用于從樣品檢測細胞的方法
【專利摘要】一種用于從樣品檢測細胞的方法，包括以下步驟：（a）將液相的樣品或樣品的部分以流動的方向施加至多孔的一般二維載體，所述載體具有孔，所述孔在其表面具有至少一個特異于待檢測的細胞或這些細胞的片段的結(jié)合分子；（b）使待檢測的細胞或這些細胞的片段能夠從樣品或樣品部分進入所述多孔的一般二維載體的孔中，所述孔的平均孔徑使得待檢測的細胞或片段能夠進入孔中；（c）通過至少一個特異于待檢測的細胞或片段的結(jié)合分子留住待檢測的細胞或片段；（d）通過成像方法在所述一般二維載體上進行光學讀出方法，可選地在待檢測的細胞或細胞片段已經(jīng)通過標記劑被標記之后進行；其中（e）被用于讀出方法的包括例如透鏡系統(tǒng)的光學系統(tǒng)的光軸通常在樣品或樣品部分的流動的方向上延伸；并且（f）細胞或細胞片段的檢測是在所述多孔的一般二維載體的表面上進行的。
【專利說明】用于從樣品檢測細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001]本發(fā)明涉及用于從樣品檢測細胞(特別是微生物的)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]復雜的樣品溶液中的細胞的定量和定性檢測是微生物學、細胞學和現(xiàn)代生物技術(shù)的基本操作。
[0003]在這一方面，食品樣品中微生物的快速和直接檢測是特別嚴格的。由于樣品基質(zhì)的可能較高的復雜性，而且就特別相關(guān)的細菌(例如沙門氏菌(fe7?we77a)、李斯特菌(Zisieria)或軍團桿菌(Iegionella)(飲用水))而言確保無菌性的需要，以及因此的細菌的檢出限，它具有高的要求。特別地，食品工業(yè)要求一種不需要富集(enrichment)(即微生物的繁殖)的步驟，的方法。提供新的快速并廉價的微生物檢測方法是具有很大現(xiàn)實意義的問題。盡管近數(shù)十年來，為改善公眾健康取得了顯著的創(chuàng)新性科學成就，并且傳染病減少，但是全世界每年約300萬人死于食源性疾病。因此，在死因統(tǒng)計中，與食物相關(guān)的感染被發(fā)現(xiàn)與AIDS處于相同的水平，并且比肺結(jié)核更高。
[0004]在根據(jù)德國食品和飼料法(German Food and Feed Act) (LFGB, 2006)的要求和建議的最近建立的檢測方法中，一等分的食物(通常25g)或一研磨海綿樣品或從胴體表面和棉簽(swabs)穿刺而出的樣品,被懸浮在225ml的液體培養(yǎng)基中，從而增加均勻地和部分地污染的食物的檢測靈敏度。通過該方法，一方面，細菌被洗脫進培養(yǎng)基，而另一方面，對于培養(yǎng)相關(guān)的方法，介質(zhì)用于激發(fā)亞致死性損壞的細菌。這一步驟通常在一個或多個非選擇性或選擇性的持續(xù)數(shù)小時的初始富集步驟中進行。假設(shè)菌落從每個細菌形成，隨后通過將初始培養(yǎng)基接種到營養(yǎng)瓊脂平板上進行經(jīng)典的檢測步驟。因此，例如在已建立的微生物肉類檢測中，待檢測的病原體在一個或多個液體選擇性富集介質(zhì)中進行初步培養(yǎng)24至48小時。在固體培養(yǎng)基(選擇性瓊脂)培養(yǎng)之后，對細菌進行形態(tài)學和表型評估。轉(zhuǎn)移至無抑制劑瓊脂之后，菌株最后被進行生化和血清學表征直至食用水平。從樣品到達實驗室到結(jié)果陳述，例如對于單核細胞增生李斯特氏菌iListeria monocytogenes),檢測的整個過程需要三天(陰性樣品)至五天(陽性樣品)。
[0005]為了實現(xiàn)法例規(guī)定，其要求大量額外的中間控制，特別地沒有大量延遲，前述采用的技術(shù)太慢和太復雜。此外，微生物特定的富集/繁殖發(fā)生的所有過程都必須在經(jīng)當局批準的微生物實驗室中進行(德國感染保護法第64款)。食品制造商通常從相關(guān)的邏輯學及財務支出回避，并要求快速的方法從而避免上述問題。
[0006]因此，在過去二十年中進行了許多努力，以發(fā)展更快的方法，其中在非選擇性初步富集之后，能夠不需要形成菌落而進行檢測，這可以縮短方法。以下簡單地介紹這些方法。
[0007]核酸檢測方法(PCR，RNA雜交，NASBA):作為規(guī)則，這包括細胞裂解，隨后進行核酸提取、特定核酸目標的擴增和最終檢測。對于使用的平均量為1-10 μι的模板，能夠達到約為10基因組當量/樣品的檢出限。由于使用的樣品體積通常僅為10-50 μ?，預孵育數(shù)個小時之后必須達到IO3至IO4的細菌數(shù)量，從而能夠確定起始樣品的無菌性。[0008]免疫測定法(ELISA，免疫層析法):這是基于抗原和其相應的抗體的高度特異結(jié)合反應以及隨后反應產(chǎn)物的光學檢測，該檢測通過酶或染料標記的檢測抗體結(jié)合至先前形成的復合物。免疫測定法需要樣品體積約50-200 μ?，檢出限約為IO3至IO4 CFU/樣品(ELISA)或IO4至IO5 CFU/樣品(免疫層析法)。數(shù)小時的初始富集步驟在這里是必須的，從而得到這樣的細菌數(shù)量并且確保起始樣品的無菌性。
[0009]流式細胞術(shù):與熒光共軛物和磁性粒子結(jié)合的流式細胞數(shù)被應用于食物檢測。檢出限近似IO3 CFU/ml。因此，該方法不能在沒有初始富集的情況下也不能被應用。此外，流式細胞術(shù)被應用于血細胞(特別是白細胞)的免疫表型。當被用于微生物學時的相似的方法學缺點如下。約5000個細胞必須被檢測，從而得到有效的結(jié)果。因為紅細胞的大量過剩，對于白細胞，這會導致非常長的檢測時間。為避免這一點，在此也必須進行白細胞的初始富集，例如通過濃度梯度的離心來分離白細胞或者通過紅細胞的選擇性滲透裂解來測定。這些方法是繁瑣的，其中一些沒有充分的選擇性，并導致細胞的流失。 [0010]抗體直接熒光過濾技術(shù):在該技術(shù)中，微生物的分離是通過體積排阻在表面過濾器上進行的。通常，使用0.45 Mffl的過濾器。通常通過使用活體染料的染色(活/死染色，見下文)進行檢測，或者通過免疫熒光共軛。通過該技術(shù)，原則上能夠達到10-100 CFU/樣品的檢出限。問題是因為食物成分的顆粒沉積在過濾器上，該方法具有失效的高敏感性。因此，它僅能夠被應用于相對干凈的樣品或者在紅細胞成分的分離之后，并且由于其失效的敏感性，其被特別限制為1-10 ml的樣品。
[0011]在專利文獻中，已經(jīng)描述了對這些平臺技術(shù)的某些特別的設(shè)計。因此，EP-A-1 223429描述了一種用于檢測活微生物和/或真核細胞(特別是樣品中的單細胞生物、霉菌)的方法，其中液體形式的樣品被與載體接觸，該載體具有特異于將要檢測的微生物的受體，所述微生物被結(jié)合至受體，并且測定一個表示活微生物的因素。在此描述的方法中的載體包括以模制品形式的柱提供的材料、顆粒形式的松散填料，以瓊脂的形式或作為分散體，其攜帶用于特別地結(jié)合待確定的微生物的至少一個受體，并且對流體是可滲透的。載體材料的平均孔徑為I至200 μ?,并且孔體積分數(shù)為20-80%。該載體材料沒有或者僅具有非常低的、非特異的對微生物的吸水性(sorptivity)，并且具有每ml載體IO2至IO18受體的載量。通常通過圓柱形過濾元件或填料在微型柱內(nèi)進行分析，并且整體檢測過濾器上的光學變化。流動的方向和評估的方向相互垂直。該方法達到與上述免疫分析方法相似的檢出限。
[0012]W0-A-2008/118400公開了生長于透明的半透膜上的微生物的群體的快速測定和鑒定。該測定是使用顯色指示劑在常規(guī)的瓊脂平板上完成的。這是一種改進的經(jīng)典微生物操作方法，允許更有效的操作。
[0013]W0-A-2004/072097公開了用于HIV診斷的基于微芯片的系統(tǒng)。其中描述的一種方法的變形涉及結(jié)合有抗體的核孔膜上的細胞的檢測，膜的孔徑比待檢測的細胞更小。
[0014]W0-A-91/01485涉及使用定量評價的比色或熒光快速測試。為了檢測細胞成分，后者被提取，并且抗原的檢測在負載抗體的載體上進行。
[0015]EP-A-0421235公開了層壓至載體結(jié)構(gòu)的親水膜，以應用于側(cè)向流試紙測試。
[0016]W0-A-85/05451描述了在多孔固相上進行的三明治檢測(sandwich assays)。當檢測進行時，固相被沿軸向穿過。多孔膜的孔不是特定的。但是，看上去使用的孔徑小于待檢測的細胞的尺寸。[0017]EP-A-2 317 319提出了用于結(jié)合檢測的多孔固相，該檢測能夠使測試樣品(例如全血)被迅速、便捷、準確、廉價地分析，而不需要預處理，并公開了使用所述多孔固相的結(jié)合測試方法。在加入測試樣品之前，至少一種表面活性劑被結(jié)合至用于結(jié)合測試的多孔固相，所述至少一種表面活性劑選自:(A)包括通式(I)所示化合物的含糖表面活性劑，(B)包括蔗糖脂肪酸酯的含糖表面活性劑，其中構(gòu)成脂肪酸具有5至14個碳原子，以及(C)甾類表面活性劑。參考文獻沒有提到待分析的組分的穿透進多孔固相的孔中的重要性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明的目的是提供一種指示定義的原核細胞和真核細胞的測試方法。該測試能夠簡單并快速地進行，并且簡單并廉價地準備。它應該允許細胞的檢測，特別是微生物的檢測，即使對于大約〈100個細胞(特別地大約〈10個細胞)的小細胞數(shù)量，并且它應該能夠用于各種各樣的復雜的液體樣品。通過該測試，應該能夠同時檢測活細胞和死細胞。因此，應該能夠?qū)⒃摲椒ㄊ褂糜谖⑸飳W，但也可以在具有類似使用特點的其他領(lǐng)域應用中使用，例如體液或細胞培養(yǎng)基中特定的體細胞的檢測。
[0019]本發(fā)明的目的通過以下方法實現(xiàn)。一種用于從樣品檢測細胞的方法，包括以下步驟:
(a)將液相的樣品或樣品的部分以流動的方向施加至多孔的、大體為二維的載體，所述載體具有孔，所述孔在其表面具有至少一個特異于待檢測的細胞或待檢測的細胞的片段的結(jié)合分子；
(b)使待檢測的細胞或待檢測的細胞的片段能夠從樣品或樣品部分進入所述多孔的、大體為二維的載體的孔中，所述孔的平均孔徑使得待檢測的細胞或片段能夠進入孔中；
(c)通過至少一個特異于待檢測的細胞的結(jié)合分子留住待檢測的細胞或片段；
在樣品或樣品的部分已經(jīng)被施加并且待檢測的細胞或細胞片段已經(jīng)進入孔之后，所述樣品載體被可選地洗滌；
(d)通過成像方法在所述大體為二維的載體上進行光學讀出方法，可選地在待檢測的細胞或待檢測的細胞的片段已經(jīng)通過標記劑被標記之后進行；其中
(e)被用于讀出方法的包括透鏡系統(tǒng)的光學系統(tǒng)的光軸大體在樣品或樣品部分的流動的方向上延伸；并且
(f)待檢測的細胞或細胞片段的檢測是在所述多孔的、大體為二維的載體的表面上進行的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1示意性地示出了能夠被應用于根據(jù)本發(fā)明的方法中的裝置。
[0021]圖2至4示出了膜部分的顯微照片。
【具體實施方式】
[0022]在本發(fā)明的定義中，“大體為二維的載體”指厚度為10 Mm至mm且長度和寬度為I mm至100 mm的載體。
[0023]本發(fā)明的定義中的特異性結(jié)合分子是從常規(guī)結(jié)合實驗和親和層析中已知的生物的和合成的配體，其結(jié)合至待檢測的細胞或?qū)σ呀?jīng)被加入樣品中的細胞特異的結(jié)合分子，優(yōu)先于樣品的其他組分。特別地，這些包括天然的或重組的抗體、抗體片段和類似物(mimetics)、免疫活性抗原、寡核苷酸、多聚和低聚糖、結(jié)合分子的多聚和低聚糖(例如外源凝集素)、細胞膜受體的配體、噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)、結(jié)合IgG的蛋白(例如蛋白G、A或L)，以及特定的親和標簽的結(jié)合配體(如步驟標簽，His標簽等)。此外，當結(jié)合特性被適當?shù)剡x擇時，如果它們允許特定的細胞或細胞類的至少部分選擇性結(jié)合，具有疏水性、陰離子的、陽離子的或兩性離子的特性或具有由分子印跡產(chǎn)生的表面結(jié)構(gòu)的配體也可以被使用。其中的典型例子是革蘭氏陰性微生物結(jié)合至弱陰離子交換劑。例如在由David S.Hage編輯的Affinity Chromatography (2006), Vol.92, Taylor & Francis 中，可以找到結(jié)合分子的進一步例子。
[0024]在可選的洗滌步驟中，因為待檢測的細胞或待檢測的細胞片段的結(jié)合，可以以與樣品應用液體的流向相同或與樣品應用流體的流向相反的方向加入洗滌液。
[0025]在本發(fā)明的特定實施方式中，在其應用至多孔的、大體為二維的載體之前或之后，對樣品進行樣品處理，使得細胞或細胞組分被標記。這可以例如通過染料染色進行。染色或標記方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
[0026]可以被用于根據(jù)本發(fā)明的方法中的大體為二維的載體，例如多孔膜，特別地層厚度為0.05至I mm。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，可以通過例如通過適用于檢測細胞或標記的光學顯微鏡法的光學讀出方法來進行評估或分析，例如通過熒光顯微鏡以檢測熒光基團(fluorophors)或者亮視野顯微鏡以檢測發(fā)色基團。特別地，放大倍率為2x和40x之間的具有透鏡系統(tǒng)的通常顯微鏡和數(shù)字照相機可以被用于此。
[0028]特別地，與德國食品和飼料法相關(guān)的微生物能夠通過根據(jù)本發(fā)明的方法被檢測。特別地，所述微生物可以選自沙門氏菌spp.)、李斯特菌(Zisieriaspp.)、大腸桿菌 C￡ co7i)、大腸菌群細菌(coliform germs)、彎曲桿菌
spp.)、臘樣芽胞桿菌cereiAs)、亞硫酸還原梭狀芽胞桿菌(sulfite-reducingclostridia)、凝固酶陽性葡萄球菌(coagulase-positive staphylococci )。
[0029]根據(jù)本發(fā)明，特異于待檢測的細胞或其片段的受體可以特別地選自抗待檢測的細胞或其片段的抗體、外源凝集素、噬菌體，以及細胞膜受體的特定的自然或重組配體。為了檢測一組細胞或其它們的片段，特別是微生物(例如革蘭氏陰性細菌)，也可以使用簡單的化學物質(zhì)(特別是胺)。
[0030]在本發(fā)明的一個實施方式中，載體可以由發(fā)泡的、燒結(jié)的或纖維的無機或有機材料構(gòu)成。
[0031]特異于待檢測的細胞的結(jié)合分子可以被結(jié)合至材料，載體由已知的化學方法由該材料制成，如由 David S.Hage 編輯的 Handbook of Affinity Chromatography (2006),Vol.92, Taylor & Francis,pp.49 ff.中所描述的。例如，如果結(jié)合分子通過共價結(jié)合被連接至載體，載體上的功能基團與結(jié)合分子上的功能基團連接。這可以通過所謂的間隔物(通常是雙功能分子)直接或間接地進行。如果所述發(fā)泡的、燒結(jié)的或纖維的無機或有機材料的表面上的功能基團沒有足夠的數(shù)目來提供結(jié)合分子的必要的密度，制成載體的材料可以被合適的方法功能化。為了該目的，合適的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可用的。[0032]當可以被用在根據(jù)本發(fā)明的方法中的載體被制備時，燒結(jié)的聚乙烯材料可以作為起始材料。適當?shù)睦w維材料也可以被使用。
[0033]與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法相反，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的多孔載體的孔徑被選擇使得細胞或細胞片段能夠滲透入這些孔。因此，根據(jù)待檢測的樣品材料和細胞種類，孔徑可以選自2 Mm至200 Mm，特別地10 Mm至100 Mffl，即顯著大于用于相同細胞種類的現(xiàn)有技術(shù)檢測方法中的孔徑。因此，例如，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的用于檢測細菌的孔徑是2Mm至50 Mm,而對于檢測真核細胞則是40 Mm至200 Mm。在每種情況下,下限大約可以對應于待檢測的細胞的直徑的約兩倍，從而細胞能夠滲透進載體。已經(jīng)證明，對于檢測細胞，孔徑為5 Mm至25 Mm的載體特別有利，而對于檢測真核細胞，40 Mm至100 Mm的孔徑特別有利。
[0034]因為使用的孔徑，根據(jù)本發(fā)明的方法使得樣品能夠通過體積排阻過濾器進行高效的預過濾，該過濾器的排阻閾值高于待檢測的細胞的尺寸，但低于根據(jù)本發(fā)明的載體的孔徑。因此，除了待檢測的細胞之外，仍然存在于由此預過濾的樣品中的固體能夠穿過不受阻礙的載體。這降低了過濾器阻塞的可能性，并且相對于現(xiàn)有技術(shù)相應地顯著提高了最大可過濾體積。
[0035]通常，孔徑為2 Mm至100 Mm，特別為10 Mm至40 Mm。然后，結(jié)合分子的共價結(jié)合可以通過將它們化學地結(jié)合至表面的功能性基團或非共價地吸附至表面來進行。除了過濾器的結(jié)合特性，它們的光學特性和過濾特性以及與微生物劑的兼容性對于所述載體在所需應用的使用中是必要的。
[0036]有利的是，通過染色使細胞或其片段變得可檢測，即使細胞或其片段原則上也可以通過直接顯微鏡觀察來識別?？梢酝ㄟ^由抗體和酶或抗體和染料或著色劑顆粒組成的共軛物，或者通過由寡核苷酸和染料組成的核酸、或者酶、嵌入染料、或者酶反應將待檢測的細胞或其片段變得可檢測。
[0037]以下染色技術(shù)可以被用于根據(jù)本發(fā)明的方法:
使用染料和熒光染料活/死染色方法:這是基于作為標記劑的染料動態(tài)結(jié)合至細胞膜或細胞器，或者通過細胞酶或通過檢測呼吸鏈的中間體進行的染料前體的轉(zhuǎn)換，或者通過DNA或RNA中的嵌入。合適的然和和它們的應用協(xié)議對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且在例如 Molecular Probes Handbook、A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies 中有記錄。
[0038]通過抗體結(jié)合物的免疫染色:抗體-染料結(jié)合物可以通過抗體與染料分子或著色劑顆粒的結(jié)合來制備。為了這一目的，存在廣泛的化學激活和可激活的染料。
[0039]抗體-酶結(jié)合物通常通過抗體與辣根過氧化物酶、半乳糖氧化酶或磷酸酶的結(jié)合來制備。如果結(jié)合至二維載體的微生物標記有這些結(jié)合物，可以通過加入基于四甲基聯(lián)苯胺的沉淀底物或基于(E)-2-(2-[4-羥基苯基]乙烯基)-3-乙基-1，3-苯并噻唑碘化物的蛋白結(jié)合底物來簡單地使它們可見。進一步的合適的底物從生物化學和免疫組織化學中是已知的。
[0040]原位雜交:使用酶或染料標記的RNA的特定DNA/ RNA序列細胞內(nèi)標記已經(jīng)被建立來進行微生物的檢測，例如在微孔板中。合適的探針對于許多微生物是商業(yè)可獲取的，并且也可以通過已知的方法為其他細胞種類合成。這些方法很容易適應膜。[0041]特別地，可以通過簡單的固體光源激發(fā)的染料和顯示出大于50nm的斯托克斯位移的染料可以被用在這些標記技術(shù)中。
[0042]被選擇來讀出多孔的、大體為二維的載體的方法可以通過標記劑或通過細胞的內(nèi)在屬性來確定。用于根據(jù)本發(fā)明的方法的可能的評估方法包括，例如入射光或透射光技術(shù)中的亮場或暗場顯微鏡、相襯顯微鏡和偏振顯微鏡以及突光顯微鏡法，例如突光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡，熒光壽命成像光譜、近紅外光譜成像、多光子成像。特別地，通常的直立和倒置顯微鏡(例如來自Zeiss公司的)能夠被用作此目的。
[0043]被使用的二維載體中，所述載體具有I mm2至100 cm2的表面積和10 Mm至2 mm的厚度，以在載體中檢測熒光細胞。浸入式液體可以被可選地用來提高光學特性。還可能的是，使用具有大至200 cm2的表面積的大面積載體，并使用設(shè)備(例如螺旋接種儀)通過噴嘴來檢測樣品，這已經(jīng)在微生物學中建立。它留下了痕跡，其能夠通過光學方法來追蹤和評估。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的方法使被尋找的細胞能夠被保留在根據(jù)本發(fā)明的載體的整個容積中。整個載體容積的高清晰度圖像(其包括載體的整個厚度)特別地有利于完全地檢測被保留的細胞。根據(jù)本發(fā)明，這可以通過機械、圖像處理和光學措施被實現(xiàn)。例如，當采用該方法時，當載體被目視檢查時，顯微鏡的焦平面可以通過載體的整個厚度位移。并且，在數(shù)字圖像采集中，可以準備聚焦堆棧，亦即使用相同的圖像細節(jié)但不同的焦平面的圖像集合，并且堆棧的整個維度的所有對象的高清晰度圖像可以從中計算。對此合適的算法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。特別地，以像素計的熒光顯微鏡的聚焦堆棧的所有圖像的增加已經(jīng)被證明是有用的。如果將要成像的對象大于10 Mm，例如酶染料襯底反應的真核細胞或色暈?？梢酝ㄟ^使用具有低放大倍率和數(shù)值孔徑(numerical apertures)的物體來實現(xiàn)所需的景深。特別地，這些物體的放大倍率為0.5x至5x，并且數(shù)值孔徑為0.01至0.1。此外，光場顯微鏡和數(shù)字全息也可以被用作圖像采集方法。
[0045]特別廉價的光學評估單元可以通過數(shù)字照相機來實現(xiàn)。可以通過將膜置于具有
0.1至2 Mffl的像素間距的圖像傳感器直接地進行成像。并且，可以通過結(jié)合照相機和微距鏡頭、或顯微鏡物物體和管來使用常規(guī)的成像系統(tǒng)。在兩種方案中，可以在計算機屏幕上或通過電子圖像處理方法來簡單地進行評估。通過這些系統(tǒng)，可以通過沒有技術(shù)支出，來制得空間分辨率為每像素2至0.5 Mffl且放大倍率高達400倍的圖像，該圖像非常適于屏幕測試。特別地，所述光學系統(tǒng)可以通過通常的USB顯微鏡來實現(xiàn)。
[0046]如果填充多孔的、大體為二維的載體的孔的介質(zhì)的折射率np和多孔的、大體為二維的載體的折射率nt之間的差值nt-np小于0.05(特別地小于0.02)，則能提高根據(jù)本發(fā)明的方法的敏感性。
[0047]如果孔被填充有折射率小于固相的液體，則能夠獲得孔和固相的折射率的近似值。這可以通過適當?shù)剡x取檢測中使用的試劑，或者通過在完成結(jié)合實驗之后交換孔的內(nèi)容物來完成。
[0048]在第一種情況中，可以在使混合物的折射率接近固相的濃度下，將檢測試劑混合至例如與水混溶的或可溶于水的正在提升其折射率的物質(zhì)。特別合適的混合物是高密度的與水混溶的液體，例如甘油、短鏈的聚乙二醇、硫二甘醇。合適的水溶性物質(zhì)是具有高溶解度和高分子量的物質(zhì)，例如碘化鈉、氯化銫、蔗糖。加入的物質(zhì)的濃度應該保持較低，使得檢測(例如抗體復合物的形成)不會被妨礙。
[0049]在另一種情況中，最后加入的檢測試劑可以在結(jié)合實驗的過程中或完成之后被替換為折射率與固相相同的液體。為了這一目的，首先，與在先前文本中描述的相同的水混合物和溶液使合適的。但是，物質(zhì)可以被加入時的濃度限制較少。在某些情況下，免疫復合物的形成甚至可以被阻止。但是，已經(jīng)被形成的免疫復合物的結(jié)合應該被維持。特別是當使用二甘醇時，所述物質(zhì)可以以純的形式被使用，據(jù)此，常規(guī)的固相(例如硝化纖維)的折射率也可以被達到。如果固相是充分可濕的，不與水混溶的物質(zhì)(例如浸油)也可以被使用。
[0050]在一個實施方式中，可以被用在根據(jù)本發(fā)明的方法中的載體由多孔聚合物材料(特別是全氟聚合物和含氟聚合物)制成。特別地，它可以選自氟化乙烯-丙烯(FEP)共聚物、聚四氟乙烯(PTFE)、四氟乙烯-六氟丙烯-偏二氟乙烯(THV)、全氟烷氧基烷烴(PFA)、磺化的聚四氟乙烯(NAF10N)，或另一組聚乙烯、纖維素衍生物、聚酰胺、聚(甲基丙烯酸甲酯)。在本發(fā)明的一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多孔載體可以被實施為膜或平壓的部分(玻璃(frit))。[0051]所述載體具有孔體積并能夠以不同方式中的一種制備。合適的方法特別地包括燒結(jié)法，其中顆?；蚶w維高分子材料被通過加熱壓成一個形狀。特別地，用于制備非織造物的方法或織物技術(shù)可以被用來制備纖維材料。對于顆粒材料，用于制備玻璃的方法是特別合適的。此外，生成孔的方法是合適的，例如特別是，通過揮發(fā)性發(fā)泡劑(發(fā)泡)或通過可溶性犧牲材料(在使用載體之前被從孔浸出)造成的起始材料的膨脹。除了這些轉(zhuǎn)換材料的方法，孔形成發(fā)生在固相從溶劑中沉淀(例如水凝膠-晶膠或氣凝膠方法)期間的方法也是合適的。
[0052]在一個實施方式中，所述載體是通過從直徑為40Mm的球形PMMA顆粒中燒結(jié)而制備的。當細胞通過固定化抗體被結(jié)合至表面并且通過抗體-熒光染料結(jié)合物被染色時，如果通過將水相替換為例如是83%的二甘醇17%的水的混合物來實現(xiàn)近似的折射率，可以獲得特別鮮明的圖像。
[0053]在另一個實施方式中，所述載體是從由紡制FEP制成的無紡布中制備的。在本例中，如果使用通常的緩沖介質(zhì)(例如PBS)，已經(jīng)獲得了折射率的匹配。
[0054]如果在用于載體的多孔材料的表面上沒有用于結(jié)合分子的化學結(jié)合的功能性基團，可以通過使用合適方式的化學反應來使后者功能化，從而固定用于多孔載體的異質(zhì)性結(jié)合試驗所需的結(jié)合分子。
[0055]因此，例如，根據(jù)DE-A-10 2009 003374，“底物的永久親水性多孔涂層及其多孔膜”，第0061段和表1，可以通過聚乙烯醇丙烯酸甲酯(PVMMA (2.5?的親水涂層提供形成為膜的多孔載體。
[0056]由此被OH基團親水化的PTFE膜可以被進一步與3_氨丙基三乙氧基硅烷在有機溶劑中反應，并因此具備氨基基團。例如，如由David S.Hage編輯的handbook ofAffinity Chromatography (2006), Vol.92, Taylor & Francis,pp.54-55.所述，可以通過同型雙功能的N-羥基酯來反應，使得結(jié)合分子能夠被結(jié)合。琥珀酸作為雙功能間隔劑的使用是特別有利的。
[0057]抗體被通過所述方式結(jié)合至的親水化的PTFE膜(Millipore的0MNIP0RE JC)已經(jīng)被證明是特別有利的。典型的修改程度是每IOOPg膜體積I至100 Pg抗體(特別是5-10Mg抗體)。在50 Mm的膜厚度,這一最佳值的上限值對應于每cm2過濾器面積約4 Kg抗體且具有大到約3 X IO13個特定的結(jié)合位點。由于在該方法中的結(jié)合產(chǎn)率一般為1_10%，在這種膜中可以假設(shè)約0.3-3 X IO12活躍的結(jié)合位點/cm2。通過結(jié)合分子的這樣的密度，非常有可能將微生物或它們的特征片段生物特異性地結(jié)合至所述膜，特別是如果抗體直接抵抗在膜(例如多糖或脂多糖)上發(fā)生數(shù)次的抗原。
[0058]通過以下實施例進一步描述了本發(fā)明。
[0059]實施例1
飲用水中軍團菌(^^io/^77a)的熒光檢測。
[0060]1.PTFE膜的功能化和抗體固定。 [0061]在第一個步驟中，通過OH基團親水化的PTFE膜(來自Millipore的OMNIPORE JC)通過3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)的處理而被氨化。因此，50μ1的3_氨丙基三乙氧基硅燒(Sigma-Aldrich Chemie GmbH)被溶解于4950 Μ.1的丙酮中，并在90mm的玻璃培養(yǎng)皿中被施加至干的膜(d = 5 cm)。所述培養(yǎng)皿被轉(zhuǎn)移至玻璃干燥器，該干燥器被快速地(〈10min)排空至〈300 mbar。在關(guān)閉的干燥器中在定軌振蕩器上在20 rpm室溫下孵育12小時。隨后，加入0.42 μ?試劑級37%的鹽酸(Carl Roth GmbH & C0.KG)。培養(yǎng)皿然后被轉(zhuǎn)移至玻璃干燥器，該干燥器被快速地(〈10 min)排空至〈300 mbar。然后在關(guān)閉的干燥器中在定軌振蕩器上在20 rpm室溫下孵育6小時。此后，通過抽吸來去除液體，并且向所述膜加入6.25 ml的丙酮。此后，再次關(guān)閉干燥器，將培養(yǎng)皿在定軌振蕩器上在40 rpm震動。重復每個步驟兩次。最后，通過供應充足的空氣，在室溫下將膜干燥至少I小時。
[0062]在第二個步驟中，進行所述膜的COOH功能化。因此，在培養(yǎng)皿中的干燥的膜被使用5 ml的DMF層覆蓋并且在定軌振蕩器上震動5 min。通過抽吸去除液體，并且重復先前的步驟。再次通過抽吸去除液體。
[0063]此后，所述膜被使用5 ml的琥珀酸酐溶液(400 mg溶于10 ml的DMF中)層覆蓋并且在定軌振蕩器上震動10 min。隨后，加入5 μ?的吡啶，并且培養(yǎng)皿在具有干燥劑的關(guān)閉的干燥器中在定軌振蕩器上在20 rpm在室溫下被孵育12小時。通過抽吸去除液體，而所述膜被使用5 ml的雙蒸水層覆蓋。所述膜在定軌振蕩器上震動5 min。重復兩個先前的步驟。
[0064]在第三個步驟中，進行抗體至膜的結(jié)合。
[0065]因此，來此步驟2的濕的膜被使用5 ml的MES緩沖液(19.5 g的2_ (N-嗎啉)乙磺酸溶于I升H2O中形成的0.05 M溶液，pH = 5.5)覆蓋，然后在定軌振蕩器上震動5 min。重復前述步驟。通過抽吸去除液體，所述膜被使用5 ml的EDC溶液(328.6 mg的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶于20.53 ml的MES粉末中)覆蓋，并在定軌振蕩器上震動10 min。此后，加入0.5 ml的磺基-NHS溶液(406.2 mg的N-羥基琥珀酰亞胺，1.127 ml的MES緩沖液)，在孵育30 min后，吸掉液體，而所述膜被使用5 ml的MES層覆蓋。它然后在定軌振蕩器上震動10 min。重復兩個先前的步驟。隨后，所述膜被使用2.5 ml 的抗體溶液(80 Pg/ml 的抗o/?i?77a 抗體 5F4, Senova GmbH,魏瑪,溶于 MES 緩沖液)覆蓋，在定軌振蕩器上震動120 min。通過抽吸去除液體，所述膜被使用含有0.25%乙醇胺溶液(封閉的)的5 ml的MES層覆蓋30分鐘。隨后去除液體，所述膜被使用5 ml的MES緩沖液覆蓋，然后在定軌振蕩器上震動10 min。重復前述步驟。[0066]最后，通過抽吸去除液體，所述膜被使用5 ml的干燥緩沖劑層覆蓋，然后在定軌振蕩器上震動60 min。通過抽吸去除液體，通過強制空氣循環(huán)在室溫下將所述膜干燥I小時。
[0067]2.過濾器組件的制備。
[0068]使用打孔器從所述膜上打孔形成直徑為I至5 mm的圓形過濾器。所述過濾器被置于聚乙烯玻璃 2 (Durst Filtertechnik, Besigheim,德國，型號 XM112, d = 5 mm, h = 1.6mm)上，并被引入有機玻璃的樣品架的腔中。在所述膜上方，一短塊PTFE撓性管3被壓入所述腔，而微型柱(750 μ? ABI CAP, Senova GmbH,魏瑪)的魯爾口( Luer port) 4被插入至撓性管3。圖1示出了在實施例1中使用的組件。 [0069]3.樣品的應用、使用抗-Z6^io/?e77a-藻紅蛋白染色、以及光學評估。
[0070]在第一個步驟中，將500 μ?的待檢測的樣品用移液管吸取至微型柱。在樣品由于重力流過所述組件之后，將750 μ?的洗滌緩沖液(0.1% BSA和0.05% Tween 20溶于PBS緩沖液，pH = 7.4)用移液管吸取至Abicap柱。
[0071]洗漆緩沖液(500 μ?的抗-Z6^io/?e77a-藻紅蛋白結(jié)合物(ImmunoTools GmbH,羅斯托克，德國)溶于含酪蛋白(I mg/ml)的PBS緩沖液形成的0.5 Pg/ml溶液，pH = 7.4)在第二個步驟中被加入。在結(jié)合物溶液在約4 min內(nèi)流過所述組件后，使用750 μ?的洗滌緩沖液進行洗滌步驟三次。隨后，移除Abicap柱和PTFE撓性管，然后使用數(shù)μ?的生理鹽水覆蓋所述膜。使用落射熒光顯微鏡(Axiostar plus，光源為HXP150C，濾光片為43 HE，物鏡為A-Plan 10χ/0.35 ;全部來自Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德國)和顯微照相機(AxioCam MRc5, Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德國)，計算透明的膜上突光標記的細菌的數(shù)量。通過這一方法，達到每個過濾器10個細菌的檢出限。圖2示出了根據(jù)實施例1的膜部分的顯微照片。應用的樣品含有約500個Legionella細菌。
[0072]實施例2
通過HRP/TMBpra.檢測的飲用水中細菌的檢測。
[0073]1.在HDPE膜上的抗體固定。
[0074]在第一個步驟中，通過類似于Meyer M.F.et al., Biosensors andBioelectronics 2007, 22 (6)，p.973 中描述的方法，抗抗體(5F4,Senova,魏瑪)通過HDPE膜(Porex Inc.型號T3，孔徑5-10 Mm，厚度200 Mm，高密度聚乙烯=HDPE)上的物理吸附被固定。因此，50個圓形過濾器(d = 5 mm)被沖出，并且被置于具有20 ml乙醇(96%)的50 ml的燒杯中，并在10 Torr下在干燥器中脫氣,在磁力攪拌器上輕微攪拌20 min。隨后，使用50%的乙醇溶液洗滌過濾器，并最終將過濾器在10 ml的碳酸鹽緩沖液(100 mM, pH 9.5)中脫氣三次。隨后，伴隨攪拌加入100 μ?的溶于碳酸鹽緩沖液的I mg/ml l-Legionella溶液。在干燥器中在室溫下輕微攪拌孵育所述過濾器6小時。隨后，使用封閉(block)溶液(5.5 mg/ml的酪蛋白溶于PBS緩沖液(150 mM, pH =
7.3))替換抗體溶液，脫氣之后，攪拌封閉I小時。隨后，使用干燥緩沖液(PBS，1% BSA, 1%蔗糖)替換封閉溶液，并在干燥器中孵育I h。最后在流化床干燥機(FPD200 Endicots，英國)中在室溫下干燥所述膜15 min。
[0075]2.過濾器組件的制備。
[0076]類似于實施例1的項目2，進行過濾器組件的制備。
[0077]3.樣品的應用，使用抗-Z￡^i0/^77a-HRP結(jié)合物+沉淀TMB染色，以及光學評估。
[0078]在第一個步驟中，濃度為10 cfu/ml> 100 cfu/ml> 1000 cfu/ml的樣品溶液每個2x500 μ?被用移液管吸取至所述裝置。隨后，先后加入750 μ?的PBS洗滌緩沖液和500 μ?的抗-Legionella-過氧化物酶結(jié)合物在PBS緩沖液(Senova GmbH,魏瑪,德國)中形成的5Kg/ml的溶液。結(jié)合物溶液流過所述組件之后，3x 750 μ?的洗滌緩沖液及隨后的500 μ?的沉淀TMB底物溶液(SDT公司，BaesweiIer，德國)被用移液管吸取進所述組件。4分鐘之后，750 μ?的洗滌緩沖液再次被用移液管吸取至柱以終止(quenching)檢測反應。隨后，移除所述膜，并將其轉(zhuǎn)移至顯微鏡載玻片上，而細菌的特征色暈被使用透射光顯微鏡(Axiostarplus，具有鹵素光源且物鏡為A-Plan 5x/0.12 ;全部來自Zeiss MicroImaging GmbH，耶拿德國)和顯微鏡照相機(AxioCam MR3, Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德國)來計數(shù)。圖3示出了由此獲得的針對樣品的不同內(nèi)容物的膜的部分顯微照片。通過該方法，能夠達到5-15個細胞的檢出限。圖3a示出了根據(jù)實施例2的膜部分的顯微照片。應用的樣品不含有細菌。圖3b示出了根據(jù)實施例2的膜部分的顯微照片。應用的樣品含有約100 ^Legionella細菌。圖3c示出了根據(jù)實施例2的膜部分的顯微照片。應用的樣品含有約1000 Legionella細菌。
[0079]實施例3
通過在透明膜上的活體染色的Salmonella細菌檢測。
[0080]1.抗體的固定。
[0081]使用根據(jù)實施例1項目I的膜。代替其中使用的抗體，單克隆的抗菌屬抗體(1E6，Sifin GmbH，柏林)被固定在膜上。
[0082]2.過濾器組件的制備。
[0083]直徑為24 mm的圓形過濾器被使用打孔器從所述膜上沖出。所述過濾器被固定至空的20 ml的具有可插入底部的柱(SpinColumn, AHN Biotechnology,北豪森,德國)的底部。蠕動泵被連接至柱的較低魯爾口。
[0084]3.樣品制備。
[0085]25 g的熱消毒肉樣品和225 ml的緩沖蛋白胨水被加入至兜包袋(Stomacherbag) (BA6141/STR, Seward Limited,英國)的內(nèi)部過濾袋，并使用 10 μ? 飽 Salmonellatyphimuria (ATCC 14028)預培養(yǎng)物(1000 germs/ml)孵育。隨后在37 ° C下孵育樣品，并且4、6、8和10個小時后從外部袋移除每個樣品的10.1 ml。
[0086]4.參考檢驗。
[0087]每個子樣品100 μ?被接種到XLD瓊脂上。在37 ° C孵育24小時后，通過計數(shù)確定菌落的數(shù)目。
[0088]5.樣品的應用，染色，以及光學評估。
[0089]被從兜包袋移除后，10 ml的子樣品立即被加入至柱，并被通過蠕動泵在I ml/min的流速下抽出。濾液被完全地從泵的可撓管中移除后，反轉(zhuǎn)泵的流向，5 ml的洗滌緩沖液被以I ml/min的流速通過膜壓進柱。去除在柱中由此形成的上清液。在第二個步驟中，回復原始流向，5 ml 的 LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen, Carlsbad,美國)被加入至柱，并以
0.5 ml/min的流速通過螺動泵被抽出。隨后5 ml的生理鹽水被加入柱,并以2 ml/min的流速通過蠕動泵被抽出。在最后的步驟中，膜被從柱移除，并被轉(zhuǎn)移至顯微鏡載玻片上，并用一層生理鹽水(其被蓋玻片覆蓋)覆蓋。使用落射熒光顯微鏡(Axiostar plus，具有光源HXP150C，濾光片 14和 38 HE，物鏡A-Plan 10χ/0.35 ;全部來自 Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿，德國)以及顯微鏡照相機(AxioCam MRc5,Zeiss MicroImaging GmbH,耶拿,德國)，1.4mm X 20 mm and 20 mm x I mm的所述膜的兩個橫向排列的區(qū)域被分別檢驗。突光標記的細菌被計數(shù)，并且使用不同的熒光顏色來分類。
[0090]6.檢驗方法的比較。
[0091]在膜區(qū)段(=總面積的1/12)上，對以下數(shù)目的有活性的細菌進行計數(shù)，并從中計
算每ml樣品的細菌數(shù)目。
【權(quán)利要求】
1.一種用于從樣品檢測細胞的方法，包括以下步驟: (a)將液相的樣品或樣品的部分以流動的方向施加至多孔的、大體為二維的載體，所述載體具有孔，所述孔在其表面具有至少一個特異于待檢測的細胞或這些細胞的片段的結(jié)合分子; (b)使待檢測的細胞或這些細胞的片段能夠從樣品或樣品部分進入所述多孔的、大體為二維的載體的孔中，所述孔的平均孔徑使得待檢測的細胞或片段能夠進入孔中； (c)通過至少一個特異于待檢測的細胞或片段的結(jié)合分子留住待檢測的細胞或片段； (d)通過成像方法在所述大體為二維的載體上進行光學讀出方法，可選地在待檢測的細胞或細胞片段已經(jīng)通過標記劑被標記之后進行；其中 Ce)被用于讀出方法的光學系統(tǒng)的光軸大體在樣品或樣品部分的流動的方向上延伸；并且 Cf)細胞或細胞片段的檢測是在所述多孔的、大體為二維的載體的表面上進行的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(c)和(d)之間，并且在樣品或樣品的部分已經(jīng)被施加并且待檢測的細胞或細胞片段已經(jīng)進入孔之后，所述樣品載體被可選地洗滌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在被施加至所述多孔的、大體為二維的載體之前或之后，所述樣品被進 行樣品處理，以標記所述細胞或片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其中所述標記是通過使用染料的染色進行的。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述大體為二維的載體是多孔膜，特別是層厚度為0.05至I mm的多孔膜。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述光學讀出是通過顯微鏡法進行的。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述待檢測的細胞或細胞片段是德國食品和詞料法相關(guān)的微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述微生物選自沙門氏菌、麥角菌、李斯特菌、大腸桿菌、大腸菌群細菌、彎曲桿菌、蠟樣芽胞桿菌、亞硫酸還原梭狀芽胞桿菌、凝固酶陽性葡萄球菌。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述特異于待檢測的細胞或細胞片段的結(jié)合分子選自抗所述待檢測的細胞或細胞片段的抗體、外源凝集素、噬菌體以及特定的結(jié)合因子。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述載體由發(fā)泡的、燒結(jié)的或纖維的無機或有機材料組成。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述待檢測的細胞通過活/死染色而變得可檢測。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述待檢測的細胞或細胞片段通過由抗體和酶或染料或著色劑顆粒組成的結(jié)合物而變得可檢測。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述待檢測的細胞通過酶促反應而變得可檢測。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述待檢測的細胞或片段通過核酸探針而變得可檢測。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中讀出所述多孔的、大體為二維的載體的所述方法是通過光度測定、化學發(fā)光、熒光測定進行的。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中填充多孔的、大體為二維的載體的孔的介質(zhì)的折射率np和多 孔的、大體為二維的載體的折射率nt之間的差值nt-np小于0.05。
【文檔編號】G01N33/543GK103547922SQ201280008595
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月11日
【發(fā)明者】斯蒂芬·亨策, 彼得·米爾希 申請人:Fzmb醫(yī)療技術(shù)和生物技術(shù)研究中心有限公司