水毒性檢測中發(fā)光細菌熒光行為的規(guī)范和數(shù)值解析的制作方法
【專利摘要】盡管發(fā)光細菌接觸毒物能夠很好的量化毒性，可是由于生物多樣性，其毒性量化數(shù)值非常難用于科學(xué)交流，無法用于實際水環(huán)境檢測和監(jiān)測。本發(fā)明極大提高了發(fā)光細菌用于毒理檢測的可重現(xiàn)性，如果檢測所使用同一種標(biāo)準(zhǔn)毒素和發(fā)光細菌劑型，試驗結(jié)果誤差小于10％。比如，使用凍干特定費氏弧菌(Aliivibrio?Fischeri)株來檢測苯酚(分析純)的毒性，其毒性檢測結(jié)果具有極高的可重現(xiàn)性，不因操作人員或者地域變化而改變，試驗結(jié)果誤差小于10％。完全可以被用作水體毒性的評估，其結(jié)果可以用于科學(xué)交流。通過對發(fā)光細菌長期的實驗室觀察和重復(fù)試驗，總結(jié)出了一套大大提高發(fā)光細菌用于毒理檢測的可重現(xiàn)性的方法，主要包括以下兩項發(fā)明：1)“發(fā)光細菌熒光行為規(guī)范”的辦法；2)在數(shù)值解析上改進來降低誤差。
【專利說明】水毒性檢測中發(fā)光細菌熒光行為的規(guī)范和數(shù)值解析
[0001]水毒性檢測中發(fā)光細菌熒光行為的規(guī)范和數(shù)值解析
1.【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明可以給任意未知水溶性毒素的生態(tài)毒性(ecotoxicity)在短時間(一個小時)內(nèi)定量，這些毒素包括無機鹽，有機化合物以及含有色彩的水；可以在沒有任何分析化學(xué)知識背景的情況下對水的毒性作出預(yù)警。簡單的說，不知道，也不關(guān)心是什么水溶物質(zhì)，但是想知道毒性到底有多大？生物(生態(tài))后果是什么？
[0003]本發(fā)明不適用于化學(xué)物質(zhì)致癌性或者病原體危險的評估和判斷；也不適合真核細胞受體的毒性反應(yīng)判斷，也稱藥理毒理。
[0004]本發(fā)明可能具有潛在誤導(dǎo)性，比如酒精在本檢測中結(jié)果為有毒，而實際酒精在環(huán)境中并無直接傷害，這是歸因酒精具有蛋白變性功能，也對人體器官有毒。
2.【背景技術(shù)】
[0005]水體環(huán)境的有毒污染源可以是多方面的，比如工業(yè)廢水的排放含有毒性，工業(yè)或者交通事故造成化學(xué)物質(zhì)河流污染，甚至污水本身沒有毒性，可是由于生物降解過程中破壞有機化合物的分子極性使得污水進入環(huán)境中后毒性陡增。這些情況下，很難短期內(nèi)對污水的化學(xué)性質(zhì)仔細分析，要求對給定污水樣本的沒有任何分析化學(xué)知識的情況下對水的毒性作出判斷，而這些判斷將直接指導(dǎo)行動。這個過程，時間珍貴。
[0006]在過去的水體毒性評估中，曾經(jīng)使用彩虹鱒魚(Oncorhynchus mikiss)或者水跳蚤(Daphnia magna)在水中的死亡率來量化水的毒性。可是彩虹鱒魚和水跳蚤的活性標(biāo)準(zhǔn)非常難以界定，而商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)的水生動物是非常的昂貴，無法在實際中使用。
[0007]發(fā)光細菌或者突光細菌(bioluminescentbacteria或者 luminescent bacteria)的發(fā)光行為和其呼吸鏈化學(xué)反應(yīng)緊密相關(guān)。當(dāng)發(fā)光細菌接觸有毒物質(zhì)后，有毒物質(zhì)破壞了發(fā)光細菌的生理代謝，從而發(fā)光的強度衰減。發(fā)光細菌的發(fā)光強度表達為“相對熒光單位”(Relative Luminescent Unit, RLU)的衰減值來對毒性評估和量化。
[0008]利用發(fā)光細菌接觸毒物來量化毒性是一項非常迷人的技術(shù)，它可以在很短的時間內(nèi)給出毒性量化數(shù)據(jù)。多年實驗室研究及國內(nèi)外文獻證實細菌的發(fā)光細菌熒光行為(bioluminescent behavior)是一個極其多變的行為,有著極為復(fù)雜的生物多樣性，比如同一批培養(yǎng)的發(fā)光細菌的RLU值可以是幾十倍甚至上百倍的差別，可以用喜怒無常來形容細菌發(fā)光行為。
[0009]另外由于相對突光單位RLU沒有一個統(tǒng)一的國際標(biāo)準(zhǔn),不同廠家生產(chǎn)的發(fā)光檢測儀(Luminometer)使用了各異的光電倍增管(photomultiplier)和信號放大電路,從而即使發(fā)光強度一致，不同廠家的發(fā)光檢測儀的RLU讀數(shù)也是千差萬別。
[0010]盡管發(fā)光細菌接觸毒物能夠很好的量化毒性，可是由于RLU的可重現(xiàn)性極低，其毒性量化數(shù)值和單位結(jié)果非常難用于科學(xué)交流，從而準(zhǔn)確性和可重現(xiàn)性大打折扣。無法用于實際水環(huán)境檢測和監(jiān)測。[0011]目前自然界挑選的發(fā)光細菌都是兼性嗜冷菌(psychrotrophic bacterium),通常生活在10° -20°C;從生態(tài)分部來看分為海洋細菌(費氏弧菌株Aliivibrio fischeri)和淡水細菌(青?；【鷙ibrio Qinghaiensis)。這些發(fā)光細菌都已經(jīng)被用于水毒性檢測。
[0012]目前沒有文獻記載怎樣規(guī)范這些發(fā)光細菌的熒光行為從而得到一個可以信奈的毒性檢測數(shù)據(jù)。
3.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明極大提高了發(fā)光細菌用于毒理檢測的數(shù)據(jù)可重現(xiàn)性，如果檢測所使用同一種標(biāo)準(zhǔn)毒素和發(fā)光細菌劑型，試驗結(jié)果通常誤差小于10%。比如，使用凍干特定費氏弧菌株(Aliivibrio fischeri ATCC700601)來檢測苯酚(分析純)的毒性，其毒性檢測結(jié)果具有極高的可重現(xiàn)性，不因操作人員或者地域變化而改變，試驗結(jié)果誤差小于10%。完全可以被用作水體毒性的評估，其結(jié)果可以用于科學(xué)交流。
[0014]—,發(fā)光細菌突光行為規(guī)范的方法
[0015]本發(fā)明對比了兩組不同類別的細菌:海洋細菌(費氏弧菌株AliivibrioFischeri)和淡水細菌(青?；【鶹ibrio qinghaiensis)。通過對兩組細菌的突光行為觀察，歸納總結(jié)出了一套規(guī)范“發(fā)光細菌熒光行為”的辦法。
[0016]這些辦法包括嚴格控制細胞培養(yǎng)，收獲，保藏和檢測時的環(huán)境和過程。過程中具體控制細菌的年齡，群體效應(yīng)(Quorum sensing)，生理狀態(tài)，細胞密度。在檢測過程中，嚴格控制液體氧氣濃度，孵化時間和溫度來規(guī)范細菌的發(fā)光行為。
[0017]二，放光細菌熒光行為的數(shù)值解析
[0018]使用修正因子來修正對照樣本讀數(shù)，降低由于生物多樣性引起的誤差；
[0019]建立樣本濃度，時間和毒物伽馬值的線性關(guān)系。對于有色污水，采用色彩糾正的辦法來去除光學(xué)干擾引起的誤差。
[0020]三，對比海洋發(fā)光細菌(費氏弧菌株Aliivibrio Fischeri)和淡水發(fā)光細菌(青?；【鷙ibrio Qinghaiensis)的發(fā)光行為后,總結(jié)出本方法的適用性。
[0021]四，檢測不同廠家生產(chǎn)的發(fā)光檢測儀(Luminometer)。
[0022]在發(fā)光細菌熒光行為數(shù)值中，采用了比值方式，取消所有不同生產(chǎn)廠家發(fā)光儀器檢測儀的任意差別。具體的說把熒光抑制效果等于零時間點的熒光強度減去某一接觸時間的熒光強度(得出衰減的熒光強度)在除以零時間點的熒光強度。通過這樣的方式，將儀器間的不同度數(shù)全部統(tǒng)一起來。
【具體實施方式】
[0023]菌種極其配套培養(yǎng)基和試劑
[0024]1.海洋發(fā)光細菌費氏弧菌(Aliivibrio fischeri ATCC700601)
[0025]由美國菌種保藏中心購得(AmericanType Culture Collection)
[0026]培養(yǎng)基:每I升培養(yǎng)基含有:5克酵母膏，5克胰胨，0.5克硫酸鎂，I克碳酸鈣，3克磷酸氫鉀，30克氯化鈉，如有必要瓊脂培養(yǎng)基另加20克瓊脂。121°高壓蒸汽滅菌后常溫保存。
[0027]冰凍保護液:每100毫升冰凍培養(yǎng)液含有:60克葡萄糖，4克氯化鈉，2克L-組氨酸，0.5克牛血清蛋白，充分溶解后調(diào)整PH值為7備用。
[0028]凍干保護液:每100毫升凍干液含有:8克脫脂奶粉，8克葡萄糖，0.5克精氨酸和3克氯化鈉，充分溶解后調(diào)整PH值為7備用。
[0029]細菌復(fù)活及檢測緩沖液:每100亳升緩沖液含有:7.3克葡萄糖，2.3克6水氯化續(xù)，0.3 克氯化鉀，12 克 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N-(2-ethanesulfonicacid), Sigma公司.)20克氯化鈉；pH調(diào)至7.0。
[0030]2.淡水發(fā)光細菌:青?；【?vibrio Qinghaiensis CS235
[0031]由北京濱松光子學(xué)商貿(mào)(中國)有限公司購得
[0032]培養(yǎng)基:每I升培養(yǎng)基含有2.5克硫酸鎂，0.5克碳酸鎂，0.5克碳酸鈣，0.15克氯化鉀，8克氯化鈉，5克酵母膏，5克胰胨，如有必要瓊脂培養(yǎng)基另加20克瓊脂。121。高壓蒸汽滅菌后常溫保存。
[0033]冰凍保護液:每100毫升冰凍培養(yǎng)液含有:60克葡萄糖，0.8克氯化鈉，2克L-組氨酸，0.5克牛血清蛋白。充分溶解后調(diào)整PH值為7備用。
[0034]凍干保護液:每100亳升凍干液含有:8克脫脂奶粉，8克葡萄糖，0.5克精氨酸，充分溶解后調(diào)整PH值為7備用。
[0035]細菌復(fù)活及檢測緩沖液:每100毫升緩沖液含有:7.3克葡萄糖，23克6水氯化續(xù)，0.3 克氯化鉀，12 克 HEPES(N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N-(2-ethanesulfonicacid), Sigma公司.) 3克氯化鈉；pH調(diào)至7.0。
[0036]試駘操作步驟
[0037]一種利用發(fā)光細菌接觸水溶性毒物后對毒物毒性進行量化的方法進行標(biāo)準(zhǔn)化操作。使標(biāo)準(zhǔn)毒物的檢測毒性小于10%。有效規(guī)范細菌的熒光行為達到標(biāo)準(zhǔn)化目的；
[0038]I)發(fā)光細菌的培養(yǎng)和收獲:
[0039]第一步:單菌落發(fā)光細菌被接種在一個10毫升的無菌液體培養(yǎng)基液錐形瓶(容量50毫升)中，搖床180轉(zhuǎn)每分鐘，保溫20°C，培養(yǎng)24小時后取I毫升菌液進行二次接種；
[0040]第二步:1毫升放光菌液被再次接種到50毫升的無菌液體培養(yǎng)基錐形瓶(容量250毫升)中，搖床180轉(zhuǎn)每分鐘，保溫20°C，培養(yǎng)20小時后檢測細胞密度達標(biāo)后(0D600=0.8-1.0)立刻將菌液放在冰沙上冰浴15分鐘；
[0041]第三步:將冰浴后菌液進行4°C冷凍離心(6000g) 15分鐘后去除上清液收獲細胞。
[0042]2)收獲的細菌保存:
[0043]?冰凍保存:將收獲細胞在100毫升冰凍保存液(冰浴中預(yù)冷15分鐘)中冰浴15分鐘攪勻，100微升分裝，放入液氮中凝固I分鐘，放入-70°C冰箱保存2年直至使用；
[0044]?冷凍干燥保存:將收獲細胞在100毫升冷凍干燥液(冰浴中預(yù)冷15分鐘)中冰浴15分鐘攪勻，100微升分裝，放入液氮中凝固I分鐘，放入冷凍干燥機干燥后，常溫暗室保存2年直至使用。
[0045]3)細菌的復(fù)活與測試菌液制備
[0046]將一份冰凍保存或者冷凍干燥的發(fā)光細菌溶解在100毫升復(fù)活液中，溶解時將試管輕輕搖晃，避免產(chǎn)生氣泡。將完全溶解的細胞放在20°C鋁錠溫控上靜靜孵化15分鐘-30分鐘。制備完畢
[0047]4)測試有毒污水制備[0048]將污水以任意比例連續(xù)稀釋10次(通常建議10% )，如果使用海洋發(fā)光細菌檢測的樣本將最終氯化鈉濃度控制在2%。最后將有毒污水放在15°C鋁錠溫控上靜靜孵化15分鐘。
[0049]5)毒性檢測讀數(shù)
[0050]將有毒污水以同容量比例加入先前制備的發(fā)光細菌溶液中，記錄接觸后記錄零時間，5分鐘，15分鐘和30分鐘的光強(RLU)值。使用不同廠家生產(chǎn)的發(fā)光檢測儀(Luminometer)包括:CleanTrace (3M公司),濱松BHP9514型飲用水檢測儀(北京濱松光子有限公司)。全部過程在15°C鋁錠溫控上控溫。 [0051]數(shù)據(jù)解析:
[0052]為了減小生物多樣性引起的誤差，首先引入熒光強度糾正因子，如公式I描述，一個對照組細菌，在沒有任何毒物接觸的情況下，有時熒光強度也會衰減，其衰減的比例稱為熒光強度糾正因子:
[0053]公式1:熒光強度的糾正因子:
[0054]fkt = Ikt/10
[0055]fkt接觸T時間的糾正因子(時間通常記錄為分鐘)
[0056]10接觸零時間的熒光強度(在對照組中的樣本，單位為RLU)
[0057]Ikt接觸T時間的熒光強度(在對照組中的樣本，單位為RLU)
[0058]在毒物檢測樣本中，其熒光發(fā)光強度與糾正因子之積為糾正后的熒光強度。如公式2:
[0059]公式2:糾正后的熒光強度
[0060]Ict = 10fkt
[0061]fkt是fkt的平均數(shù)；
[0062]I。是接觸零時間的熒光強度(RLU)
[0063]Ict 糾正后的 Itl(RLU)
[0064]細菌在接觸毒物T時間后，其熒光強度已經(jīng)衰減了，其熒光抑制效果表達為公式3:
[0065]公式3:(細菌的)熒光抑制效果
[0066]Ht = (Ict-1n)/Ict X 100
[0067]Ht是一個給定樣本在固定接觸時間內(nèi)的熒光抑制效果(以百分比表示)
[0068]Ict糾正后的10;
[0069]Ilt是一個給定樣本在固定接觸時間內(nèi)的熒光強度(RLU)
[0070]為了評估濃度和毒性的關(guān)系，引入伽馬值來描述某一特定時間下每一個稀釋濃度的抑制效果。
[0071]公式4:毒性物質(zhì)的伽馬值
[0072]rt = Ht/(IOO-Ht)
[0073] tis測定樣本接觸時間后的伽馬值
[0074]Ht是一個給定樣本在固定接觸時間內(nèi)的熒光抑制效果(以百分比表示)
[0075]用毒物濃度，以及某固定接觸時間的伽馬值(毒物本身的毒理特性)建立一個線性關(guān)系如公式5:[0076]公式5:在給定接觸時間下毒性和濃度的關(guān)系
[0077]Igc = big gamma t+lga
[0078]gamma t測定樣本接觸時間后的伽馬值；
[0079]Ct測試樣本的稀釋比例(通常以百分比表示)；
[0080]比如gamma t = 0.25,那么 Ct = IC2。,或者比如 gamma t = I,那么 Ct = IC50 ；
[0081]gamma t是測定樣本接觸時間后的伽馬值；
[0082]b:斜率
[0083]抑制濃度(Inhibition Concentration, IC)用來表達一個給定污水樣本的濃度抑制細菌發(fā)光的比例。比如IC2tl表示某濃度的污水在一個接觸時間內(nèi)抑制了 20%的細菌最大發(fā)光強，或者IC5tl表示某濃度的污水在一個接觸時間內(nèi)抑制了 50%的細菌最大發(fā)光強。IC值越小表示污水毒性越大。而接觸時間越短(比如5分鐘)就顯示出毒性是急性毒性。
[0084]色差糾正:
[0085]發(fā)光細菌通常發(fā)光波長在490納米(黃綠色)，然而一些檢測樣本可能含有顏色可能帶來干擾，所以有必要在毒性測試以前進行色差糾正。
[0086]使用分光光度 儀(上海奧析科學(xué)儀器有限公司AX6001)將污水讀取490納米的吸收值(對比對照組用去離子水):
[0087]公式6:490納米吸收貢獻值
[0088]Ax = 2.303 X ABSx
[0089]ABSx是490納米吸收值
[0090]Ax是490納米吸收貢獻值
[0091]公式7:色彩透射比(Transmittance)
[0092]Tx=(l-e’/Ax
[0093]Tx是透射比
[0094]Ax是490納米吸收貢獻值
[0095]公式8:色彩糾正后的發(fā)光強度
[0096]AC10 = 10XTx
[0097]ACItl是色彩糾正后的發(fā)光強度
[0098]10是接觸零時間的熒光強度(RLU，如公式2描述)
[0099]Tx是透射比
[0100]對于色彩糾正后的毒性檢測，由公式8數(shù)值A(chǔ)CItl取代公式Itl, ACIlt取代In繼續(xù)運算。
[0101]常見有毒物的半數(shù)抑制濃度(IC50)
[0102]無機物樣品凍干海洋與淡水發(fā)光細菌半數(shù)抑制濃度(IC50)
[0103]
【權(quán)利要求】
1.在毒性檢測中發(fā)光細菌熒光行為規(guī)范的方法 a)細菌的復(fù)活與測試菌液制備 將一份冰凍保存或者冷凍干燥的發(fā)光細菌溶解復(fù)活液過程中，需要將細菌完全溶解后放在15-25 °C鋁錠溫控上靜靜孵化15分鐘-45分鐘。 b)測試有毒污水制備 將污水以任意比例連續(xù)稀釋后必須將污水放在10-20°C鋁錠溫控上靜靜孵化10-25分鐘。 c)毒性檢測讀數(shù) 將有毒污水以同容量比例加入制備的發(fā)光細菌溶液中，記錄接觸后記錄各時間點(比如零時間，5分鐘，15分鐘和30分鐘)的光強(Relative Luminescent Unit)值。
2.全部發(fā)光細菌檢測溫控過程中，15-25°C或者10-20°C，鋁錠溫控最為便捷。
3.數(shù)值解析 為了減小生物多樣性引起的誤差，首先引入熒光強度糾正因子，如公式I描述，一個對照組細菌，在沒有任何毒物接觸的情況下，有時熒光強度也會衰減，其衰減的比例稱為熒光強度糾正因子: 公式1:熒光強度的糾正因子:
fkt = Ikt/1 fkt接觸T時間的糾正因子(時間通常記錄為分鐘) 10接觸零時間的熒光強度(在對照組中的樣本，單位為RLU) Ikt接觸T時間的熒光強度(在對照組中的樣本，單位為RLU) 在毒物檢測樣本中，其熒光發(fā)光強度與糾正因子之積為糾正后的熒光強度。如公式2: 公式2:糾正后的熒光強度 Ict=Iofkt fkt是fkt的平均數(shù)； Itl是接觸零時間的熒光強度(RLU) Ict糾正后的Iq(RLU) 細菌在接觸毒物T時間后，其熒光強度已經(jīng)衰減了，其熒光抑制效果表達為公式3: 公式3:(細菌的)熒光抑制效果 Ht= (Ict-1n)/Ict X 100 Ht是一個給定樣本在固定接觸時間內(nèi)的熒光抑制效果(以百分比表示) Ict糾正后的I。； Ilt是一個給定樣本在固定接觸時間內(nèi)的熒光強度(RLU) 為了評估濃度和毒性的關(guān)系，引入伽馬值來描述某一特定時間下每一個稀釋濃度的抑制 效果如公式4: 公式4:毒性物質(zhì)的伽馬值 rt = Ht/(IOO-Ht) Ft is測定樣本接觸時間后的伽馬值 Ht是一個給定樣本在固定接觸時間內(nèi)的熒光抑制效果(以百分比表示)用毒物濃度，以及某固定接觸時間的伽馬值(毒物本身的毒理特性)建立一個線性關(guān)系 如公式5: 公式5:在給定接觸時間下毒性和濃度的關(guān)系 Igc = big r t+lga r t測定樣本接觸時間后的伽馬值； Ct測試樣本的稀釋比例(通常以百分比表示)； 比如rt = 0.25，那么Ct = IC20，或者比如rt = 1，那么Ct = IC50 ； r t是測定樣本接觸時間后的伽馬值； b:斜率 抑制濃度(Inhibition Concentration, IC)用來表達一個給定污水樣本的濃度抑制細菌發(fā)光的比例。比如IC2tl表示某濃度的污水在一個接觸時間內(nèi)抑制了 20%的細菌最大發(fā)光強，或者IC5tl表示某濃度的污水在一個接觸時間內(nèi)抑制了 50%的細菌最大發(fā)光強。IC值越小表示污水毒性越大。而接觸時間越短(比如5分鐘)就顯示出毒性是急性毒性。
4.色差糾正: 發(fā)光細菌通常發(fā)光波長在490納米(黃綠色)，然而一些檢測樣本可能含有顏色可能帶來干擾，所以有必要在毒性測試以前進行色差糾正。 使用分光光度儀將污水讀取490納米的吸收值(對比對照組用去離子水): 公式6:490納米吸收貢獻值
Ax = 2.303 X ABSx ABSx是490納米吸收值 Ax是490納米吸收貢獻值 公式7:色彩透射比(Transmittance)
Tx = (l-e_Ax)/Ax
Tx是透射比 Ax是490納米吸收貢獻值 公式8:色彩糾正后的發(fā)光強度(Itl為例) AC10= 10XTx ACItl是色彩糾正后的發(fā)光強度。
5.對比海洋發(fā)光細菌(費氏弧菌株AliivibrioFischeri)和淡水發(fā)光細菌(青海弧菌vibrio Qinghaiensis)的發(fā)光行為后,總結(jié)出本方法適用于淡水和海洋發(fā)光細菌的毒性檢測。
6.檢測不同廠家生產(chǎn)的發(fā)光檢測儀(Luminometer)。 在發(fā)光細菌熒光行為數(shù)值中，采用了比值方式，取消所有不同生產(chǎn)廠家發(fā)光儀器檢測儀的任意差別。具體的說把熒光抑制效果等于零時間點的熒光強度減去某一接觸時間的熒光強度(得出衰減的熒光強度)在除以零時間點的熒光強度。通過這樣的方式，將儀器間的不同度數(shù)全部統(tǒng)一起來。 不同廠家生產(chǎn)的發(fā)光檢測儀(Luminometer)使用了各異的光電倍增管(photomultiplier)放大電路，RLU差別很大,但是毒性效果一致。
【文檔編號】G01N21/64GK103940789SQ201310017439
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月17日
【發(fā)明者】劉星海 申請人:劉星海