專利名稱：一種耐大觀霉素淋球菌的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別涉及實時熒光PCR檢測。
背景技術：
淋病的病原體是淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae，簡稱為淋球菌或NG)，它對人的感染力強，既無有效疫苗，治愈后又無持久的免疫力，該病除了可引起泌尿生殖系統(tǒng)化膿性感染外，還會引起淋菌性眼炎、咽喉炎、直腸炎、盆腔炎等合并性或播散性感染。根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球每年淋病發(fā)病數(shù)約為2500萬；我國淋病的發(fā)病率較長期居性病發(fā)病率的前兩位，2003年淋病報病數(shù)為59776例，居需傳報傳染病發(fā)病率第四位。
正確和規(guī)范使用抗生素，能快速治愈淋病，避免淋病慢性化及遷延化，是淋病防治的主要手段。但是，由于抗生素的大量不規(guī)范運用，以及NG基因突變(如質粒介導耐藥、染色體突變耐藥)，致使臨床經(jīng)常發(fā)現(xiàn)淋病對多種抗生素產(chǎn)生耐藥，導致了淋病在人群中的長期存在和流行。美國CDC認為當一種抗生素對細菌的耐藥率大于5％，該藥就不應作為治療該病的第一線用藥，以按此為標準，現(xiàn)我國僅剩兩個臨床一線用藥(大觀霉素和頭孢三嗪)，上述藥物在我國的耐藥率分別為0.36％，0.46％，耐大觀霉素淋球菌在世界范圍內目前仍然少見。我國已加入了全球淋病耐藥監(jiān)測網(wǎng)，以密切監(jiān)測淋病對常見藥物耐藥性的動態(tài)變化，指導臨床用藥，具有重要意義。
常用藥敏試驗有紙片擴散法、瓊脂稀釋法、測β—內酰胺酶、耐藥基因檢測探針等，其中瓊脂稀釋法是WHO的標準方法，該方法測定各種抗生素對淋球菌的最小抑菌濃度(MIC)，前兩種方法先通過培養(yǎng)患者的樣本鑒定為淋球菌后，再用純菌來培養(yǎng)檢測，該方法培養(yǎng)周期長，試驗過程繁瑣；紙片擴散法受人為因素影響大，重現(xiàn)性和定量性不足；測β—內酰胺酶能檢測耐藥性的一個指標；耐藥基因檢測探針特異性強、靈敏度高、準確度好，是一個好的檢測耐藥性的方法。尤其是近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術可彌補上述不足。熒光定量PCR靈敏度高，特異性好，速度快，已在基因表達水平分析、病原體的定性檢測和定量檢測等方面得到廣泛應用，是當前病原體核酸檢測和序列分析的主要方法。國內目前也已有合格的乙肝、艾滋病、結核檢測的PCR試劑盒。
對于聚合酶鏈式反應來說，選擇待擴增的靶DNA的堿基序列是最為重要的。16S rRNA是原核生物中高度保守基因序列，大小為1500堿基對左右，具有(1)保守性高，在生物進化中比其他基因演變得慢，有“分子化石”之稱；(2)保守性是相對的，不同科、屬、種間都有不同程度的差異；(3)不能側向轉移；(4)大小適度，能滿足進行比較、擴增的要求。所以，通過聚合酶鏈式反應擴增檢測淋球菌，16SrRNA基因具有一定優(yōu)勢。在此基礎上設計的引物，可以對淋球菌高效擴增。
據(jù)最近的報道，導致淋球菌產(chǎn)生大觀霉素耐藥性的突變也發(fā)生在16SrRNA基因，突變區(qū)域與擴增區(qū)域的一致使得定量檢測和突變鑒定同時進行成為可能，但是目前尚未有報道確定可用于檢測耐大觀霉素淋球菌的特異性遺傳標記物序列，也沒有見到相應的方法或試劑盒能夠同時完成對淋球菌的檢測和耐大觀霉素突變區(qū)的鑒定。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種既能夠有效檢測淋球菌又可有效鑒定耐大觀霉素突變株的聚合酶鏈式反應方法及試劑盒。
技術方案本發(fā)明從淋球菌基因組中有目的的選出了一段約1500個堿基對的16S核糖體RNA基因(16S ribosomal RNA gene)(ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTHERAPY，May.2000，p.1365-1366)，適合作為特異性PCR檢測的擴增靶序列。
如本文所用，術語“16S ribosomal RNA gene”或“16S核糖體RNA基因”指編碼淋球菌16S核糖體RNA的核苷酸序列，其GenBank登錄號X07714，具體序列示于SEQ ID NO1。
本發(fā)明還提供一種同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，反應的步驟依次為
(1)抽提樣品的DNA；(2)將抽提的DNA作為模板，用一對正反引物進行PCR擴增；(3)檢測擴增產(chǎn)物以確定樣品中是否存在淋球菌株；(4)鑒定擴增產(chǎn)物是否存在突變以檢測大觀霉素耐藥性；其中，正引物與SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，反引物與SEQ ID NO1中所示的部分序列互補，長度范圍均為15-35個核苷酸。
本發(fā)明進一步提供同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法的優(yōu)選方案，即正反引物設計于SEQ ID NO2的兩端。
本發(fā)明提供上述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法的一種優(yōu)選方案為，所說引物中的一個為5’CATTAGTTGC CATCATTCG3’，另一個為5’CCCTCTGTAC CGACCATT 3’。
本發(fā)明還提供上述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法另一種優(yōu)選方案，即所述反應還含有兩個長度為15-30個核苷酸的探針，其中一個探針的序列與SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，另一個探針的序列與SEQ ID NO1中所示的部分序列互補。
上述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法的進一步優(yōu)選方案為，所述的兩個DNA探針序列分別為5’ACGTCAAGTC CTCATGGC3’和5’CGTGTGAAGC CCTGGTCAT 3’。
本發(fā)明還提供所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法的優(yōu)選方案，其反應的擴增產(chǎn)物的長度為70-160個核苷酸對。
本發(fā)明的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法的進一步優(yōu)選方案為，所述的步驟(3)是通過檢測熒光信號的強弱來定量檢測樣品中的淋球菌。
本發(fā)明的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法的進一步優(yōu)選方案為，所述的步驟(4)是通過檢測另一種熒光信號并與步驟(3)的熒光信號進行比對來定性檢測樣品中淋球菌的突變情況。
基于SEQ ID NO1和2，本發(fā)明不僅提供了一種利用聚合酶鏈式反應擴增16S核糖體RNA基因檢測耐大觀霉素淋球菌的方法，還提供一種快速定量檢測耐大觀霉素淋球菌的熒光定量PCR試劑盒。
本發(fā)明提供的含有上述的檢測淋球菌的遺傳標記物的試劑盒，試劑組成包括DNA裂解液、熒光定量反應液、定量校準品、陽性對照品、陰性對照品、突變對照品，其中，定量校準品是含有所述的SEQ ID NO2的136個核苷酸序列的質粒。
本發(fā)明的關鍵是使用了特異性擴增耐大觀霉素淋球菌遺傳標記物的引物對，所述的引物長度為15-35個核苷酸，且一個引物的序列SEQ ID NO3與SEQID NO1所示的部分序列相同，且另一個引物的序列SEQ ID NO4與SEQ ID NO1所示的部分序列互補，且擴增產(chǎn)物的長度為136bp。SEQ ID NO3和4分別對應于SEQ ID NO1的1120和1238bp位置。
本發(fā)明所述的特異性擴增耐大觀霉素淋球菌的引物以及檢測用探針，可根據(jù)遺傳標記物的序列SEQ ID NO1或2進行設計，并通過常規(guī)的DNA合成方法獲得，例如可以用商業(yè)化的DNA自動合成儀合成。
本發(fā)明的這些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發(fā)光物質進行標記。
為了減少假陽性，并完成耐大觀霉素突變區(qū)的檢測，還需對擴增產(chǎn)物用淋球菌特異性探針和耐大觀霉素突變特異探針同時進行雜交。一種優(yōu)選的探針是Taqman探針(見下文說明)，它可在PCR反應中直接實時地通過熒光信號反映擴增產(chǎn)物的存在與否以及產(chǎn)物拷貝數(shù)量的高低。
本發(fā)明的探針TaqMan是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此Taqman探針檢測的是積累熒光。
本發(fā)明提及的探針序列5’端用報告熒光基團如FAM(Carboxyfluorescein，6-羧基熒光素)或TET(Tetrachloro fluorescein，四氯-6-羧基熒光素)標記，3’端用淬滅熒光基團如TAMRA(Tetramethylrhodamine，6-羧基四甲基若丹明)或Dabcyl(4-(4’-惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸)標記后即可用于對耐大觀霉素淋球菌檢測的PCR反應。
雖然引物和探針與模板序列的完全互補是優(yōu)選的，但是本領域技術人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5’端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。利用這些有錯配堿基的相似引物、或者含有這些引物的試劑盒、以及使用這些引物的檢測方法都在本發(fā)明技術方案范圍之內，只要該引物擴增出的擴增產(chǎn)物包含有本發(fā)明的淋球菌16S核糖體RNA基因或其片段。
雖然擴增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產(chǎn)物的長度為7O-1000bp，較佳地為90-500bp，更佳地為100-300bp。
在一個優(yōu)選例中，本說明書提供一種快速定量檢測耐大觀霉素的熒光PCR試劑盒，該試劑盒的組成包括a)DNA裂解液，b)熒光定量反應液，c)定量校準品，d)陽性對照品，e)陰性對照品，f)突變對照品，具體為1)熒光定量反應液含有PCR緩沖液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液，特異性擴增淋球菌16S核糖體RNA基因遺傳標記物的引物和熒光探針(例如引物序列為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，熒光探針序列為SEQ ID NO5，SEQ ID NO6)；SEQ ID NO5熒光探針5’端標記的熒光報告基團是TET，SEQ ID NO6熒光探針5’端標記的熒光報告基團是FAM，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6熒光探針3’端標記的熒光淬滅基團是TAMRA；2)定量校準品是含有SEQ ID NO2中136個核苷酸片段構成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌中增殖。陽性對照品是淋球菌標準菌株NCTC83785(英國倫敦國家標準培養(yǎng)物收藏中心)培養(yǎng)物。突變對照品是臨床耐藥株培養(yǎng)物，從性病門診有癥狀淋病患者中分離。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，熒光定量反應液包含50mM KCl，10mMTris-HCl pH8.3(25℃)，2mM MgCl2，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，熒光探針各0.5pmol，0.2mM dNTPs、無菌雙蒸水和1.5個單位的Taq酶(ROCHE公司，瑞士)。其中引物為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，熒光探針為SEQ ID NO5，SEQ ID NO6所示的核苷酸序列，兩個熒光探針5’端標記的熒光報告基團分別是FAM、TET，3’端標記的熒光淬滅基團都是TAMRA。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，定量校準品是含有SEQ ID NO2共136個核苷酸片段構成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌中增殖。貯存濃度為4×109拷貝/μL，使用前10倍梯度稀釋。含有目的片段的質粒轉化大腸桿菌增殖后，用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量并稀釋至4×109拷貝/μL，-20℃保存。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH8.0，0.05mM EDTA，1％NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。
在本發(fā)明提供的檢測耐大觀霉素淋球菌的熒光定量PCR試劑盒中，有兩條兩端標記有熒光基團的特異性探針，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離靠近，5’端報告基團產(chǎn)生的熒光應為熒光共振能量轉移(FRET)而被3’端淬滅基團淬滅，故體系中檢測不到熒光。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切活性對熒光探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的FRET，報告基團所釋放的熒光可以被內置在定量PCR儀內的熒光計檢測，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈正比例關系。這種探針的設計即被稱為Taqman探針。
對淋球菌的定量可以通過與定量校準品的循環(huán)閾值(Ct，ThresholdCycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量底循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板數(shù)呈一定比例關系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多；相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用梯度定量校準品的Ct值制成標準曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。
本發(fā)明提供的檢測耐大觀霉素的熒光定量PCR試劑盒，經(jīng)過對各組分，如引物濃度、熒光探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優(yōu)化，將FQ-PCR技術和實時熒光PCR系統(tǒng)(icycler，Rotorgene)相結合。通過優(yōu)化方案，反復實驗，試劑盒完全可以滿足快速特異檢測耐大觀霉素淋球菌的實際需求。
本發(fā)明還進一步具體提供一種利用本發(fā)明試劑盒檢測耐大觀霉素淋球菌的方法，該方法包括如下檢測步驟a)用DNA裂解液從陽性對照品和待測樣本中提取DNA；b)分別取上步提取的DNA、梯度定量校準品加入熒光反應液中用實時熒光PCR儀進行擴增，同時在510nm和550nm條件下分別檢測；c)通過比較待測樣品和標準品510nm下的循環(huán)閾值而對待測樣品的起始拷貝數(shù)進行定量。
d)通過比較待測樣品550nm下的循環(huán)閾值和510nm下的循環(huán)閾值而對待測樣品的突變情況進行定性。
有益效果本發(fā)明從淋球菌基因組中發(fā)現(xiàn)一段約1500個堿基對的16S核糖體RNA基因，該基因為淋球菌本身特有的基因序列，編碼16S核糖體RNA。從臨床得到的耐大觀霉素淋球菌株均在16S核糖體RNA基因上發(fā)現(xiàn)了突變。其他物種，如大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌的大觀霉素耐藥性的原因也被確認是由各自的16S核糖體RNA基因發(fā)生突變導致的。因此，選擇這一特定的核酸序列作為引物，具有很好的特征性。
根據(jù)本發(fā)明所述的16S核糖體RNA基因設計的引物可在淋球菌的標準株及臨床標本中擴增出相應的DNA片段。而且，該引物未在其他相關病原體上擴增出相應片段，說明以16S核糖體RNA基因為基礎設計的PCR反應系統(tǒng)具有良好特異性。
本發(fā)明所設計的兩條淋球菌專一性核酸引物具有嚴格的種特異性。用本發(fā)明引物進行常規(guī)PCR反應，結果能從含有淋球菌的材料的DNA提取物中擴增出大小為136bp特異性PCR產(chǎn)物。因此，以本發(fā)明引物進行常規(guī)PCR反應，并通過判斷相應大小PCR產(chǎn)物的有無可以準確、快速地檢測淋球菌，而且所需的樣品量很少。
就敏感性而言，16S核糖體RNA基因在基因組中多拷貝存在。當以此序列為基礎設計引物并對淋病患者的臨床標本進行PCR擴增時，比單拷貝基因序列更能滿足臨床對檢出靈敏度的需要。
根據(jù)對臨床耐大觀霉素淋球菌株的基因序列分析，SEQ ID NO2所示的核苷酸序列包含了臨床發(fā)現(xiàn)的突變位點，是一種特別優(yōu)選的適合作為耐大觀霉素淋球菌特異性遺傳標志的序列。
將本發(fā)明的引物與Taqman探針技術結合，便得到了本發(fā)明的同時對耐大觀霉素淋球菌進行定性檢測和定量計數(shù)分析方法。本發(fā)明第一次揭示了擴增16S核糖體RNA基因檢測耐大觀霉素淋球菌的可能，同時提供了一種在此基礎上快速特異檢測耐大觀霉素淋球菌的熒光定量PCR試劑盒。該試劑盒對耐大觀霉素淋球菌的檢測操作簡單，僅需2～3小時。整個操作過程只需一人，一次可檢測32～96(實時熒光PCR儀型號決定)個樣品，減少了人力資源的浪費。同時，這種分析方法不僅克服了常規(guī)定量PCR方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。
另外，本發(fā)明與現(xiàn)常用的培養(yǎng)法相比具有以下主要優(yōu)點和效果a)檢測速度快，加上DNA的提取，2～3小時完成；b)熒光探針的存在，保證了檢測的特異性和靈敏度。
c)操作簡單，檢測淋球菌存在的同時完成突變鑒定；d)定量準確；
e)可同時進行高通量的樣品檢測。
本發(fā)明成功設計的關鍵在于導致淋球菌產(chǎn)生大觀霉素耐藥性的突變發(fā)生在相對保守的16S rRNA基因，突變區(qū)域與擴增區(qū)域的一致使得定量檢測和突變鑒定同時進行成為可能，故本發(fā)明的方法和試劑盒能夠同時完成對淋球菌的檢測和耐大觀霉素突變區(qū)的鑒定。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等著，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1分離用于PCR分析的淋球菌DNA為了從待測樣本中分離用于聚合酶鏈式反應檢測的淋球菌DNA，必須使用不影響聚合酶鏈式反應的簡單方法。首先，用滅菌生理鹽水漂洗臨床樣本(生殖泌尿道拭子)，將漂洗液15,000rpm離心15分鐘后棄上清，從而漂洗液中可能含有的淋球菌被收集起來。沉淀中加入DNA裂解液后，振蕩混勻，100℃沸水浴15分鐘，裂解淋球菌釋放DNA。最后15,000rpm離心15分鐘，DNA溶解至上清液中，取上清液作為用于PCR分析的淋球菌DNA。
實施例2檢測試劑盒的制備用常規(guī)方法制備一種快速定量檢測耐大觀霉素淋球菌的熒光PCR試劑盒，該試劑盒包括a)DNA裂解液，b)熒光定量反應液，c)定量校準品，d)陽性對照品，e)陰性對照品，f)突變對照品。其中1)熒光定量反應液含有PCR緩沖液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液，特異性擴增16S核糖體RNA基因遺傳標記物的引物序列為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，熒光探針序列為SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO5熒光探針5’端標記的熒光報告基團是TET，SEQ ID NO6熒光探針5’端標記的熒光報告基團是FAM，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6熒光探針3’端標記的熒光淬滅基團都是TAMRA。(擴增產(chǎn)物大小為136bp)
具體地，熒光定量反應液包含50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3(25℃)，2mM MgCl2，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，熒光探針各0.5pmol，0.2mM dNTPs、無菌雙蒸水和1.5個單位的Taq酶(ROCHE公司，瑞士)。
2)定量校準品是含有SEQ ID NO2共136個核苷酸的pGEM-T載體(該載體購自Promega公司，SEQ ID NO2插入β-內酰胺酶編碼區(qū))，且該載體可在大腸桿菌中增殖。陽性對照品是淋球菌標準菌株NCTC 83785(英國倫敦國家標準培養(yǎng)物收藏中心)培養(yǎng)物。突變對照品是臨床耐藥株培養(yǎng)物，從性病門診有癥狀淋病患者中分離。
具體地，定量校準品的貯存濃度為4×109拷貝/μL，使用前10倍梯度稀釋。含有目的片段的質粒轉化大腸桿菌增殖后，用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量并稀釋至4×109拷貝/μL，-20℃保存。
3)DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH8.0，0.05mM EDTA，1％NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。
實施例3用淋球菌進行聚合酶鏈式反應分別取實施例2中的熒光反應液各26μL加入到不同的PCR反應管中，將實施例1所得的DNA和定量校準品向熒光定量反應液中加入4μL，總體積30μL。在實時熒光定量PCR儀(澳大利亞Corbett，Rotor-Gene2000)上開始擴增檢測。擴增參數(shù)設置為變性溫度94℃10秒，退火延伸溫度63℃30秒的循環(huán)下，進行40個循環(huán)的PCR擴增。把熒光檢測的程序設置在每個循環(huán)的退火步驟結束時，檢測波長為510nm和550nm。
循環(huán)結束后，運用儀器配套軟件，510nm讀取待檢樣本拷貝數(shù)。結果為定量校準品4×106拷貝數(shù)/μL、4×105拷貝數(shù)/μL、4×104拷貝數(shù)/μL的Ct值分別為23.28、27.21、31.27；待測樣本的Ct值范圍為17～37，經(jīng)標準曲線換算定量范圍為1.81×108拷貝數(shù)/μL～1.2×103拷貝數(shù)/μL。具體結果如下表


這表明，本發(fā)明試劑盒中可在1.81×108拷貝數(shù)/μL～1.2×103拷貝數(shù)/μL的廣大范圍內擴增出耐大觀霉素淋球菌。
運用儀器配套軟件，550nm讀取待檢樣本拷貝數(shù)。結果為定量校準品4×106拷貝數(shù)/μL、4×105拷貝數(shù)/μL、4×104拷貝數(shù)/μL的Ct值分別為24.22、27.93、31.03；待測樣本中的550nm下Ct值與510nm下Ct值差異野生型淋球菌≤3，突變型淋球菌＞3。具體結果如下表

這表明，本發(fā)明試劑盒可有效鑒別淋球菌耐大觀霉素的突變情況。
實施例4用各種病原體進行聚合酶鏈式反應用實施例1-3相同的方法進行擴增檢測，不同點在于本實施例的反應模板選取其他可能出現(xiàn)在相近解剖位置的病原體的DNA，如沙眼衣原體、解脲支原體、人形支原體、金黃色葡萄球菌、人白細胞DNA。
檢測結果如下表

如上所述，本實施例對其他相近的病原體基因無交叉反應，可特異地擴增出淋球菌。
實施例5用各種病原體進行聚合酶鏈式反應重復實施例1-4的相同方法，不同點僅在于用SEQ ID NO7和8所示的引物替換SEQ ID NO3和4所示的引物。
檢測結果表明，該引物對同樣可以特異地擴增出耐大觀霉素淋球菌產(chǎn)物長度305堿基對。同時可以有效地鑒別淋球菌耐大觀霉素的突變情況。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司<120>一種耐大觀霉素淋球菌的檢測方法及試劑盒<130>040291<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1544<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>1tgaacataag agtttgatcc tggctcagat tgaacgctgg cggcatgctt tacacatgca60agtcggacgg cagcacaggg aagcttgctt ctcgggtggc gagtggcgaa cgggtgagta120acatatcgga acgtaccggg tagcggggga taactgatcg aaagatcagc taataccgca180tacgtcttga gagggaaagc aggggacctt cgggccttgc gctatccgag cggccgatat240ctgattagct ggttggcggg gtaaaggccc accaaggcga cgatcagtag cgggtctgag300aggatgatcc gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg360gggaattttg gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgtct gaagaaggcc420ttcgggttgt aaaggacttt tgtcagggaa gaaaaggctg ttgccaatat cggcggccga480tgacggtacc tgaagaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta540gggtgcgagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcggg cgcagacggt tacttaagca600ggatgtgaaa tccccgggct caacccggga actgcgttct gaactgggtg actcgagtgt660gtcagaggga ggtggaattc cacgtgtagc agtgaaatgc gtagagatgt ggaggaatac720cgatggcgaa ggcagcctcc tgggataaca ctgacgttca tgtccgaaag cgtgggtagc780aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccctaaacga tgtcaattag ctgttgggca840acttgattgc ttggtagcgt agctaacgcg tgaaattgac cgcctgggga gtacggtcgc900aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cggtggatga tgtggattaa960ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggt tttgacatgt gcggaatcct ccggagacgg1020aggagtgcct tcgggagccg taacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg1080agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc attagttgcc atcattcggt1140tgggcactct aatgagactg ccggtgacaa gccggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc1200ctcatggccc ttatgaccag ggcttcacac gtcatacaat ggtcggtaca gagggtagcc1260aagccgcgag gcggagccaa tctcacaaaa ccgatcgtag tccggattgc actctgcaac1320tcgagtgcat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcaggtca gcatactgcg gtgaatacgt1380tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggggatacc agaagtaggt1440agggtaaccg caaggagtcc gcttaccacg gtatgcttca tgactggggt gaagtcgtaa1500caaggtagcc gtaggggaac ctgcggctgg atcacctcct ttct1544<210>2<211>136<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>2cattagttgc catcattcgg ttgggcactc taatgagact gccggtgaca agccggagga60aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgacca gggcttcaca cgtcatacaa120tggtcggtac agaggg136<210>3<211>19<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>3cattagttgc catcattcg19<210>4<211>18<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae
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<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>8cgtattcacc gcagta1權利要求
1.一種同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述反應的步驟依次為(1)抽提樣品的DNA；(2)將抽提的DNA作為模板，用一對正反引物進行PCR擴增；(3)檢測擴增產(chǎn)物以確定樣品中是否存在淋球菌株；(4)鑒定擴增產(chǎn)物是否存在突變以檢測大觀霉素耐藥性；其中，正引物與SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，反引物與SEQ ID NO1中所示的部分序列互補，長度范圍均為15-35個核苷酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于正反引物設計于SEQ ID NO2的兩端。
3.根據(jù)權利要求2所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述引物中的一個為5’CATTAGTTGC CATCATTCG3’，另一個為5’CCCTCTGTAC CGACCATT 3’。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述反應還含有兩個長度為15-30個核苷酸的探針，其中一個探針的序列與SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，另一個探針的序列與SEQ ID NO1中所示的部分序列互補。
5.根據(jù)權利要求4所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的兩個探針序列分別為5’ACGTCAAGTCCTCATGGC 3’和5’CGTGTGAAGC CCTGGTCAT 3’。
6.根據(jù)權利要求4所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述反應的擴增產(chǎn)物的長度為70-160個核苷酸對。
7.根據(jù)權利要求4所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的步驟(3)是通過檢測熒光信號的強弱來定量檢測樣品中的淋球菌。
8.根據(jù)權利要求4所述的同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的步驟(4)是通過檢測另一種熒光信號并與步驟(3)的熒光信號進行比對來定性檢測樣品中淋球菌的突變情況。
9.含有權利要求1所述的檢測淋球菌的遺傳標記物的試劑盒，試劑組成包括DNA裂解液、熒光定量反應液、定量校準品、陽性對照品、陰性對照品、突變對照品，其特征在于定量校準品是含有所述的SEQ ID NO2的136個核苷酸序列的質粒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用遺傳標記物來同時檢測淋球菌及其耐大觀霉素突變位點的聚合酶鏈式反應方法及試劑盒，特別是選取淋球菌16S rRNA的核苷酸序列，設計出了特異性檢測的寡核苷酸引物和探針。本發(fā)明可方便、快速、準確地定性檢測和定量計數(shù)淋球菌，同時鑒別是否發(fā)生了淋球菌大觀霉素的突變。
文檔編號C12Q1/04GK1789430SQ20041009305
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月15日 優(yōu)先權日2004年12月15日
發(fā)明者張繼倫, 李超, 周煜, 夏懿 申請人:上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司