生腱蛋白c及其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種確定待測(cè)個(gè)體的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)、或者類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)展、或者用于患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的合適療法的方法，該方法包括下述步驟：(a)測(cè)定來自所述待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C的水平；以及(b)將步驟(a)中測(cè)定的生腱蛋白C水平與一個(gè)或多個(gè)參考值相比較。優(yōu)選所指的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。當(dāng)公開時(shí)，隨附有圖5。
【專利說明】生腱蛋白C及其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生腱蛋白C(韌粘素 C，tenascin-c)作為用于炎性紊亂的生物標(biāo)志物 的用途，特別是作為用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的血清生物標(biāo)志物的用途。具體地講，本發(fā)明涉及生 腱蛋白C作為用于侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 生腱蛋白C是促炎胞外基質(zhì)糖蛋白（proinflammatory extracellular matrix glycoprotein) (Midwood，et al. (2009)，Nat. Med.，15 :774_780)，其通過模式識(shí)別受體 TLR4的活化而誘導(dǎo)在初級(jí)人類巨噬細(xì)胞和滑液成纖維細(xì)胞中的炎性細(xì)胞因子合成。生腱蛋 白C是較大的六聚蛋白質(zhì)，分子量為1. 5百萬道爾頓。已經(jīng)在炎癥位點(diǎn)例如在類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎病人的滑液中以及在腫瘤間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)高水平的生腱蛋白C。
[0003] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是慢性病，其特征是多個(gè)關(guān)節(jié)的持續(xù)的炎癥、腫脹和疼痛。隨著時(shí)間 推移，慢性炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)的骨組織破壞，并且導(dǎo)致漸進(jìn)性殘疾。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一個(gè)突出 的標(biāo)志是在其臨床表現(xiàn)中的較大的可變性。該可變性擴(kuò)及至疼痛水平、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)量和關(guān) 節(jié)變形程度。類似地，患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人對(duì)任何具體藥物治療的反應(yīng)也差異很大，一 些病人的疾病跡象和征狀幾乎消除，而其他病人幾乎完全沒有反應(yīng)。
[0004] 用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)有診斷方法由美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（American College of Rheumatology)確立，包括以下各項(xiàng)內(nèi)容：
[0005] 1)晨僵持續(xù)超過1小時(shí)（主要在手指上）；
[0006] 2)在超過3個(gè)關(guān)節(jié)中腫脹；
[0007] 3)手關(guān)節(jié)（腕關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)和近位指節(jié)間關(guān)節(jié)）腫脹；
[0008] 4)在對(duì)稱的關(guān)節(jié)中腫脹（左右關(guān)節(jié)）；
[0009] 5)手的射線照相中的反常發(fā)現(xiàn)；
[0010] 6)皮下結(jié)節(jié)；以及
[0011] 7)通過血液CRP(C-反應(yīng)蛋白）測(cè)試或者抗CCP(抗環(huán)狀瓜氨酸化肽 (citrullinated peptide))測(cè)試的風(fēng)濕病檢測(cè)陽性。該情況中，滿足超過4項(xiàng)即被診斷為 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可供選擇的標(biāo)記物、一種診斷試劑、以及一種檢測(cè) 方法，所述方法可以方便地用于鑒定類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是用于鑒定侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
[0013] 侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人中殘疾的主要原因，并且特征是 關(guān)節(jié)骨的骨損失和局部侵蝕。
[0014] 骨侵蝕的測(cè)定幾乎僅僅基于影像學(xué)表現(xiàn)、超聲和doplar研究（doplar studies)， 因?yàn)閷?duì)通過活體解剖得到的這些病灶的直接評(píng)估是很不實(shí)際的。術(shù)語"骨侵蝕"描述了在 近關(guān)節(jié)位點(diǎn)的礦化組織的損失，其通常與在皮質(zhì)內(nèi)層中的斷裂有關(guān)。骨侵蝕在疾病早期開 始，并且在第一年期間發(fā)展最快，因此，快速檢測(cè)和治療侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的能力將成為 極大益處。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供一種確定待測(cè)個(gè)體的炎性紊亂狀態(tài)的方法，該方法包 括下述步驟：
[0016] (a)測(cè)定來自所述待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C的水平；以及
[0017] (b)將步驟（a)中測(cè)定的生腱蛋白C水平與一個(gè)或多個(gè)參考值相比較。
[0018] 炎性紊亂可以是一種或多種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng) 直性脊椎炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、狼瘡和肌炎。優(yōu)選地，炎性紊亂是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，尤其是侵蝕性 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
[0019] 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法被用于確定待測(cè)個(gè)體的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)，優(yōu) 選地，待測(cè)個(gè)體的侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)。侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎被定義為在關(guān)節(jié)骨中具 有至少一個(gè)侵蝕性病灶的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，優(yōu)選地具有至少5個(gè)病灶、優(yōu)選地具有至少10個(gè) 病灶、優(yōu)選地具有至少20個(gè)病灶。病灶數(shù)目越多，則侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎越嚴(yán)重。
[0020] 本發(fā)明的方法可以用于確定待測(cè)個(gè)體的侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)，所述待測(cè)個(gè)體 已經(jīng)被診斷為患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法提供了一種容易的、非侵入性的和 便宜的查看患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人的侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)的方法。
[0021] 樣品可以是血液樣品比如全血樣品、血漿或者血清。在一個(gè)可替代的實(shí)施方式中， 樣品可以是尿液。優(yōu)選地，樣品是血清樣品。
[0022] 優(yōu)選地，該方法被用于確定待測(cè)個(gè)體是否患有侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
[0023] 生腱蛋白C是一種新穎的用于炎性紊亂、尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、更具體地講侵蝕 性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的血清生物標(biāo)志物。
[0024] 人類生腱蛋白C的蛋白質(zhì)序列能夠使用登記號(hào)碼P24821在GenBank上找到，并且 在圖8中給出了氨基酸序列。
[0025] 在本發(fā)明的方法中，所有形式的生腱蛋白C都可以被測(cè)量。優(yōu)選地，至少一種 320kDa的生腱蛋白C亞型被測(cè)量到。優(yōu)選地，僅僅320kDa亞型的生腱蛋白C被測(cè)量。
[0026] 術(shù)語"炎性紊亂狀態(tài)"包括任何可識(shí)別的炎性紊亂的表現(xiàn)形式。例如，炎性紊亂狀 態(tài)包括、但不限于：炎性紊亂的存在或者沒有，炎性紊亂發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，炎性紊亂的階段，炎性 紊亂的進(jìn)展，以及炎性紊亂治療的有效性或待測(cè)個(gè)體對(duì)炎性紊亂治療的反應(yīng)。
[0027] 本發(fā)明的方法可以用于下述任何一個(gè)或多個(gè)方面，例如，診斷待測(cè)個(gè)體中的炎性 紊亂；評(píng)價(jià)待測(cè)個(gè)體發(fā)展炎性紊亂的可能性；為患有炎性紊亂的待測(cè)個(gè)體提供關(guān)于預(yù)后的 建議；監(jiān)控疾病進(jìn)展；以及監(jiān)控炎性紊亂治療的有效性或待測(cè)個(gè)體對(duì)炎性紊亂治療的反 應(yīng)。
[0028] 優(yōu)選地，該方法容許根據(jù)對(duì)待測(cè)個(gè)體提供的樣品中生腱蛋白C水平的分析來診斷 待測(cè)個(gè)體的炎性紊亂。
[0029] 術(shù)語"類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)"包括任何可識(shí)別的疾病的表現(xiàn)形式。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎狀態(tài)包括、但不限于：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的存在或者沒有，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎的階段，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的有效性或者個(gè)體對(duì)于類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎治療的反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)是指沒有或者存在侵蝕 性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
[0030] 本發(fā)明的方法例如可以用于下述任何一個(gè)或多個(gè)方面：診斷待測(cè)個(gè)體中的類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎狀態(tài)、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；評(píng)價(jià)待測(cè)個(gè)體發(fā)展類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)、尤其是侵 蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能性；為患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎待測(cè) 的個(gè)體提供關(guān)于預(yù)后的建議；監(jiān)控疾病、尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展；以及監(jiān)控炎性紊亂 治療的有效性或待測(cè)個(gè)體對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的反應(yīng)。
[0031] 優(yōu)選地，該方法容許根據(jù)對(duì)由待測(cè)個(gè)體提供的樣品中生腱蛋白C水平的分析來診 斷待測(cè)個(gè)體的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
[0032] 可以通過任何合適的測(cè)試方法來測(cè)定樣品中存在的生腱蛋白C水平，所述測(cè)試 方法可以包括應(yīng)用下組中包含的任何一項(xiàng)：免疫測(cè)試、光譜測(cè)定法、Western blot、ELISA、 免測(cè)沉淀法、狹縫印跡法或者點(diǎn)印跡測(cè)定法、等電點(diǎn)聚焦、SDS-PAGE、抗體微陣列免疫組 織學(xué)染色、射電免疫測(cè)定（RIA)、熒光免疫分析、使用親和素-生物素或者鏈霉親和素 (streptoavidin)-生物素系統(tǒng)的免疫測(cè)試等、或前述方法的組合。這些方法已為本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知。
[0033] 作為另一種選擇，可以通過測(cè)定樣品中生腱蛋白C的mRNA水平來測(cè)量生腱蛋白C 水平。mRNA水平能夠通過PCT或者任何其它合適技術(shù)來測(cè)量。
[0034] 優(yōu)選地，用于與測(cè)定的生腱蛋白C水平相比較的參考值是在一個(gè)或多個(gè)待測(cè)個(gè)體 中觀察到的生腱蛋白C水平。所述待測(cè)個(gè)體未患有任何可檢測(cè)到的炎性紊亂比如類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎、或者炎性紊亂比如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的任何臨床癥狀，且具有生物標(biāo)志物生腱蛋白C的 所謂的"正常值"。
[0035] 優(yōu)選地，與正常組織樣品中的水平相比，待測(cè)樣品中生腱蛋白C約50 %或更多的 提高即是炎性紊亂、例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的癥候。
[0036] 優(yōu)選地，每毫升血清或血漿中生腱蛋白C超過31ng、優(yōu)選超過33ng的水平，即是類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的癥候或者至少是指示。優(yōu)選地，生腱蛋白C水平 與其它標(biāo)志物的組合容許類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷。
[0037] 作為另一種選擇，參考值可以是得到的特定個(gè)體的之前的值。如果所述方法是準(zhǔn) 備用于監(jiān)控疾病的進(jìn)展或者監(jiān)控待測(cè)個(gè)體對(duì)特定治療的反應(yīng)，可以使用此參考值。
[0038] 優(yōu)選地，生腱蛋白C水平相比正常的/未患病的參考水平的提高，即是類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的指示或征候。
[0039] 生腱蛋白C水平可以被用于將患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人分成患有侵蝕性類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎的病人和非患者。
[0040] 本發(fā)明的方法也可以被用于監(jiān)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)展、以及尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎進(jìn)展，和/或用于監(jiān)控施加于個(gè)體的治療的功效。前述方法的實(shí)現(xiàn)，可以通過分析在初 始診斷后不同時(shí)間點(diǎn)取自個(gè)體的樣品，監(jiān)控生腱蛋白C水平的變化、并且將這些水平與正 常值和/或參考值相比較。該情況下，參考水平可以包括個(gè)體中最初的生物標(biāo)志物水平、或 者在最后測(cè)試時(shí)個(gè)體中的生物標(biāo)志物水平、或者上述兩個(gè)水平。
[0041] 本發(fā)明的方法也可以被用于確定用于個(gè)體的合適治療方案。該方法可以被用于 提供個(gè)人化的醫(yī)學(xué)方案。在一種實(shí)施方式中，樣品中生腱蛋白C水平的提高足以導(dǎo)致診斷 為炎性狀況例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，可以被用于表明：當(dāng)個(gè)體不大可能有反應(yīng)時(shí)，使用抗TNF藥 物是不適當(dāng)?shù)?。提供替代療法或許更合適，例如，抗IL17療法；T細(xì)胞共刺激調(diào)諧劑（比如 Orencia?-阿巴西普（Abatacept)):白細(xì)胞介素_6(IL_6)抑制劑（比如Actemra?-托珠單 抗（Tocilizumab));抗⑶20抗體（比如Rituxan?-美羅華（Rituxumab);或B細(xì)胞活化因 子（比如抗BAFF)。其他替代療法包括Janus激酶抑制劑（JAK)(比如Tofacitinib?)和 脾酪氨酸激酶抑制劑（Syk)(比如Fostamatinib?)。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于確定抗TNF療法對(duì)于患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 的病人而言是否是一種合適療法的方法。更具體地講，如果患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人在其 血漿或者血清中的生腱蛋白C水平為至少31ng每毫升血漿或者血清、或者至少33ng每毫 升血漿或者血清的，則他們對(duì)于抗TNF療法不太可能有反應(yīng)。
[0043] 優(yōu)選地，本發(fā)明的方法是體外進(jìn)行。
[0044] 個(gè)體可以是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人類，但可以可選擇地是猴、猿、貓、狗、牛、馬、兔或 者嚙齒動(dòng)物。
[0045] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種確定患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的侵蝕性類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎狀態(tài)的方法，該方法包括下述步驟：
[0046] (a)測(cè)定來自所述個(gè)體的樣品中生腱蛋白C的水平；以及
[0047] (b)將步驟（a)中測(cè)定的生腱蛋白C水平與一個(gè)或多個(gè)參考值相比較。
[0048] (c)
[0049] 優(yōu)選地，樣品是血清樣品或血漿樣品。優(yōu)選地，樣品中生腱蛋白C水平是至少31ng 每毫升樣品、或者至少33ng每毫升樣品。優(yōu)選地，參考值是來自未患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的個(gè) 體的血漿或血清樣品中的生腱蛋白C數(shù)值。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，上述所指的所有優(yōu) 選的特征還可以應(yīng)用于該方法和本發(fā)明的每個(gè)方面。
[0050] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于確定個(gè)體炎性紊亂狀態(tài)的試劑盒，該試 劑盒包含至少一種用于測(cè)定由待測(cè)個(gè)體提供的樣品中生腱蛋白C水平的試劑。
[0051] 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑盒用于確定個(gè)體的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)、尤其是侵 蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)，該試劑盒包含至少一種用于測(cè)定由待測(cè)個(gè)體提供的樣品中生腱蛋 白C水平的試劑。
[0052] 該試劑可以是抗體。
[0053] 試劑盒可以包含以標(biāo)簽或者單獨(dú)插頁形式記載合適工作參數(shù)的說明書。說明書可 以告訴消費(fèi)者如何收集樣品。
[0054] 試劑盒可以包含一個(gè)或多個(gè)生腱蛋白C樣品，用作用于校準(zhǔn)和對(duì)比的標(biāo)準(zhǔn)。試劑 盒還可以包含用于將樣品中檢測(cè)到的生腱蛋白C水平與校準(zhǔn)樣品或者圖表比較的說明書。 試劑盒還可以包括用于顯示什么樣的生腱蛋白C水平是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎的征候的說明書。
[0055] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了血液或者血清樣品中生腱蛋白C水平測(cè)定的用 途，其可作為評(píng)價(jià)個(gè)體中炎性紊亂狀態(tài)的手段。
[0056] 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了血液或者血清樣品中生腱蛋白C水平測(cè) 定的用途，其可作為評(píng)價(jià)個(gè)體中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)的手 段。
[0057] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療個(gè)體中炎性狀況比如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤 其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括：測(cè)定來自個(gè)體的樣品中生腱蛋白C水平以 及實(shí)施炎性治療，尤其實(shí)施針對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或者侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的以觀察到的生腱 蛋白C水平為基礎(chǔ)的治療。優(yōu)選地，如果生腱蛋白C水平高于參考樣品中的水平，就實(shí)施治 療。參考樣品可以是來自不具有炎性狀況的正常個(gè)體的樣品。如果生腱蛋白C水平大于 31ng/ml、優(yōu)選地大于33ng/ml，就可以實(shí)施治療。如果生腱蛋白C水平大于31ng/ml、優(yōu)選 大于33ng/ml，則可以實(shí)施抗TNF療法的替代療法。該替代療法可以是上述療法之一。
[0058] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎的方法，該方法包括：測(cè)定來自待測(cè)個(gè)體的樣品中的生腱蛋白C水平；如果生腱蛋白C 水平大于參考樣品中的水平但小于33ng/ml、優(yōu)選小于31ng/ml，則實(shí)施抗TNF療法。
[0059] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎的方法，該方法包括：測(cè)定來自待測(cè)個(gè)體的樣品中的生腱蛋白C水平；如果生腱蛋白C 水平大于31ng/ml、優(yōu)選大于33g/ml，則實(shí)施除抗TNF療法之外的療法。
[0060] 該替代療法可以是抗IL-17療法、或者上述替代療法中的任何一種。
[0061] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，本發(fā)明的任何一個(gè)實(shí)施方式和/或方面的優(yōu)選特征可 以應(yīng)用于本發(fā)明的所有其它實(shí)施方式和/或方面。
[0062] 通過給出的實(shí)施例，參照下述各圖，本發(fā)明將被更詳細(xì)作進(jìn)一步描述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0063] 圖1顯示了在患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人中生腱蛋白C水平顯著升高。在該研究中 考慮52個(gè)病人，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的86.6%顯示出具有異常高的（顯著升高的）生腱蛋 白C水平。結(jié)果顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的平均生腱蛋白C值是87. 87ng/ml血清，而正常 人群的平均生腱蛋白C值是20. 34ng/ml血清。患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人的95%置信界限 是31ng/ml，因此得出如下結(jié)論：高于31ng/ml血清的生腱蛋白C水平是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的征 候。
[0064] 圖2是Western blot,顯示了在患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)的病人中生腱蛋白C的循 環(huán)水平（circulating level)。圖2A顯不了在來自RA病人的基準(zhǔn)樣品（baseline samples) 中，觀察到一個(gè)主要的320kDa的TNC條帶（η = 18)。通過ELISA檢測(cè)到的相同樣品中的相 應(yīng)TNC水平以pg/mL為單位顯示在印跡下方。在健康對(duì)照血漿（N)中檢測(cè)到低水平的TNC。 rhTNC = 0. 05 μ g人重組TNC。圖2B顯示，在使用抗生腱蛋白C抗體（TNC)進(jìn)行Western blotting時(shí)，除在320kDa下檢測(cè)到的主要條帶，還有MW219、201、190和156kDa的條帶存在 于一些RA病人的血楽中。對(duì)于每個(gè)RA樣品，同一個(gè)膜的麗春紅（Ponceau S)染色顯示出 相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)加載。
[0065] 圖3顯示，生腱蛋白C水平與當(dāng)前使用的關(guān)節(jié)炎的CRP標(biāo)志物及抗CCP標(biāo)志物之 間沒有相關(guān)性。因此顯示出生腱蛋白C是可供選擇的和改進(jìn)的生物標(biāo)志物，尤其是用于類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、具體地講用于侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物。在該研究中考慮52個(gè)病 人，并且將生腱蛋白C的血清水平與CRP和抗CCP的血清水平相比較。TNC水平與CRP及抗 CCP之間沒有關(guān)聯(lián)，表明生腱蛋白C是一種獨(dú)特的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎生物標(biāo)志物。
[0066] 圖4顯示，患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人血清中的生腱蛋白C表達(dá)水平與在病人關(guān)節(jié) 中觀察到的侵蝕程度之間有相關(guān)性，X軸代表觀察到的骨侵蝕數(shù)目。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示，血清 中生腱蛋白C水平表明在關(guān)節(jié)中存在骨侵蝕，并且生腱蛋白C血清水平越高，則觀察到的侵 蝕就越多。
[0067] 圖5顯示，當(dāng)患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人被分成具有異常的血清中生腱蛋白C水平 (也就是說，大于31ng/ml)的患者和具有正常的生腱蛋白C水平（血清中生腱蛋白C水平 為0-31ng/ml)患者時(shí)，具有異常的生腱蛋白C水平的病人具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上提高的侵蝕評(píng)分。 因而表明，血清中的生腱蛋白C水平是一種好的用于侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物。
[0068] 圖6A-6C顯示，生腱蛋白C水平與觸痛及腫脹關(guān)節(jié)數(shù)（通過GP計(jì)數(shù)）之間沒有 相關(guān)性（圖6A)，或者與整體評(píng)估分?jǐn)?shù)（醫(yī)生整體評(píng)估，醫(yī)生按標(biāo)度1-10來評(píng)定病人疾病 活性）之間（圖6B)或生物化學(xué)標(biāo)志物CRP或者與紅細(xì)胞沉降率（ESR)之間沒有相關(guān)性 (圖6C)。CRP是在炎癥中升高的急性期蛋白質(zhì)，并且是炎癥的非專一性標(biāo)志物，其水平通過 ELISA測(cè)量。ESR是在1小時(shí)的周期內(nèi)紅細(xì)胞沉積的速率，并且是炎癥的非專一性測(cè)量值。 為了進(jìn)行測(cè)試，抗凝的血液被置于被稱為Westergren試管的直立試管中，測(cè)量紅細(xì)胞下落 的速率并且以mm/h為單位報(bào)告。ESR取決于在促沉積因子（主要為纖維蛋白原）與阻止淀 積的因子（即紅血球的負(fù)電荷（動(dòng)電位））之間的平衡。當(dāng)炎性過程出現(xiàn)時(shí)，血液中高比例 的纖維蛋白原會(huì)引起紅細(xì)胞彼此粘附。
[0069] 圖7顯示了在7個(gè)患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人中抗TNF療法Infliximab?(英夫利 昔單抗）和氨甲蝶呤（MTX)對(duì)于生腱蛋白C水平的影響。結(jié)果顯示，這些療法對(duì)于生腱蛋 白C幾乎沒有長(zhǎng)期影響。
[0070] 圖8詳細(xì)列出了人類生腱蛋白C的氨基酸序列。
[0071] 圖9表明，處于基準(zhǔn)線的生腱蛋白C水平預(yù)示在開始Infliximab (抗TNF)治療后 16-18周和54周RA病人的將來的觸痛關(guān)節(jié)數(shù)。通過ELISA分析在分組A中處于基準(zhǔn)線的 (進(jìn)入試驗(yàn)的）來自RA病人的血清的生腱蛋白C水平。在接受Infliximab療法后16-18 周（A)和54周（B)，用專業(yè)人員測(cè)定到的這些病人的觸痛關(guān)節(jié)數(shù)顯示生腱蛋白C水平。通 過Spearman等級(jí)相關(guān)分析確定顯著性。分組A包括根據(jù)ACR1987標(biāo)準(zhǔn)具有侵蝕性RA診斷 的病人，具有持續(xù)〇. 5至3年的癥狀。分組B包括具有RA診斷的病人，疾病活性得分處于 中等水平或更高水平。

【具體實(shí)施方式】
[0072] 患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人與正常/對(duì)照個(gè)體比較的生腱蛋白C水平的評(píng)估
[0073] 自患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人的血液以及正常個(gè)體獲得血清，并且在-80°C下儲(chǔ)存 直到使用。在分析當(dāng)天，血清在冰上解凍，以1 : 50的比例通常地稀釋在EIA緩沖液（1% BSA，PBS中0.05%吐溫20)，為了用于ELISA。ELISA試劑盒購(gòu)自IBL (目錄編號(hào)27751)，用 于檢測(cè)人類生腱蛋白C的高分子量變體。100 μ L的稀釋血清在預(yù)先涂有未標(biāo)記的捕獲抗生 腱蛋白C抗體的ELISA板上孵育，一式兩份在37°C下孵育60分鐘。ELISA板（在0. 001 %吐 溫20/PBS中）洗滌7次，每個(gè)孔中加入用HRP標(biāo)記的抗人類生腱蛋白C抗體（100 μ L)。這 些孔然后于4°C下孵育30分鐘，并且然后用0. 001 %吐溫20/PBS洗滌9次。然后將100 μ L 色原（提供的ΤΜΒ溶液）添加至每個(gè)孔，并且避光孵育30分鐘或者直至判斷變色充分。通 過加入100 μ LIN H2S04終止反應(yīng)。使用MultiScan板分析器在450nm讀取變色，并且使用 Ascent version2. 6計(jì)算出生腱蛋白C的濃度。使用由ELISA板（24-0. 38ng/ml)提供的、 由生腱蛋白C產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)。
[0074] 上述ELISA是在自52個(gè)患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人獲得的血清樣品上、以及自20 個(gè)沒有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎跡象的正常對(duì)照個(gè)體獲得的血清樣品上進(jìn)行。結(jié)果如圖1所示，顯示 出在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人中具有顯著更高的生腱蛋白C水平，得出如下結(jié)論：大于31ng/ml血 清生腱蛋白C水平或大于33ng/ml血清的生腱蛋白C水平是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的征候。
[0075] Western blotting顯示，存在于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人樣品中的生腱蛋白C的主要形 式具有320kDa的質(zhì)量（圖2A)，但在一些病人中也觀察到生腱蛋白C的次要的、較小的形式 (圖 2B)。
[0076] 使用下述方法得到了圖2中Western blot數(shù)據(jù)。1 μ L的血清或者血漿在4-12% Bis-Tris預(yù)先燒注的聚丙烯酰胺凝膠（Invitrogen公司，Life Technologies,帕斯力，英 國(guó)）上進(jìn)行電泳。蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（Amersham公司，GE保健公司，查爾芬 特，英國(guó)）上，并且使用麗春紅染色（Sigma Aldrich公司，格林漢姆，英國(guó)）顯像。在用 丁85/0.01%吐溫洗滌以除去染色劑后，膜在5%85八八85-吐溫中于室溫下被封閉1小時(shí)， 并且與初級(jí)抗體以1 : 1000稀釋度在37°C下孵育1小時(shí)，該初級(jí)抗體可識(shí)別人類TNC的N 端區(qū)域（MAB1908，Merck Millipore公司，沃特福德，英國(guó)）。被辣根過氧化物酶共軛的抗 小鼠 IgG(DAK0公司，伊利，英國(guó)）被用作第二抗體，稀釋度為1 : 3000。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光 試劑盒（Amersham公司，GE保健公司）檢測(cè)被結(jié)合的抗體，并且在Super RX醫(yī)用X線膠片 (富士公司，日本）上顯像。
[0077] 在患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人中的生腱蛋白C水平與骨侵蝕水平之間的相關(guān)性
[0078] 為了顯示在病人血清中生腱蛋白C水平與侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎之間的相關(guān)性，將 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人中的侵蝕水平與血清中循環(huán)生腱蛋白C水平相比較。
[0079] 使用超聲和功率多普勒成像測(cè)量侵蝕，按照TaylorPC在Rheumatology (牛津大 學(xué)），2005 年6月；44(6):721-8 和Epub2005 年l月ll日綜述中描述的方法。
[0080] 根據(jù)圖4可以看出，當(dāng)比照著生腱蛋白C水平繪制侵蝕評(píng)分時(shí)，觀察到顯著相關(guān) 性。
[0081] 通過將具有血清中異常生腱蛋白C水平（也就是說，大于31ng/ml)的患有類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎的病人的侵蝕評(píng)分與具有正常生腱蛋白C水平（血清中生腱蛋白C水平為0-31ng/ ml)的患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人的侵蝕評(píng)分相比較，圖5進(jìn)一步表明與侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎有更強(qiáng)的相關(guān)性。具有異常生腱蛋白C水平的病人顯示出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上提高的侵蝕評(píng) 分。因而表明，血清中的生腱蛋白C水平是一種好的侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物。
[0082] 此外，沒有觀察到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的其它測(cè)量值與生腱蛋白C水平之間的顯著相關(guān) 性（圖6A-6C)，這進(jìn)一步表明血清中生腱蛋白C水平是一種好的用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是 侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物。
[0083] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療對(duì)于生腱蛋白C水平的影響
[0084] 如圖7所示，當(dāng)前使用的用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療未表現(xiàn)出對(duì)生腱蛋白C水平有 任何影響。
[0085] 高的血清生腱蛋白C是在Infliximab治療的病人中未解決的關(guān)節(jié)觸痛的預(yù)示
[0086] 不管采用抗TNF試劑療法例如Inf liximab的重大進(jìn)步，但使用抗TNF試劑治療的 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的大部分沒有響應(yīng)并且繼續(xù)獲得關(guān)節(jié)侵蝕和提高的DAS28評(píng)分。鑒于 生腱蛋白C水平與侵蝕評(píng)分的相關(guān)性、以及Infliximab對(duì)于循環(huán)生腱蛋白C水平的影響， 進(jìn)行研究以便確定生腱蛋白C水平是否用作Infliximab治療的病人的將來疾病進(jìn)展的預(yù) 示。在基準(zhǔn)生腱蛋白C水平或者在療法開始后第18或52周的生腱蛋白C水平變化與對(duì) Infliximab的反應(yīng)之間沒有關(guān)系。然而，在處于基準(zhǔn)線的生腱蛋白C水平與Infliximab治 療的病人在開始治療后第16-18周和54周的后續(xù)的TJC評(píng)分之間可見顯著的相關(guān)性（圖 9)。因此，這些數(shù)據(jù)提示，在開始Infliximab療法之前具有較高生腱蛋白C水平的病人很 可能與未解決的關(guān)節(jié)觸痛有關(guān)，盡管進(jìn)行了 Infliximab療法。
[0087] 結(jié)果表明，在開始抗TNF治療之前的血清中生腱蛋白C水平可早在提前一年時(shí)作 為病人中觸痛關(guān)節(jié)數(shù)的預(yù)示，并且可以將可能受益于抗TNF治療的病人與那些不大可能有 響應(yīng)的病人區(qū)別開來。
[0088] 此外，圖2中顯示的結(jié)果表明，在患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 的病人的血清中生腱蛋白C的主要變體是質(zhì)量為320kDa的亞型，其構(gòu)成占支配地位的"大 亞型"。生腱蛋白C是大的多模型分子。它包含許多不同的結(jié)構(gòu)域，包括裝配結(jié)構(gòu)域、一系列 14個(gè)半表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)片段、一系列多達(dá)17個(gè)III型粘連蛋白樣重復(fù)片段（TNIII)、 以及纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。生腱蛋白C被單個(gè)基因編碼，該基因被可選地拼接以便產(chǎn)生大 小范圍為190-320kDa的單體。這特別地發(fā)生在TNIII結(jié)構(gòu)域中；TNIII結(jié)構(gòu)域中的8個(gè)被 組成性地表達(dá)（TNIII1-8)，并且TNIII結(jié)構(gòu)域中的9個(gè)能夠被可選地拼接（Al-4、B、AD2、 AD1、(^PD)。
【權(quán)利要求】
1. 一種確定待測(cè)個(gè)體的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)的方法，該方法包括下述步驟： (a) 測(cè)定來自所述待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C的水平；以及 (b) 將步驟（a)中測(cè)定的生腱蛋白C水平與一個(gè)或多個(gè)參考值相比較。
2. -種確定待測(cè)個(gè)體中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)展、或者類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎對(duì)于特定治療的反應(yīng)的 方法，該方法包括下述步驟： (a) 測(cè)定來自所述待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C的水平；以及 (b) 將步驟（a)中測(cè)定的生腱蛋白C水平與一個(gè)或多個(gè)參考值相比較。
3. -種確定用于患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的待測(cè)個(gè)體的合適治療的方法，該方法包括下述步 驟： (a) 測(cè)定來自所述待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C的水平；以及 (b) 將步驟（a)中測(cè)定的生腱蛋白C水平與一個(gè)或多個(gè)參考值相比較； (c) 使用步驟（b)中的結(jié)果來確定最合適的療法。
4. 如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是侵蝕性 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，用于確定或者診斷患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的待測(cè)個(gè)體是否患 有侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
6. 如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品是血液樣品，比如全 血樣品、血漿或者血清。
7. 如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，與參考水平相比，樣品中生腱 蛋白C約50%或更多的提高即是炎性紊亂，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎的征候。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述參考水平是正常樣品中的水平。
9. 如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，超過33ng生腱蛋白C每毫升 血清的水平即是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的征候。
10. 如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，超過31ng生腱蛋白C每毫升 血清的水平即是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的征候。
11. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，來自待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C水平相 比正常個(gè)體中水平的提高，表明使用抗TNF藥物是不合適的。
12. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，來自待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C水平相 比正常個(gè)體中的水平的提高，表明使用抗IL17療法或者另一種非抗TNF療法是合適的。
13. 如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，樣品中生腱蛋白C水平是至少31或 33ng/ml 血清。
14. 如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其在體外進(jìn)行。
15. 如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)個(gè)體是哺乳動(dòng)物。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
17. -種用于確定個(gè)體的侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)的試劑盒，該試劑盒包含至少一種 用于測(cè)定由待測(cè)個(gè)體提供的樣品中的生腱蛋白C水平的試劑。
18. 如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑是抗體。
19. 如權(quán)利要求17或18中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包括以標(biāo)簽或插頁形式記載合適操 作參數(shù)的說明書。
20. 如權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)生腱蛋白C樣品， 用作于校準(zhǔn)和對(duì)比的標(biāo)準(zhǔn)。
21. 生腱蛋白C作為用于侵蝕性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的血清生物標(biāo)志物的用途。
22. 血液或者血清樣品中生腱蛋白C水平測(cè)定的用途，作為評(píng)價(jià)個(gè)體中侵蝕性類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎狀態(tài)的手段。
23. 血液或者血清樣品中生腱蛋白C水平測(cè)定的用途，作為評(píng)價(jià)個(gè)體中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 狀態(tài)、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎狀態(tài)的手段。
24. -種治療待測(cè)個(gè)體中炎性狀況例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的 方法，該方法包括：測(cè)定來自待測(cè)個(gè)體的樣品中的生腱蛋白C水平和實(shí)施炎證治療，尤其是 基于觀察到的生腱蛋白C水平實(shí)施用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或者侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。
25. -種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括：測(cè)定來 自待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C水平；如果生腱蛋白C水平大于參考樣品中的水平、但小于 33ng/ml、優(yōu)選小于31g/ml，則實(shí)施抗TNF療法。
26. -種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、尤其是侵蝕性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括：測(cè)定來 自待測(cè)個(gè)體的樣品中生腱蛋白C水平；如果生腱蛋白C水平大于31ng/ml、優(yōu)選大于33ng/ ml，則實(shí)施除抗TNF療法之外的療法。
27. 基本上按照本文中參考實(shí)施例和附圖而描述的方法。
28. 基本上按照本文中參考實(shí)施例和附圖而描述的用途。
29. 基本上按照本文中參考實(shí)施例和附圖而描述的用途。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104105967SQ201280068536
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月12日
【發(fā)明者】金·蘇姍妮·米德伍德 申請(qǐng)人:Isis創(chuàng)新有限公司