專(zhuān)利名稱(chēng)：SYBR Green法檢測(cè)解脲支原體感染的熒光PCR試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，在臨床樣本中檢測(cè)解脲支原體感染的熒光 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))試劑盒。
背景技術(shù)：
解脲支原體(ureaplasma urealyticum, UU)又稱(chēng)解脲脲原體，是一種原核微生物， 為脲原體屬中惟一的一種，因生長(zhǎng)需要尿素而得名。解脲支原體可引起泌尿生殖道感染，與 女性生殖道健康關(guān)系最為密切，被認(rèn)為是非淋球菌性尿道炎中僅次于衣原體(占50% )的 重要病原體。80 %孕婦的生殖道內(nèi)存在有解脲支原體。解脲支原體是人類(lèi)泌尿生殖道常見(jiàn)的共生微生物，為致病性比較弱的條件致病病 原體。在成人主要通過(guò)性接觸傳染，新生兒則由母親生殖道分娩時(shí)感染。成人男性的感染 部位在尿道黏膜，女性感染部位在宮頸。婦女妊娠后，由于孕激素的增加，抑制了細(xì)胞免疫， 機(jī)體抵抗力下降，更易受到解脲支原體的感染。主要引起非淋球菌性尿道炎(宮頸炎)、子 宮內(nèi)膜炎、絨毛膜羊膜炎、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、前列腺炎、附睪炎、不育癥、低體重新生兒、新生 兒肺炎、腦膜炎以及敗血癥等。解脲支原體感染造成的女性生殖器官病理性改變，是不孕不 育的重要原因。解脲支原體感染孕婦容易造成其流產(chǎn)，因此，對(duì)不明原因的流產(chǎn)，尤其是多 次流產(chǎn)者，應(yīng)考慮有解脲支原體感染的可能。解脲支原體感染造成的不完全梗阻的輸卵管 炎性粘連，可使管腔狹窄，通而不暢，還是發(fā)生宮外孕的重要原因。解脲支原體可以經(jīng)胎盤(pán) 垂直傳播或由孕婦下生殖道感染上行擴(kuò)散，引起宮內(nèi)感染，兩者均可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒 宮內(nèi)發(fā)育遲緩、低體重兒、胎膜早破，甚至造成胎死宮內(nèi)等一系列不良后果。解脲支原體基本為球形，亦可呈球桿狀或絲狀，因其在培養(yǎng)基上的菌落呈針尖大 小，菌體大小為0. 2 0. 3 μ m，須在低倍顯微鏡下觀察，故又稱(chēng)之為微小(tiny strain)支 原體，分子量4. 5X108,高度多形性，無(wú)細(xì)胞壁及前體，由三層蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的膜樣結(jié) 構(gòu)以及一層類(lèi)似毛發(fā)結(jié)構(gòu)組成，細(xì)胞器極少。在培養(yǎng)基上的菌落表面有粗糙顆粒，合適條件 下可轉(zhuǎn)成典型的“荷包蛋”樣菌落。解脲支原體生長(zhǎng)需要尿素和膽固醇，分解尿素為其典型 的代謝特征，尿素分解后產(chǎn)生氨氮，使培養(yǎng)基PH上升。解脲支原體基因組亦為環(huán)狀雙股DNA，全長(zhǎng)為200萬(wàn) 300萬(wàn)bp，G+C含量為 25.5%。幾乎所有ATP合成都是尿素水解的結(jié)果，產(chǎn)生一個(gè)產(chǎn)能的電化學(xué)梯度。解脲支原 體不編碼某些高度保守的eubacterial酶，包括細(xì)胞分裂蛋白FtsZ、Chaperonins GroES 及GroEL和核糖核苷二磷酸還原酶，解脲支原體有6個(gè)密切相關(guān)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體，其是通過(guò)基因 復(fù)制產(chǎn)生，提示其有一種在其他小基因組細(xì)菌所沒(méi)有的呼吸系統(tǒng)。目前解脲支原體的1 14標(biāo)準(zhǔn)血清型可被劃分為兩大生物群，其一包括血清型1、3、6和14，稱(chēng)之為生物群1或 Parvo，另一個(gè)則由其余各血清型組成，成為生物群2或T960。解脲支原體菌株的分群有助 于闡明生物群或血清型與疾病之間的可能聯(lián)系。目前市場(chǎng)上用于檢測(cè)解脲支原體的方法主要有分離培養(yǎng)方法，代謝抑制試驗(yàn)，間 接血凝試驗(yàn)，生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，分子生物學(xué)診斷方法。分子生物學(xué)診斷方法目前主要應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法及DNA探針技術(shù)作診斷?，F(xiàn)在正得到廣泛的應(yīng)用。熒光PCR技術(shù)在1995年由美國(guó)PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA 雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，能直接監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中的變化。與普 通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測(cè)，完全閉管操作，有效地降低了 PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。熒光PCR技術(shù)的熒光探針以發(fā)展形成多種類(lèi)型，如Taqman探針，F(xiàn)RET探針，SYBR Green法等，本方法涉及的是STOR技術(shù)。其工作原理是Green是一種結(jié)合于小溝中 的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物 的檢測(cè)非常理想。STOR Green的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nm。在 PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量STOR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒 光信號(hào)，而不摻入鏈中的STOR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加 與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

發(fā)明內(nèi)容
為克服傳統(tǒng)方法對(duì)UU檢測(cè)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種特異性高、成本低的檢測(cè)產(chǎn)
P
ΡΠ O本發(fā)明提供了一種檢測(cè)UU(解脲支原體)感染的熒光PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))試 劑盒，包括陰性參考品、陽(yáng)性對(duì)照品、熒光PCR反應(yīng)液以及DNA提取液；所述的熒光PCR反應(yīng) 液包括PCR分型引物。所述的陽(yáng)性對(duì)照品為含有插入U(xiǎn)U特異序列的PMD18-T載體質(zhì)粒，所述的插入序列 如下ACTCCTAOGG GAGGCAGCAG TAGGGAATTT TTCACAATGG GCGCAAGCCT TATGAAGCAA TGC0GCGTGAAOGATGAAGG TCTTATAGAT TGTAAAGTTC TTTATATGGG AAGAAACGCT AAGATAGGAA ATGATTTTAGTTTGACTGTA CCATTTGAAT AAGTATCGGC TAACTATGTG CCAGCAGCCN CGGTAATACA TAGGATGCAAGCGTTATCCG GATTTACTGG GCGTAAAACG AGCGC245bp所述的陽(yáng)性對(duì)照品重組質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果解脲支原體循環(huán)數(shù)小于30. 0。所述的陰性參考品為解脲支原體陰性血清。所述的PCR分型引物序列如下擴(kuò)增檢測(cè)解脲支原體的正向引物ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA 22 ；擴(kuò)增檢測(cè)解脲支原體的反向引物GCGCTCGTTTTACGCCCAGTA 21。所述的熒光PCR反應(yīng)液加入了 SBRY Green的熒光染料。可以通過(guò)熒光信號(hào)的收 集判斷有無(wú)解脲支原體的存在。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果①具有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直 觀，能直接監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中的變化。與普通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠 電泳檢測(cè)，完全閉管操作，有效地降低了 PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)；②STOR Green與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè) 計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低；③利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過(guò)熔點(diǎn)曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特異擴(kuò)增，進(jìn)一步地還可以實(shí)現(xiàn)單色多重測(cè)定；④檢測(cè)速度快，加上樣本提取總共僅需2-3個(gè)小時(shí)，操作步驟簡(jiǎn)單；⑤可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢測(cè)?？傊疅晒釶CR技術(shù)靈敏度高，特異性好，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)時(shí)間可控制在 兩個(gè)半小時(shí)以內(nèi)，而且是閉管操作，無(wú)需后續(xù)處理，可最大限度避免反應(yīng)產(chǎn)物污染，可以取 代傳統(tǒng)細(xì)胞檢測(cè)或者普通PCR檢測(cè)進(jìn)行UU的早期診斷。


圖為臨床樣本的UU熒光PCR擴(kuò)增曲線。所測(cè)得陽(yáng)性樣本Ct值小于35. 0。
具體實(shí)施例方式應(yīng)當(dāng)理解，下面實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員 常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或按照制造廠 商所建議的步驟和條件。實(shí)施例1 試劑盒的制備1.引物設(shè)計(jì)與合成使用I^rimer premier5. 0，針對(duì)UU的16S rRNA基因(此為解脲脲原體的保守區(qū) 域)，設(shè)計(jì)上下游引物。引物委托專(zhuān)業(yè)公司(生工)合成，其中引物為PAGE純化。擴(kuò)增序列如表1 表1.特異性引物序列
權(quán)利要求
1.一種STOR Green法檢測(cè)解脲支原體感染的熒光PCR試劑盒，包括陰性參考品、陽(yáng)性 對(duì)照品、Taq聚合酶、熒光PCR反應(yīng)液，以及DNA提取液；所述的熒光PCR反應(yīng)液包括解脲支 原體PCR分型引物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性對(duì)照品為含有插入解脲支原 體特異序列的PMD18-T載體質(zhì)粒，所述插入的特異序列如下ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TAGGGAATTT TTCACAATGG GCGCAAGCCT TATGAAGCAA TGCCGCGTGAACGATGAAGG TCTTATAGAT TGTAAAGTTC TTTATATGGG AAGAAACGCT AAGATAGGAA ATGATTTTAGTTTGACTGTA CCATTTGAAT AAGTATCGGC TAACTATGTG CCAGCAGCCN CGGTAATACA TAGGATGCAAGCGTTATCCG GATTTACTGG GCGTAAAACG AGCGC245bp。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性對(duì)照品重組質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié) 果解脲支原體循環(huán)數(shù)小于30. 0。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的陰性參考品為解脲支原體陰性血清。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR分型引物序列如下 擴(kuò)增檢測(cè)解脲支原體的正向引物ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA 22 ； 擴(kuò)增檢測(cè)解脲支原體的反向引物GCGCTCGTTTTACGCCCAGTA 21。
6.如權(quán)利要求1或5所述的試劑盒，其特征在于，所述的熒光PCR反應(yīng)液加入了SBRY Green的熒光染料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于SYBR Green法檢測(cè)解脲支原體感染的熒光PCR試劑盒，屬于體外核酸診斷試劑盒領(lǐng)域。該試劑盒包括陰性參控品、陽(yáng)性對(duì)照品、熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液、Taq聚合酶和DNA提取液。本發(fā)明包括一個(gè)以熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的PCR反應(yīng)體系，包含針對(duì)解脲支原體特異序列的正、反向引物和熒光染料SYBR Green，可以簡(jiǎn)便快速地在臨床樣本中檢測(cè)解脲支原體感染，特異性高，對(duì)解脲支原體的早期檢出有很大的臨床價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102094072SQ20091020039
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者汪寧梅, 穆宇豪, 穆海東, 黎颯 申請(qǐng)人:上海裕隆臨床檢驗(yàn)中心有限公司