是多肽類物質(zhì)，但普通的蛋白質(zhì)水解酶對它們不起作用。微囊藻毒素在陽光下也較穩(wěn)定，但在藍藻色素存在的條件下或在微生物的作用下，光降解速度加快(《HJ478-2009水質(zhì)多環(huán)芳烴的測定高效液相色譜法》)。MCs極易溶于水，不易沉淀或被吸附于沉淀物和懸浮顆粒物中，可溶于甲醇或丙酮(《GB/T13198-1991水質(zhì)六種特定多環(huán)芳烴的測定高效液相色譜法》)，現(xiàn)行自來水處理工藝的混凝、沉淀、過濾、加氯均不能有效去除微囊藻。我國已有許多飲用水源發(fā)生藍藻水華并監(jiān)測出微囊藻毒素，尤其是出現(xiàn)了太湖大面積爆發(fā)藍藻水華引起某城市飲用水污染的嚴(yán)重事故，因此加強水質(zhì)的微囊藻毒素監(jiān)測就顯得尤為迫切，在美國微囊藻毒素已被列為微生物和有機污染物的檢測項目。目前微囊藻毒素的檢測技術(shù)主要有生物分析法、細胞毒性檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)等，而且陸續(xù)有新方法、新技術(shù)出現(xiàn)。這些方法技術(shù)由于原理不同而各有所長。國內(nèi)對微囊藻毒素有一定的研究，而且是一兩種單一組份，沒有多組份殘留分析。尤其對環(huán)境中的地表水中的多組份的殘留分析研究還沒有開展。因此建立環(huán)境中微囊藻毒素監(jiān)測的方法很有必要。高效液相色譜法(HPLC)是WHO、美英等發(fā)達國家和我國權(quán)威機構(gòu)推薦的MC檢測方法。該方法具有準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，能同時分析出不同的MC異構(gòu)體等優(yōu)點。但HPLC監(jiān)測技術(shù)往往需要標(biāo)準(zhǔn)毒素，而目前只發(fā)現(xiàn)60多種MC，多數(shù)缺乏標(biāo)準(zhǔn)毒素，這限制了 HPLC的進一步應(yīng)用。LC/MS技術(shù)很好地解決了這一問題，即使沒有標(biāo)準(zhǔn)毒素，只要知道這種毒素的分子量，就可對其進行定性，而且LC/MS技術(shù)亦可對毒素進行精確定量。

發(fā)明內(nèi)容
1.要解決的技術(shù)問題針對現(xiàn)有技術(shù)中多組分微囊藻毒素的檢測方法中存在的只能檢測一兩種單一組分且檢測精度不高的問題，本發(fā)明提供了一種利用超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測多組分微囊藻毒素的方法,它以多組分微囊藻毒素中的組分LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY為代表，同時分析水體中的該7種毒素，分析效率高且檢測結(jié)果準(zhǔn)確。2.技術(shù)方案本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。本發(fā)明的一種利用超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測多組分微囊藻毒素的方法，其步驟為:(I)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制(i )微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:精確稱量MC-LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY標(biāo)準(zhǔn)品中各IOOiI g，加入Iml甲醇，制成濃度均為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，_80°C保存；(ii)將微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋，配制濃度依次為0.1,1.0,2.0,5.0、10.0 u g/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)微囊藻毒素樣品的采集及前處理(i)采集一定體積的水樣，4°C冷藏保存；(ii)將上述水樣經(jīng)0.45 u m濾膜減壓過濾；(iii)濾液的pH值調(diào)節(jié)至4.0，過C18反相固相萃取柱，該C18反相固相萃取柱在使用前進行活化，活化劑為甲醇:三蒸水以1:1的體積比配制；將水樣以5 lOmL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮；(iv)上樣完畢后，用體積百分比為20%甲醇水溶液淋洗樣品，用氮氣吹干固相萃取柱后，以lmL/min，用體積為步驟(i )中的樣品體積的5%的甲醇將固相萃取柱中的微囊藻毒素洗脫，洗脫液收集于濃縮瓶內(nèi)，氮吹濃縮至步驟(i )中的樣品體積的0.5%定容，并經(jīng)針頭過濾器過濾保存，待檢測用；(3)在以下條件下進行檢測分析(i)離子源參數(shù)電噴霧:正離子毛細管電壓:2.50kV錐孔電壓:V (不同物質(zhì)該最優(yōu)值不同)萃取電壓:3V離子源溫度:150°C脫溶劑氣溫度:350°C脫溶劑氣流量:900L/hr錐孔反吹氣流量:20L/hr(ii)質(zhì)量分析器參數(shù)低端分辨率LF Lensl: 13.0V高端分辨率HM Lensl: 13.0V ；離子能量1:1.0V
入口透鏡電壓:-2V碰撞梯度:V (不同母離子和子離子不同)出口電壓:1.0V ;低端分辨率LF Lens2: 13.0V高端分辨率HM Lens2: 13.0V離子能量2:1.0V增益:1.0OV碰撞氣流量:0.13ml/min采用的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，參數(shù)設(shè)定如下:表IMC MRM方法參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種利用超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測多組分微囊藻毒素的方法，其步驟為: (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 G )微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:精確稱量MC-LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY標(biāo)準(zhǔn)品中各100呢，加入Iml甲醇，制成濃度均為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，_80°C保存； (ii)將微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋，配制濃度依次為0.1、1.0、2.0、5.0、10.0 u g/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)微囊藻毒素樣品的采集及前處理 G )采集一定體積的水樣，4°C冷藏保存； Gi)將上述水樣經(jīng)0.45 u m濾膜減壓過濾； (in )濾液的pH值調(diào)節(jié)至4.0,過C18反相固相萃取柱,該C18反相固相萃取柱在使用前進行活化，活化劑為甲醇:三蒸水以1:1的體積比配制；將水樣以5 10 mL /min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮； Gt )上樣完畢后，用體積百分比為20%甲醇 水溶液淋洗樣品，用氮氣吹干C18反相固相萃取柱后，以ImL /min，用體積為步驟C )中的樣品體積的5%的甲醇將固相萃取柱中的微囊藻毒素洗脫，洗脫液收集于濃縮瓶內(nèi) ，氮吹濃縮至步驟G )中的樣品體積的0.5%定容，并經(jīng)針頭過濾器過濾保存，待檢測用； (3)在以下條件下進行檢測分析 ()離子源參數(shù) 電噴霧:正離子 毛細管電壓:2.50kV 錐孔電壓:V 萃取電壓:3V 離子源溫度:150°C 脫溶劑氣溫度:350°C 脫溶劑氣流量:900L/hr 錐孔反吹氣流量:20 L/hr (H)質(zhì)量分析器參數(shù) 低端分辨率LF Lensl: 13.0V 高端分辨率HM Lensl: 13.0V 離子能量1:1.0V 入口透鏡電壓:-2V 碰撞梯度:V 出口電壓:1.0V; 低端分辨率LF Lens2: 13.0V 高端分辨率HM Lens2: 13.0V 離子能量2:1.0V增益:1.0OV 碰撞氣流量:0.13ml/min 釆用的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，參數(shù)設(shè)定如下: 表I MC MRM方法參數(shù)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測多組分微囊藻毒素的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的C18反相固相萃取柱采用的是BondElut C18反相固相萃取柱。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測多組分微囊藻毒素的方法，屬于水質(zhì)檢測領(lǐng)域。其步驟為(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；(2)微囊藻毒素樣品的采集及前處理；(3)在以下條件下進行檢測分析。本發(fā)明提供了一種利用超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測多組分微囊藻毒素的方法，它以多組分微囊藻毒素中的組分LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY為代表，同時分析水體中的該7種毒素，分析效率高且檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號G01N30/88GK103076420SQ20121058966
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者趙永剛, 唐松林, 張蓓蓓, 章勇 申請人:江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心