專(zhuān)利名稱(chēng)：一種藻紅蛋白標(biāo)記抗sti抗體、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體，尤其涉及一種藻紅蛋白標(biāo)記抗體、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
我國(guó)是水產(chǎn)品生產(chǎn)大國(guó)，2010年水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到了 5373萬(wàn)噸，其中水產(chǎn)品加工產(chǎn)量為1778萬(wàn)噸，水產(chǎn)品加工業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)漁業(yè)生產(chǎn)中發(fā)展速度快、經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益顯著的重要支柱產(chǎn)業(yè)。魚(yú)糜制品是大宗低值魚(yú)類(lèi)加工利用的一個(gè)重要方向。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2010年我國(guó)魚(yú)糜制品產(chǎn)量達(dá)到了 96萬(wàn)噸。近年來(lái)，隨著魚(yú)糜原料價(jià)格的大幅上漲，非魚(yú)肉蛋白被添加到了魚(yú)糜制品中。其中，大豆蛋白在原料魚(yú)漿以及生產(chǎn)過(guò)程中普遍使用，使得魚(yú)糜制品生產(chǎn)相關(guān)企業(yè)在原料把關(guān)上存在嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，魚(yú)糜制品的有效成分和品質(zhì)也難于得到保證，損害了消費(fèi)者的利益和企業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。但是目前國(guó)內(nèi)尚未有有效的方法檢測(cè)魚(yú)糜制品中的大豆蛋白，亟需建立一種快速、有效的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種快速、準(zhǔn)確、安全的檢測(cè)大豆蛋白的藻紅蛋白標(biāo)記抗大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor, STI)抗體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種藻紅蛋白標(biāo)記抗STI單克隆抗體，其特征在于，由藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體組合而成。所述藻紅蛋白與抗STI單克隆抗體均分別進(jìn)行了處理；優(yōu)選為藻紅蛋白通過(guò)SPDP (3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)和DTT (二硫蘇糖醇)處理；抗STI單克隆抗體通過(guò)SPDP處理。具體處理方法為:
藻紅蛋白的處理:一定量的R-藻紅蛋白與SPDP在恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min, 20-30°C，反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮；加入一定量的DTT于上述SPDP處理的R-藻紅蛋白，20-30 1:恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min，反應(yīng)時(shí)間為30min，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱或透析去除多余的DTT，并用10 kDa膜濃縮，得到處理后的藻紅蛋白；
抗STI單克隆抗體的處理:一定量的抗STI單克隆抗體與SPDP在恒溫?fù)u床反應(yīng)，100rpm/min, 20-30 °C反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱或透析去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮，得到處理后的抗STI單克隆抗體；
再將上述SPDP處理后的藻紅蛋白和處理后的抗STI單克隆抗體混合，在恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min, 20-30 °C反應(yīng)16-18 h，得到藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體復(fù)合物；收集:將獲得的藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體復(fù)合物過(guò)凝膠過(guò)濾柱，獲得藻紅蛋白標(biāo)記的抗體。所述藻紅蛋白與SPDP的比例為摩爾比為1:80-1:100。所述DTT與所述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白的反應(yīng)濃度為摩爾比為1:100-1:400。所述抗STI單克隆抗 體與SPDP摩爾比為1:80-1:100。本發(fā)明還保護(hù)依據(jù)上述制備方法所得的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體。
本發(fā)明還保護(hù)藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體的用途，優(yōu)選為檢測(cè)魚(yú)糜制品中大豆蛋白的用途。本發(fā)明還進(jìn)行了免疫熒光方法與化學(xué)發(fā)光方法的比較試驗(yàn)，結(jié)果表明免疫熒光法比化學(xué)發(fā)光法靈敏度更高，且反應(yīng)時(shí)間更短。利用免疫熒光法能夠檢測(cè)到1.56 yg/mLSTI?；瘜W(xué)發(fā)光法能夠檢測(cè)到3.12 yg/mL STI。本發(fā)明進(jìn)行了未添加大豆蛋白的自制魚(yú)丸和市售魚(yú)丸中大豆蛋白的檢測(cè)試驗(yàn)，八種材料分別為未添加大豆蛋白的自制魚(yú)丸、魚(yú)豆腐、福州魚(yú)丸、A公司墨魚(yú)魚(yú)丸、B公司墨魚(yú)魚(yú)丸、花枝魚(yú)丸、章魚(yú)魚(yú)丸，含2 % (w/w)大豆蛋白的魚(yú)丸。結(jié)果表明:未添加大豆蛋白的自制魚(yú)丸，沒(méi)有對(duì)應(yīng)STI蛋白(21 kDa)的條帶，說(shuō)明該抗體特異性良好。2 %大豆蛋白添加量(w/w)的魚(yú)丸，STI條帶清晰明顯；魚(yú)豆腐的條帶最亮，說(shuō)明魚(yú)豆腐中的大豆蛋白含量最高。其次為A公司墨魚(yú)魚(yú)丸和福州魚(yú)丸，添加量為2 %左右。雖然B公司墨魚(yú)魚(yú)丸、花枝魚(yú)丸、章魚(yú)丸包裝上未標(biāo)注含大豆蛋白，但泳道5、6、7顯示也含有一定量的大豆蛋白，該結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法一致。本發(fā)明所實(shí)施的實(shí)施例，充分說(shuō)明了本發(fā)明的方法結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法一致，且比化學(xué)發(fā)光法靈敏度更高。由于藻紅蛋白直接標(biāo)記了一次抗體，與需要二次抗體反應(yīng)的熒光法相比較，反應(yīng)時(shí)間更短。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，安全。


圖1A.純化STI的SDS-PAGE電泳圖，圖1B.抗STI單克隆抗體的特異性分析電泳 圖2.純化STI對(duì)胰蛋白酶的抑制效果 圖3.抗STI單克隆抗體純化結(jié)果電泳圖； 圖4A.免疫熒光法檢測(cè) 圖4B.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè) 圖5A.8種不同魚(yú)糜制品的免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果 圖5B.8種不同魚(yú)糜制品的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1:大豆蛋白STI標(biāo)準(zhǔn)品的制備
用高速藥物粉碎機(jī)將大豆磨成粉末，并過(guò)60目篩，稱(chēng)取100 g粉末，加入300 mL丙酮攪拌2 h,絹布過(guò)濾,棄去丙酮層。殘留物用80 %的乙醇洗漆,8000 g離心20 min,棄上清，如此重復(fù)4次。將所得沉淀浸泡于0.08 mol/L H2SO4中30 min, 6000 g離心15 min，棄上清，沉淀再重懸于0.125 mol/L H2SO4*,攪拌4 h,8000 g離心20 min,絹布過(guò)濾,棄沉淀。上清液用I mol/L的NaOH調(diào)pH至4.7，靜置0.5 h,8000 g離心20 min，棄沉淀。上清液加Λ 70 %飽和度的(NH4)2SO4,4 °C放置 2 h，8000 g離心 20 min，沉淀用 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)的緩沖液溶解，透析過(guò)夜。將透析后的樣品上樣于預(yù)先用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)的緩沖液平衡好的DEAE-Sephacel層析柱，經(jīng)0-0.5 mol/L NaCl線(xiàn)性洗脫、收集對(duì)胰蛋白酶抑制活性峰部分，于20 mmol/L的HAc-NaAc (pH 4.0)緩沖液中透析21 h，期間分別間隔1、2、4、6 h更換一次緩沖液。透析后樣品進(jìn)一步上樣于SP-Sepharose離子交換層析柱,經(jīng)20 mmol/L HAc-NaAc(pH 4.0-6.0)的緩沖液洗脫，得到純化的大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)。蛋白的純化效果如圖1A和圖1B，其中泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道I為純化的STI ;從圖中可以看出泳道I除了 STI條帶外，不存在其它條帶，即經(jīng)過(guò)一系列的分離純化，得到了高度純化的STI。純化的STI抑制活性采用熒光底物進(jìn)行鑒定。即取50 μ L純化的STI加入850 μ L 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中，再加入50 μ L適量濃度的胰蛋白酶(sigma公司)混勻，常溫孵育 10 min 后，加入 10 μ mol/L 突光底物 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (Peptide Institute公司，日本)50 μ L于37 °C反應(yīng)10 min，用1.5 mL終止液(甲醇:異丙醇:水=35:30:35v:v:v)終止反應(yīng)。反應(yīng)釋放的產(chǎn)物7-amino-4-methylcoumarin (AMC)用突光分光光度計(jì)(FP-6200，JASC0，日本)，在激發(fā)波長(zhǎng)380 nm和發(fā)射波長(zhǎng)450 nm下進(jìn)行測(cè)定。所得到的值即STI的抑制活力用Ti表示。對(duì)照(胰蛋白酶酶活力)的測(cè)定方法類(lèi)似，即將50 μ L的緩沖液代替50 μ L純化的STI反應(yīng)，所測(cè)得的值用T表示。抑制活力單位(Unit)定義為將胰蛋白酶活性降低I個(gè)活力單位的抑制活性，其中胰蛋白酶的活力單位定義為每分鐘釋放I nmol AMC所需要的酶量。抑制率采用百分?jǐn)?shù)I (%)表示，計(jì)算公式如下:1 (%) = ( (T-Ti)/Τ) X 100。結(jié)果如圖2所示,橫坐標(biāo)表示純化的STI的濃度,縱坐標(biāo)表示抑制率I (%),從圖中可以看出，當(dāng)純化的STI濃度為1/64000 mg/mL (15.6 ng/mL)時(shí)，對(duì)胰蛋白酶仍然有10%左右的抑制活性，純化STI的IC50 (測(cè)定導(dǎo)致胰蛋白酶活力下降50 %的抑制劑濃度)為1/32000 mg/mL即3L 3 ng/mL，說(shuō)明純化的STI對(duì)胰蛋白酶具有強(qiáng)烈的抑制效果。實(shí)施例2抗大豆蛋白STI單克隆抗體的制備 選擇5只雌性、6 8周齡的BALB/c小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，將實(shí)施例1得到純化的大豆蛋白STI經(jīng)110 °C，處理30 min后(100 μ L)與等體積的弗氏完全佐劑(Sigma)混勻所得即為抗原，每只小鼠100 μ g抗原的劑量進(jìn)行腹腔注射；之后每隔2周以相同劑量的抗原加強(qiáng)免疫；免疫3次后，對(duì)小鼠進(jìn)行尾部取血，利用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，即抗原以2 yg/mL的濃度包被酶標(biāo)板，4 1:包被過(guò)夜，以200 μ L/孔TBST洗滌5遍，經(jīng)5 %的脫脂奶37 °C條件下溫育1.5 h，以200 μ L/孔TBST洗滌2遍，將小鼠抗血清以 1:200、1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:60000、1:240000 的稀釋度稀釋?zhuān)?0 μ L/孔加樣，37 °C條件下溫育I h，用TBST以200 μ L/孔洗滌2遍，羊抗鼠HRPl: 5000稀釋使用，以100 μ L/孔加樣，37 °C條件下溫育I h，用TBST以200 μ L/孔洗滌3遍，加100μ L/孔TMB (3，，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺)顯色液，反應(yīng)20 min后，加入50 μ L/孔的H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD45tl Μ讀數(shù)，選擇抗體滴度最高的一只小鼠(血清稀釋度為I: 10000時(shí)，OD450 Μ為1.294)在細(xì)胞融合前4天,進(jìn)行強(qiáng)化免疫I次。免疫量仍然為每只小鼠100 μ g抗原。分離強(qiáng)化免疫的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，將其與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))在聚乙二醇(Sigma)的介導(dǎo)下進(jìn)行融合；融合后的細(xì)胞在含有I % HAT (Sigma)和20%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI 1640 (Invitrogen)培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)；雜交瘤細(xì)胞通過(guò)ELISA法進(jìn)行篩選(方法同之前提供的間接ELISA法)。篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，該操作重復(fù)3次以保證篩選出能分泌抗大豆蛋白STI抗體的單克隆陽(yáng)性細(xì)胞株。篩選的能分泌抗大豆蛋白STI單克隆抗體的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，1500 g離心10 min取上清即得抗小清蛋白單克隆抗體。將得到的單克隆抗體與平衡緩沖液(20 mmol/L的PBS，pH 7.0)混合后，上樣于預(yù)先用20 mmol/L的PBS (pH 7.0)平衡的Protein G Sepharose親和層析柱(Amersham Biosciences),收集該部分樣品(未吸附部分);繼續(xù)用平衡緩沖液流洗至A28tol為基線(xiàn)，然后以0.1 mol/L glycine (甘氨酸)-HCl (pH2.7)進(jìn)行洗脫至A28tlnm為基線(xiàn)，收集時(shí)先在離心管中預(yù)先加入100 μ L lmol/L Tris-HCl(pH 9.0)的緩沖液，每管收集I mL，洗脫部分所得樣品稱(chēng)吸附部分。分別將細(xì)胞培養(yǎng)上清、未吸附部分及吸附部分的蛋白峰部分SDS化后(樣:上樣緩沖液=3:1，V: V)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖3的泳道1、2、3所示。說(shuō)明經(jīng)Protein G Sepharose親和層析柱的純化，有效去除了雜蛋白，得到了高度純化的抗STI單克隆抗體。如泳道3所示(吸附部分)，在還原條件下(加入巰基乙醇)分別顯示出50 kDa左右的重鏈和25 kDa左右的輕鏈。將得到的單克隆抗體進(jìn)行特異性分析，結(jié)果見(jiàn)圖1A和B，其中泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為純化的STI ;泳道2為空白對(duì)照(魚(yú)肉+淀粉);泳道3為大豆分離蛋白，圖1A的SDS-PAGE電泳所示，除純化的STI，空白對(duì)照及大豆分離蛋白均含有許多雜蛋白，但圖1B (抗STI單克隆單克隆抗體的Western blot分析)結(jié)果顯示,大豆分離蛋白及純化的STI只在STI處存在免疫反應(yīng)，空白對(duì)照(魚(yú)肉+淀粉)則沒(méi)有任何反應(yīng)條帶。說(shuō)明制備的抗STI單克隆抗體具有較好的特異性，除大豆蛋白STI外，不與大豆及魚(yú)糜中的其它蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。實(shí)施例3藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體的制備
藻紅蛋白的處理:R-藻紅蛋白與SPDP的比例為1:80,恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min,25°C反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的SPDP，并用IOkDa膜濃縮；用DTT處理上述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白，DTT與所述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白的反應(yīng)濃度為摩爾比1:100，在25 1:下100 rpm/min搖床反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的DTT，并用IOkDa膜濃縮，得到處理后的藻紅蛋白?？筍TI單克隆抗體的處理^STI單克隆抗體與SPDP摩爾比為1:80，在25 °〇下100 rpm/min搖床反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮，得到處理后的抗STI單克隆抗體。再將所述處理后的藻紅蛋白和處理后的抗STI單克隆抗體混合，在25 °C下，100rpm/min搖床反應(yīng)18 h。收集:將獲得的藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體進(jìn)行Sephacryl S-300柱層析,去除多余的藻紅蛋白和抗體。實(shí)施例4藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體的制備
藻紅蛋白的處理:R-藻紅蛋白與SPDP的比例為摩爾比1:100，在25 °C下，100 rpm/min搖床反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫 鹽柱去除多余的SPDP，并用IOkDa膜濃縮；用DTT處理上述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白，DTT與所述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白的反應(yīng)濃度為1:400 (摩爾比)，在25 1:下100 rpm/min搖床反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的DTT，并用10 kDa膜濃縮，得到處理后的藻紅蛋白。
抗STI單克隆抗體的處理:抗STI單克隆抗體與SPDP以摩爾比1:100混合，在25°C下，100 rpm/min搖床反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮，得到處理后的抗STI單克隆抗體。再將所述處理后的藻紅蛋白和處理后的抗STI單克隆抗體混合，在25 °C下，100rpm/min搖床反應(yīng)16 h。收集:將獲得的藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體復(fù)合物進(jìn)行Sephacryl S-300柱層析，去除多余的藻紅蛋白和抗體。實(shí)施例5藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體的制備
藻紅蛋白的處理=R-藻紅蛋白與SPDP的摩爾為1:90，在25 °C下，100 rpm/min搖床反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮；用DTT處理上述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白，DTT與所述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白的反應(yīng)摩爾比為1:250，在25 V下，100 rpm/min搖床反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的DTT,并用IOkDa膜濃縮，得到處理后的藻紅蛋白?？筍TI單克隆抗體的處理:抗STI單克隆抗體與SPDP摩爾比為1:90，在25 °C下，100 rpm/min搖床反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的SPDP，并用IOkDa膜濃縮，得到處理后的抗STI單克隆抗體。再將所述處理后的藻紅蛋白和處理后的抗STI單克隆抗體混合，在25 °C下，100rpm/min搖床反應(yīng)16 h。收集:將獲得的藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體復(fù)合物進(jìn)行Sephacryl S-300柱層析，去除多余的藻紅蛋白和抗體。實(shí)施例6免疫熒光方法與化學(xué)發(fā)光方法比較 免疫熒光方法(本發(fā)明方法):免疫熒光檢測(cè)即用藻紅蛋白標(biāo)記一次抗體，直接利用藻紅蛋白本身的熒光來(lái)檢測(cè)抗原的方法。先將純化的STI (實(shí)施例1所得)以1/20 mg/mL為起始濃度，進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)琒DS化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，經(jīng)脫脂奶封閉，藻紅蛋白標(biāo)記的抗STI單克隆抗體(實(shí)施例3或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?所得)孵育后,利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Fluor chem Q)記錄結(jié)果。如圖4A所示，利用免疫熒光法能夠檢測(cè)到STI的最低濃度為1.56 μ g/mL?；瘜W(xué)發(fā)光方法:化學(xué)發(fā)光法操作步驟與傳統(tǒng)的Western blot法一致，即抗原轉(zhuǎn)膜后，經(jīng)一抗(抗STI單克隆抗體)、二抗(HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG)孵育后，采用ECL顯色2 min,利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Fluor chem Q)記錄結(jié)果。結(jié)果如圖4B所示，化學(xué)發(fā)光法能夠檢測(cè)到STI的最低濃度為3.12 μ g/mL。圖4A和 4B 中；泳道 1-8 的 STI 濃度分別為:1/20 mg/mL; 1/40 mg/mL; 1/80 mg/mL; 1/160 mg/mL; 1/320 mg/mL; 1/640 mg/mL; 1/1280 mg/mL 和 1/2560 mg/mL;泳道 9為空白對(duì)照。比較圖4A、B可知免疫熒光法比化學(xué)發(fā)光法靈敏度更高，而且因不需二次抗體，檢測(cè)時(shí)間更短。實(shí)施例7魚(yú)丸中大豆蛋白的檢測(cè)
8種不冋魚(yú)糜制品:未添加大 蛋白的自制魚(yú)丸、魚(yú) 腐、福州魚(yú)丸、A公司墨魚(yú)魚(yú)丸、B公司墨魚(yú)魚(yú)丸、花枝魚(yú)丸、章魚(yú)魚(yú)丸，含2 % (w/w)大豆蛋白的魚(yú)丸。
檢測(cè)方法見(jiàn)實(shí)施例6的免疫熒光方法。其中，魚(yú)豆腐、福州魚(yú)丸、A公司墨魚(yú)魚(yú)丸包裝上有添加大豆蛋白的標(biāo)識(shí)，結(jié)果如圖5A和5B所示，其中泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道I為未添加大豆蛋白的自制魚(yú)丸；泳道2為魚(yú)豆腐；泳道3為福州魚(yú)丸；泳道4為A公司墨魚(yú)丸；泳道5為B公司墨魚(yú)丸；泳道6為花枝魚(yú)丸；泳道7為章魚(yú)魚(yú)丸；泳道8為含2 %大豆蛋白的魚(yú)丸。從圖中可以看出，泳道I為空白對(duì)照(未添加大豆蛋白的自制魚(yú)丸)，沒(méi)有STI條帶，再次說(shuō)明該抗體特異性良好。泳道8為2 %大豆蛋白添加量(w/w)的魚(yú)丸，STI條帶清晰明顯。圖中，泳道2的條帶最亮，說(shuō)明魚(yú)豆腐中的大豆蛋白含量最多，且超過(guò)2 % (w/w)大豆蛋白的添加量。其次為A公司墨魚(yú)魚(yú)丸和福州魚(yú)丸，添加量為2 %左右。雖然B公司墨魚(yú)魚(yú)丸、花枝魚(yú)丸、章魚(yú)丸包裝上未標(biāo)注含大豆蛋白，但泳道5、6、7顯示也含有一定量的大豆蛋白，該結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法一致。出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能有兩個(gè)，一是這些魚(yú)丸的原料魚(yú)漿被添加了大豆蛋白，另一個(gè)原因是企業(yè)在生 產(chǎn)過(guò)程中添加了大豆蛋白但對(duì)產(chǎn)品未標(biāo)示。以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體，其特征在于，為藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體組合。
2.權(quán)利要求1的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體，其特征在于，藻紅蛋白與抗STI單克隆抗體均分別進(jìn)行了處理；優(yōu)選為藻紅蛋白通過(guò)SPDP和DTT處理，抗STI單克隆抗體通過(guò)SPDP處理。
3.權(quán)利要求1的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體，其特征在于，制備方法包括如下步驟: 藻紅蛋白的處理:一定量的R-藻紅蛋白與SPDP在恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min, 20-30°C，反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮；加入一定量的DTT于上述SPDP處理的R-藻紅蛋白，20-30 1:恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min，反應(yīng)時(shí)間為30min，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱或透析去除多余的DTT，并用10 kDa膜濃縮，得到處理后的藻紅蛋白； 抗STI單克隆抗體的處理:一定量的抗STI單克隆抗體與SPDP在恒溫?fù)u床反應(yīng)，100rpm/min, 20-30 °C反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱或透析去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮，得到處理后的抗STI單克隆抗體； 再將上述SPDP處理后的藻紅蛋白和處理后的抗STI單克隆抗體混合，在恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min, 20-30 °C反應(yīng)16-18 h，得到藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體復(fù)合物； 收集:將獲得的藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體復(fù)合物過(guò)凝膠過(guò)濾柱，獲得藻紅蛋白標(biāo)記的抗體。
4.權(quán)利要求3的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體，其特征在于，藻紅蛋白與SPDP的比例為摩爾比 1:80- 1:100。
5.權(quán)利要求3的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體，其特征在于，DTT與所述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白的反應(yīng)濃度為摩爾比1:100-1:400。
6.權(quán)利要求3的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體，其特征在于，抗STI單克隆抗體與SPDP摩爾比 1:80- 1:100。
7.權(quán)利要求1-6任一所述的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體的制備方法，其步驟為: 藻紅蛋白的處理:一定量的R-藻紅蛋白與SPDP在恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min, 20-30°C反應(yīng)時(shí)間為I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱或透析去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮；用一定量的DTT處理上述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白，20-30 1:恒溫?fù)u床反應(yīng)，100 rpm/min，反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱或透析去除多余的DTT，并用10 kDa膜濃縮；得到處理后的藻紅蛋白； 抗STI單克隆抗體的處理:一定量的抗STI單克隆抗體與SPDP混合，在100 rpm/min,20-30 °C恒溫?fù)u床反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)脫鹽柱或透析去除多余的SPDP，并用10 kDa膜濃縮，得到處理后的抗STI單克隆抗體； 再將所述處理后的藻紅蛋白和處理后的抗STI單克隆抗體混合，在100 rpm/min,20-30 °C恒溫?fù)u床反應(yīng)16-18 h，得到藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體復(fù)合物； 收集:將獲得的藻紅蛋白偶聯(lián)抗STI單克隆抗體復(fù)合物過(guò)凝膠過(guò)濾柱，獲得藻紅蛋白標(biāo)記的抗體。
8.權(quán)利要求7的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體，其特征在于，藻紅蛋白與SPDP的比例為摩爾比 1:80- 1:100。
9.權(quán)利要求7的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體，其特征在于，DTT與所述SPDP標(biāo)記的R-藻紅蛋白的反應(yīng)濃度為摩爾比1:100-1:400 ； 任選地，所述抗STI單克隆抗體與SPDP摩爾比1:80- 1:100。
10.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體的用途，優(yōu)選為檢測(cè)魚(yú)糜制品中大豆蛋白 的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藻紅蛋白標(biāo)記抗大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor,STI)抗體、制備方法及其用途。所述藻紅蛋白標(biāo)記抗STI抗體為經(jīng)過(guò)處理的藻紅蛋白偶聯(lián)經(jīng)過(guò)處理的抗STI單克隆抗體組合而成。本發(fā)明還保護(hù)所述抗體的制備方法和用途，優(yōu)選為檢測(cè)魚(yú)糜制品中大豆蛋白的用途。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有與化學(xué)發(fā)光法一致的結(jié)果，且比化學(xué)發(fā)光法靈敏度更高，反應(yīng)時(shí)間更短，更簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，安全。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103087197SQ20131001980
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月21日
發(fā)明者曹敏杰, 蔡秋鳳, 沈建東, 江韜玲, 劉光明, 蘇文金 申請(qǐng)人:集美大學(xué)