專利名稱：淋球菌ng檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種淋球菌(NG)檢測(cè)試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的NG-DNA檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
奈瑟淋球菌(Neisseria gonorrheae, NG) 1879年由Neisser發(fā)現(xiàn),俗稱淋病雙球菌或淋球菌，是引起人類淋病的致病病原體，屬奈瑟菌屬。淋球菌(NG)有嚴(yán)格的人類寄生性，對(duì)人體有較強(qiáng)的適應(yīng)和侵襲能力，其主要致病物質(zhì)包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，是發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率較高的性傳播疾病之一。NG主要通過(guò)性接觸直接感染，也可以通過(guò)接觸患者的衣物或馬桶等間接感染，還可以通過(guò)產(chǎn)道感染分娩時(shí)的胎兒。淋病是世界上發(fā)病人數(shù)較多的性病之一，估計(jì)每年世界的患病人數(shù)大約有I億；在美國(guó)，據(jù)保守的估計(jì)，每年至少發(fā)生100萬(wàn)例患者。我國(guó)在解放后不久淋病基本消滅，但是從1977年起淋病死灰復(fù)燃，并迅速蔓延到全國(guó)各地，在短短的幾年時(shí)間里報(bào)告病例數(shù)迅速攀升，至九十年代中期達(dá)到高峰，此后其發(fā)病水平開(kāi)始緩慢回落，但仍然維持在較高水平。近年來(lái)，淋病的發(fā)病水平又呈上升的勢(shì)頭，在性傳播疾病中位居前列。由NG感染引起的疾病是性傳播疾病中的一種重要疾病，由于NG感染者臨床癥狀不典型，如何快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)疾病的診斷、治療和控制等有著十分重要的意義。目前淋球菌的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有分離培養(yǎng)法、涂片鏡檢法、免疫學(xué)方法、基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法等。分離培養(yǎng)法的操作簡(jiǎn)單，特異性較高，被認(rèn)為是診斷淋球菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是培養(yǎng)耗時(shí)比較長(zhǎng)，同時(shí)敏感性較低，可能因病原微生物的量過(guò)少，或接種后病原微生物不成活而延誤病情。涂片鏡檢法簡(jiǎn)便易行，價(jià)格低廉，但其特異性受取材、涂片、染色等各種因素的影響，且鏡下淋病雙球菌極易與其他的革蘭氏陰性雙球菌混淆，易發(fā)生誤診和漏診。免疫學(xué)方法主要包括酶聯(lián)吸附試驗(yàn)和免疫膠體金技術(shù)，操作簡(jiǎn)單且靈敏性優(yōu)于培養(yǎng)法。近年來(lái)，聚核酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(`PCR)法漸漸顯現(xiàn)了其在檢測(cè)上的優(yōu)勢(shì)，熒光PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)患者治療前、后病原體動(dòng)態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過(guò)程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問(wèn)題，減少了污染。定量PCR的出現(xiàn)，打破PCR只能定性的局面，其中熒光定量PCR以其高靈敏度、高特異性、低污染率、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，可為臨床提供更加準(zhǔn)確、客觀的檢測(cè)結(jié)果，并及時(shí)地了解病情及預(yù)后。運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)主要涉及到兩個(gè)方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對(duì)淋球菌的核酸進(jìn)行提取，具體是先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板；該方法核酸提取過(guò)程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)，經(jīng)過(guò)煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對(duì)于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污；另外，對(duì)于濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無(wú)法看到，能看到沉淀是因?yàn)樵摬襟E將核酸與蛋白都濃縮了，這樣會(huì)導(dǎo)致后面加入裂解液時(shí)很難充分混勻；無(wú)法看到沉淀的則使操作者無(wú)法確定吸棄上清時(shí)會(huì)不會(huì)吹打到核酸。臨床上檢測(cè)NG-DNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)(即Ct值)以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值(即定量檢測(cè))。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng);如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外已有基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)NG-DNA的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸，且其檢測(cè)靈敏度不高，約在50(Tl000COpies/ml左右；另外，這些試劑盒大多缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種核酸釋放劑在淋球菌NG檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) O. OI O. 5mM/L,氯化鉀20^300mM/L,十二烷基磺酸鈉O. OI 2%和乙醇
O.05 1%。在本發(fā)明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領(lǐng)域常用的，例如為無(wú)菌水或TE緩沖液。本發(fā)明首次披露在淋球菌NG檢測(cè)中使用含強(qiáng)蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡(jiǎn)化了該核酸檢測(cè)的步驟，而且檢測(cè)靈敏度有了很大的提高。本發(fā)明提供一種淋球菌NG檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉O. 0Γ2%和乙醇O. 05^1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游弓I物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。使用本發(fā)明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提??；本發(fā)明試劑盒檢測(cè)淋球菌NG的靈敏度可達(dá)400copies/ml，檢測(cè)線性范圍為400 4. 00E+10copies/ml。具體地，用于靶多核苷酸的探針序列為5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’;優(yōu)選用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’和5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’。本發(fā)明的試劑盒因采用用于檢測(cè)靶多核苷酸的上述引物和/或探針序列，具有很好的特異性。本發(fā)明中，優(yōu)選所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)的序列為5’_GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。本發(fā)明中所述內(nèi)標(biāo)為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為97堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，它作為PCR擴(kuò)增體系中的陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，預(yù)防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質(zhì)導(dǎo)致的假陰性。在所述試劑盒中包含內(nèi)標(biāo)的情況下，所述PCR反應(yīng)液中還包括用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針；且優(yōu)選內(nèi)標(biāo)探針的序列為5’ -TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’ 。優(yōu)選本發(fā)明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和O. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產(chǎn)物，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用，從而防止樣本檢測(cè)假陽(yáng)性。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述試劑盒中還包括NG陽(yáng)性對(duì)照、NG陰性對(duì)照和NG定
量參考品O本發(fā)明還提供一種淋球菌檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’和5， -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3，。本發(fā)明又提供一種淋球菌檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷 酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的探針序列為5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。本發(fā)明還具體提供一種淋球菌檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、內(nèi)標(biāo)、酶混合液、NG陽(yáng)性對(duì)照、NG陰性對(duì)照和NG定量參考品；且所述核酸釋放劑中包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉O. θΓ2%,乙醇
O.05^1%和溶劑TE緩沖液；所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增和檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針，用于內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增和檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針，10XPCR反應(yīng)緩沖液，脫氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP ;所述內(nèi)標(biāo)為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為97堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。本發(fā)明提供的NG熒光PCR檢測(cè)試劑盒操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)生殖道分泌物等未知樣本中的NG-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為診斷淋球菌感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。其檢測(cè)結(jié)果可用于NG感染的輔助診斷以及藥物療效的觀察，為性病的早期診斷以及性病高危人群的初篩提供分子診斷依據(jù)。


圖1中①為實(shí)施例中淋球菌NG-DNA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的待測(cè)樣本的擴(kuò)增曲線，圖1中②為實(shí)施例中NG-DNA檢測(cè)結(jié)果為陰性的待測(cè)樣本的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式以下僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)范圍內(nèi)，可很容易進(jìn)行的改變或變化都涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書(shū)的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種具體的淋球菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，它包括如下組分①核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) O.1mM/L,氯化鉀100mM/L,十二燒基磺酸鈉(SDS) O. 1%, O. 1% 的乙醇。②內(nèi)標(biāo)(陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照)為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為97堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，濃度為5. 00E+05copies/ml,97堿基對(duì)的序列為5’ -GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。③PCR反應(yīng)液包括10XPCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1，O. 2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上、下游引物均為O. 3 μ mol/L，用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針為O. 3 μ mol/L,用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物均為O. 3 μ mol/L，用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針為O.1 μ mol/L。其中，所述10XPCR反應(yīng)緩沖液為包括pH7. 5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0. 2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP ;所述用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針是源于淋球菌核酸的保守區(qū)域的引物和探針，其堿基序列分別為上游引物5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’ ；下游引物5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’ ；探針5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATA GGGCTTG-3 ’ ；所述的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物探針序列分別為上游引物5’ -GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’ ；下游引物5’ -ACAAACGGGCAACATACCTTG-3’ ；探針5’-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’ 。④酶混合液包含5U/ μ I的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和IU/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。⑤NG定量參考品來(lái)源于使用NG企業(yè)定量線性參考品Lf L5定值后的NG強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒，該淋球菌定量參考品包括Α、B、C、D四個(gè)濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為 4. 00E+07copies/ml (Α)、4· 00E+06copies/ml (Β)、4· 00E+05copies/ml (C)、4.00E+04copies/ml (D)0⑥NG陽(yáng)性對(duì)照為臨床醫(yī)院收集的NG強(qiáng)陽(yáng)性樣本，其濃度為4. 00E+05copies/ml ο⑦NG陰性對(duì)照不含有淋球菌、單純皰疹病毒、沙眼衣原體、解脲脲原體以及人乳頭瘤病毒等的滅活陰性臨床樣本。實(shí)施例2本實(shí)施例提供上述實(shí)施例1所述試劑盒用于檢測(cè)生殖道分泌物等未知樣本中NG-DNA的操作步驟一、試劑準(zhǔn)備根據(jù)待測(cè)樣本、NG陰性對(duì)照、NG陽(yáng)性對(duì)照以及NG定量參考品Al的數(shù)量，按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液(38 μ I/人份)、酶混合液(2 μ I/人份)及內(nèi)標(biāo)1. O μ I/人份，充分混勻成PCR-mix，例如待測(cè)樣本為3人份時(shí)，一共需配制9人份(上述四者的人份數(shù)分別為3、1、I和4)的PCR-mix ;瞬時(shí)離心后備用。二、樣本處理1.方法A :樣本直接快速核酸釋放每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入核酸釋放劑2 5μ I (建議深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡)，各管依次加入待測(cè)樣本、NG陰性對(duì)照、NG陽(yáng)性對(duì)照及NG定量參考品A D各3飛μ 1，吸打3飛次混勻(輕輕吸打，避免出現(xiàn)氣泡)；間隔10分鐘以上，每管加入ΡΟ -π Χ4(Γ45μ 1，吸打混勻2-3次，蓋上管蓋(去除氣泡后)，2000rpm離心30秒。2.方法B :樣本經(jīng)高速離心濃縮后核酸釋放取20(Γ500 μ I待測(cè)樣本，13，OOOrpm離心5分鐘后吸棄上清，加入20^50 μ I核酸釋放劑，靜置10分鐘后，備用；每個(gè)PCR反應(yīng)管加入上述經(jīng)預(yù)處理的待測(cè)樣本、NG陰性對(duì)照、NG陽(yáng)性對(duì)照及NG定量參考品A D各5 10 μ I ;每個(gè)PCR反應(yīng)管加入PCR_mix4(T45 μ 1，蓋上管蓋(去除氣泡后)，2000rpm離心30秒。三、熒光PCR反應(yīng)與結(jié)果分析(在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行)I)將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱及定量參考品濃度。2)突光檢測(cè)通道選擇選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測(cè)NG ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比突光(PassiveReference)設(shè)置為 none。

3)熒光定量PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1:表I
權(quán)利要求
1.一種核酸釋放劑在淋球菌NG檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L，氯化鉀 2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉 O. 01 2% 和乙醇 O. 05 1%。
2.一種淋球菌NG檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0. Of 2%和乙醇0. 05^1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探針序列為5’-CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’ 和 5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求2 4中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)序列為 5，-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中還包括用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針；且內(nèi)標(biāo)探針的序列為5’ -TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3，。
7.根據(jù)權(quán)利要求2 4中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。
8.根據(jù)權(quán)利要求廣4中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括NG陽(yáng)性對(duì)照、NG陰性對(duì)照和NG定量參考品。
9.一種淋球菌檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5 ’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3 ’和5， -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3，。
10.一種淋球菌檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的探針序列為 5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種淋球菌(NG)檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。使用本發(fā)明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提?。槐景l(fā)明試劑盒檢測(cè)NG的靈敏度可達(dá)400copies/ml，檢測(cè)線性范圍為400~4.00E+10copies/ml；應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)生殖道分泌物等未知樣本中的NG-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為診斷淋球菌感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103060453SQ20131000907
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者戴立忠, 鄧中平, 李勃 申請(qǐng)人:湖南圣湘生物科技有限公司