專利名稱：一種測定蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法。同時本發(fā)明還涉及一種免疫球蛋白純化中測定蛋白糖基化和末端修飾情況的試劑盒。
背景技術(shù)：
近十年來，單克隆抗體在生物醫(yī)藥界、乃至整個醫(yī)藥行業(yè)里取得重大的成功和巨大的發(fā)展。與傳統(tǒng)小分子藥物相比，單克隆抗體具有特異性強，療效顯著，副作用小，用量少等優(yōu)點。就藥物分子特性而言，抗體具有更大的不均一性?？贵w的這一特性是由多種因素引起的，翻譯后修飾是其中最重要的內(nèi)在因素。常見的抗體翻譯后修飾包括糖基化，N端焦谷氨酸化，C端脫賴氨酸，脫酰胺，氧化，異構(gòu)化等。在抗體藥物研發(fā)的多個環(huán)節(jié)，如分子鑒定、工藝開發(fā)、質(zhì)量監(jiān)控等，均需要對翻譯后修飾進(jìn)行檢測分析。抗體IgG糖基化發(fā)生在重鏈Fe區(qū)的天冬酰胺，屬N-糖基化，是抗體的重要結(jié)構(gòu)組成。IgG糖鏈的核心單元由兩個N-乙酰葡萄糖胺和三個甘露糖的雙叉結(jié)構(gòu)連接組成，根據(jù)末端半乳糖、核心巖藻糖、末端唾液酸等的差異，可以組成多種不同的糖鏈結(jié)構(gòu)。IgG的糖基化是不均一的，表現(xiàn)為不同的糖型和含量。糖基化差異可以影響抗體的生物學(xué)活性和藥代特征，如CDC、ADCC、體內(nèi)清除半衰期等?？贵wIgG的N端氨基酸為谷氨酰胺時，容易發(fā)生環(huán)化反應(yīng)而生成焦谷氨酸(pyroglutamic acid,pyroE)。此反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行,也可以在酶催化條件下進(jìn)行。在抗體IgG分子的C端，則容易發(fā)生脫賴氨酸(-K)。在大部分情況下，兩者對抗體的生物活性沒有影響，但亦有報道指某些抗體的N端焦谷氨酸化可能會影響其與抗原的結(jié)合力。此外，N端的谷氨酰胺焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸均會影響抗體的電荷分布，而電荷特性是抗體質(zhì)量監(jiān)控的重要指標(biāo)之一。因此，建立快速檢測抗體IgG糖基化和末端修飾的分析方法在抗體研發(fā)中具有重要意義。目前，本領(lǐng)域一般對糖基化和末端修飾單獨進(jìn)行檢測。酶解熒光標(biāo)記法是IgGl糖基化測定的經(jīng)典定量方法，但樣品處理過程相當(dāng)復(fù)雜，耗時長，而且需要樣品量大；也有使用質(zhì)譜測定IgG酶解片段進(jìn)行糖基化分析，如papain酶和IdeS酶等，但這些方法都存在一些不足，如酶切位點選擇性不強，或成本過高，或樣品處理復(fù)雜等，不適宜常規(guī)或工藝開發(fā)樣品的批量檢測。應(yīng)用LC-MS進(jìn)行肽圖分析理論上可以同時檢測抗體的糖基化和末端修飾，但含糖多肽的分離、測定和數(shù)據(jù)分析存在諸多技術(shù)難點，不適用于糖基化定量分析，而且樣品處理過程復(fù)雜，耗時長，酶切過程也可能對抗體原有末端修飾產(chǎn)生影響。在免疫球蛋白純化過程中，需要對蛋白的純化情況進(jìn)行隨時檢測，檢測需用樣品量大，檢測耗時長仍是目前最大的問題。因此，目前仍未有適用于抗體研發(fā)的對少量IgG的糖基化和末端修飾同時進(jìn)行快速測定的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種同時測定免疫球蛋白(即抗體)純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法。同時本發(fā)明還涉及一種免疫球蛋白純化中測定蛋白糖基化和末端修飾情況的試劑盒。本發(fā)明提供一種同時測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，所述方法包括以下步驟:I)使用陽離子交換層析法分離免疫球蛋白，按保留時間收集不同組分；2)使步驟I)中免疫球蛋白組分經(jīng)變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈；3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈；
4)使用質(zhì)譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量；5)分析步驟3)中的色譜數(shù)據(jù)和步驟4)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而測定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。其中，所述免疫球蛋白優(yōu)選為人免疫球蛋白，優(yōu)選為人免疫球蛋白IgG，進(jìn)一步優(yōu)選為人免疫球蛋白IgGl和IgG2亞型。并且，所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況優(yōu)選包括免疫球蛋白的輕鏈N端焦谷氨酸化，以及重鏈的天冬酰胺糖基化和N端焦谷氨酸化、C端脫賴氨酸。在本發(fā)明提供的測定方法中，所述步驟I)包括:采用常規(guī)強陽離子交換層析柱的上樣緩沖鹽為20mM磷酸鈉緩沖鹽，洗脫緩沖鹽為20mM磷酸鈉和IM氯化鈉緩沖鹽(pH = 6.0)，紫外吸收280nm監(jiān)測流出組分。具體地，所述步驟2)包括:向一定量的免疫球蛋白中加入10-30 μ L的1_6Μ鹽酸胍水溶液，混合均勻后加入1-4 μ L 二硫蘇糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)，其中，反應(yīng)溶液中DTT終濃度為25-100mM，免疫球蛋白終濃度為0.2-3 μ g/μ L0優(yōu)選地，所述步驟2)中的DTT終濃度為50mM。優(yōu)選地，所述步驟2)免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)溫度為50_65°C，反應(yīng)時間為45min_120mino更優(yōu)選地，所述步驟2)免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)溫度為65°C，反應(yīng)時間為45min。具體地,所述步驟3)具體包括:采用反向超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈，以實現(xiàn)所述輕鏈和重鏈的基線分離，據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，采用的液相系統(tǒng)可以為UPLC (Waters,ACQUITY)。色譜柱:ffaters, ACQUITY UPLC column, BEH C4,1.7 μ m(粒徑)，300λ (孔徑)，
2.1 X 50mm。流動相洗脫條件對輕鏈和重鏈的分離影響較大，優(yōu)選地，色譜條件設(shè)定為:色譜柱溫度設(shè)定為55-65°C，進(jìn)樣量0.2-3 μ g ;流動相X為0.1 %甲酸水，流動相Y為0.1 %甲酸乙腈，流速為0.4mL/min ；梯度洗脫條件為:
權(quán)利要求
1.一種測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，所述方法包括以下步驟: 1)使用陽離子交換層析法分離免疫球蛋白，按保留時間收集不同組分； 2)使步驟I)中免疫球蛋白組分經(jīng)變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈； 3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈； 4)使用質(zhì)譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量； 5)分析步驟3)中的色譜數(shù)據(jù)和步驟4)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而測定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟I)采用常規(guī)強陽離子交換層析柱的上樣緩沖鹽為20mM磷酸鈉緩沖鹽，洗脫緩沖鹽為20mM磷酸鈉和IM氯化鈉緩沖鹽(pH = 6.0),紫外吸收280nm監(jiān)測流出組分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)包括:向一定量的免疫球蛋白中加入10-30 μ L的1-6Μ鹽酸胍水溶液，混合均勻后加入1-4 μ L 二硫蘇糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)，其中，反應(yīng)溶液中DTT終濃度為25-100mM，免疫球蛋白終濃度為0.2-3 μ g/μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所 述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中DTT終濃度為50mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)溫度為50-65°C，反應(yīng)時間為45min-120min。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)溫度為65°C，反應(yīng)時間為45min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟3)包括:采用C4反向超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈，以實現(xiàn)所述輕鏈和重鏈的基線分離。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟4)包括: 采用電噴霧電離質(zhì)譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量，其中在0-5min，流路通往廢液，5-16min，流路通往質(zhì)譜，然后采用正離子模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
質(zhì)譜條件設(shè)定為: 錐孔氣流為50.0L/Hr，脫溶劑氣體為800.0L/Hr，脫溶劑溫度為500°C，錐孔電壓為20-40V，掃描范圍為400-2500Da，掃描時間為Is。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟5)包括: 由步驟3)中獲得的色譜峰面積計算得到所述免疫球蛋白的輕鏈的N端焦谷氨酸化比例，由步驟4)中獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)計算得到所述免疫球蛋白的重鏈的糖型相對含量以及N端焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸比例。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所 述免疫球蛋白為人免疫球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在免疫球蛋白純化過程中測定免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況的方法，該方法能夠同時、快速地對免疫球蛋白糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸進(jìn)行測定，所述方法包括以下步驟1)使用陽離子交換樹脂分離免疫球蛋白，按保留時間收集不同組分；2)使步驟1)中免疫球蛋白組分經(jīng)變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈；3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈；4)使用質(zhì)譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量；5)分析步驟3)中的色譜數(shù)據(jù)和步驟4)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而測定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。
文檔編號G01N30/02GK103217489SQ201310027640
公開日2013年7月24日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者朱保國, 彭育才, 楊嘉明 申請人:珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司