專利名稱：利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜診斷急性心肌梗死的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，一種利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜診斷急性心肌梗死的方法。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組大部分測(cè)序工作的完成，基因框架圖已經(jīng)繪就，但是，基因的功能不僅由其本身的序列決定，它給予生命的信息之多，變異之廣，使患病機(jī)制成為一個(gè)極其復(fù)雜的問題，而基因功能的最終執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是揭示基因和病癥鏈條中的最關(guān)鍵一環(huán)。
以往有關(guān)蛋白質(zhì)的研究多采用色譜分離純化，二維電泳，光譜，質(zhì)譜定量定性等分析化學(xué)的研究技術(shù)。運(yùn)用這些手段進(jìn)行研究所必需的技術(shù)條件要求高，儀器昂貴，步驟繁瑣，耗時(shí)冗長(zhǎng)，不適合大規(guī)模臨床篩選和檢測(cè)。蛋白芯片的誕生為今天蛋白質(zhì)的研究提供了一條快速發(fā)展的高速通道，它在識(shí)別特定蛋白質(zhì)的表達(dá)物，進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的藥物篩選，揭示蛋白酶的作用，測(cè)定血清中小分子物質(zhì)的含量的識(shí)別等方面，均已證實(shí)較現(xiàn)有技術(shù)更為迅速準(zhǔn)確。
蛋白芯片在癌癥相關(guān)蛋白的研究領(lǐng)域內(nèi)進(jìn)展最快，國外學(xué)者將前列腺癌、卵巢癌患者與非癌對(duì)照者的血清或排泄物的樣本通過蛋白芯片儀進(jìn)行了研究；Petricoin III EF等用C16疏水性蛋白芯片分析了66例健康婦女、50例卵巢癌患者，圖譜采用534、989、2，111、2，251、2，465質(zhì)荷比(M/Z)蛋白峰綜合分析，靈敏度100％、特異性95％、預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率94％，同樣的標(biāo)本用CA125陽性預(yù)測(cè)值只有35％，且主要反映在年輕人組中，而CA125在良性盆腔疾病中的假陽性率亦很高。Bao-Ling Adam應(yīng)用SELDI蛋白芯片系統(tǒng)在金屬表面芯片上確定了4.475kD，5.074kD，5.382kD，7.024kD，7.82kD，8.141kD，9.149kD，9.507kD，9.656kD等九個(gè)蛋白質(zhì)用于檢測(cè)前列腺癌，其靈敏度為83％，特異性為97％；而用PSA的靈敏度高于90％，但其特異性僅僅為25％。
目前，用于臨床和正在探索的急性心肌梗死診斷方法有1.心電圖心電圖診斷急性心肌梗死的陽性率至多80％，其余的20％必須依靠生化標(biāo)志物確診。
2.心肌酶譜天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)AST在AMI發(fā)生后6～12h升高，24～48h達(dá)峰值，持續(xù)到第5天或一周降低。由于AST不具備組織特異性，血清單純AST升高不能診斷心肌損傷。AST診斷AMI敏感性77.7％，特異性僅53.3％。敏感性不高，特異性較差，當(dāng)今學(xué)術(shù)界已不主張AST用于急性心肌梗死診斷。乳酸脫氫酶(LD)及其同工酶①限制LD應(yīng)用，不作為常規(guī)檢查項(xiàng)目，對(duì)病人作個(gè)案處理，主要用于排除急性心肌梗死診斷；②在胸痛發(fā)作24h后測(cè)定LD同工酶，作為CK-MB補(bǔ)充；③LD出現(xiàn)較遲，如果CK-MB或cTn已有陽性結(jié)果，AMI診斷明確，就沒有必要再檢測(cè)LD和LD同工酶。肌酸激酶(CK)及其同工酶優(yōu)點(diǎn)①快速、經(jīng)濟(jì)、有效，能準(zhǔn)確診斷急性心肌梗死，是當(dāng)今應(yīng)用最廣的心肌損傷標(biāo)志物。②其濃度和急性心肌梗死面積有一定的相關(guān)，可大致判斷梗死范圍。③能測(cè)定心肌再梗死?！跄苡糜谂袛嘣俟嘧ⅰＦ淙秉c(diǎn)是①特異性較差，特別難以和骨骼肌疾病、損傷鑒別。②在急性心肌梗死發(fā)作6h以前和36h以后敏感度較低，只有CK-MB亞型可用于急性心肌梗死早期診斷。③對(duì)心肌微小損傷不敏感。
3.典型的持續(xù)的胸痛史由于血清具有取材方便，創(chuàng)傷小，并可連續(xù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因此從血清中發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)急性心肌梗死生物標(biāo)志物將把急性心肌梗死的早期診斷提高到一個(gè)新的水平，從而最終改善急性心肌梗死患者預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜診斷急性心肌梗死的方法，能夠在發(fā)病初期是被診斷，大大提高急性心肌梗死患者的預(yù)后。由于血清具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因此從血清中發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)急性心肌梗死早期生物標(biāo)志物，將把急性心肌梗死的早期診斷提高到一個(gè)新的水平，從而最終改善急性心肌梗死的預(yù)后。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案所述的利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜診斷急性心肌梗死的方法，首先制取蛋白質(zhì)組指紋圖譜，取一定量心電圖和心肌酶譜及病史確診的急性心肌梗死患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者及正常對(duì)照人員外周血，4℃冷藏析出血清后，離心吸取血清，分裝，-80℃?zhèn)溆?；檢測(cè)時(shí)按一定濃度稀釋；用美國賽弗吉公司的金屬芯片；置入美國賽弗吉公司飛行質(zhì)譜儀，分析樣品血清蛋白質(zhì)組波譜；對(duì)比分析急性心肌梗死患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者及健康人員血清蛋白質(zhì)組波譜，獲得急性心肌梗死患者血清中特異的蛋白質(zhì)波峰；將發(fā)現(xiàn)的血清中特異的蛋白質(zhì)波峰進(jìn)行組合后形成蛋白質(zhì)指紋圖譜，采用此指紋圖譜雙盲法進(jìn)行臨床篩選試驗(yàn)，確定該指紋圖譜的陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、靈敏度、特異度。
本發(fā)明利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜診斷急性心肌梗死，經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果證明，具有如下社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益本專利將為急性心肌梗死的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷提供準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法。
本專利是本醫(yī)療單位在該領(lǐng)域的重要突破，可推廣到醫(yī)院做臨床檢測(cè)或?qū)ι鐓^(qū)高危人群的定期監(jiān)測(cè)，從而為急性心肌梗死高危人群的健康提供有利保障。
本發(fā)明大大降低醫(yī)療費(fèi)用的開支，促進(jìn)醫(yī)療保險(xiǎn)制度的改革。我們粗略估算一張蛋白芯片60美元，加上前處理費(fèi)20美元，可作8個(gè)樣品，每個(gè)樣品10美元，每檢測(cè)一人80元人民幣，比傳統(tǒng)診斷方法(心電圖、心肌酶譜及有無明顯胸痛史等方法綜合診斷才可確診)要便宜得多，且后者難以做出早期診斷。
操作簡(jiǎn)便，成本低，可重復(fù)性好，患者痛苦小，可大幅度提高早期結(jié)直腸患者的檢出率，使結(jié)直腸患者的生存期進(jìn)一步延長(zhǎng)，甚至治愈。便于對(duì)高危人群進(jìn)行大規(guī)模的檢測(cè)。
圖面說明

圖1是利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜測(cè)定的病人與正常人在質(zhì)荷比為8149Da處的蛋白質(zhì)含量的差別示意圖如圖1中所示三組8149Da蛋白質(zhì)含量差異正常人質(zhì)荷比為8939Da蛋白質(zhì)含量明顯高于不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者，而不穩(wěn)定型心絞痛患者又比急性心肌梗死患者要高。經(jīng)方差分析，三組蛋白質(zhì)含量差異有顯著性(P≤0.01)(如圖3、表1)。
圖2是分組示意及各節(jié)點(diǎn)所含樣本的組成表1三組在質(zhì)荷比為8149Da處蛋白質(zhì)的相對(duì)含量組別 例數(shù) 蛋白質(zhì)的相對(duì)含量(％)急性心肌梗死患者組 99 1.82±0.62正常人組 45 10.28±3.04不急定型心絞痛患者組 21 5.66±2.99注三組蛋白質(zhì)相對(duì)含量?jī)蓛杀容^P≤0.01。
表2用Biomarker Wizard軟件分析的結(jié)果。表中M/Z為質(zhì)荷比，MEAN代表均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差，A代表急性心梗，U代表慢性心梗，Control代表正常人。
M/Z p Mean-A SD-A Mean-U SD-UMean- SD-control control2032.1536.96E-05-0.06888 0.89498 1.7631091.8904651.0955841.7835232727.9120.6721460.7401721.042996 0.7389391.1832471.3560722.2050533162.173 1E-100.4429830.657128 2.3323771.2634921.2514091.7517113278.3510.003269 0.658231.025894 1.8792122.4195615.5779967.7870553299.8891.41E-060.5061110.477801 1.2900690.4817121.6028942.3906043435.5770.1058740.9670680.806616 1.4765781.1021191.0794511.4726313778.710.026144 -0.00280.871473 0.540105 0.11750.9371511.2775173960.6565.13E-070.3877650.787288 2.7550082.8499352.7995944.0412663978.5550.0001410.7871311.084589 4.4459725.086565 4.358415.6456474069.472 00.3999280.423519 2.1025552.0767333.7194011.5332564286.8657.51E-060.4132270.653117 8.93857111.975679.11714312.168934307.550.9549330.3963130.320043 2.1441742.893783 2.653973.9767644350.1576.04E-070.105619 0.35544 1.5782192.0678681.1502451.5015794443.447 0.188590.8963460.744744 4.3421986.4932711.9029473.0098924472.566 6.8E-09 2.834613.4546093.071762.6271266.6516523.4511514649.6378.77E-062.089348 1.45066 3.3748340.5047951.6366790.8727724826.501 02.9882082.447514 0.8977670.7790880.1963780.3103045341.1520.0043225.4145135.231692 5.4497873.3352172.2048142.1091355909.944 0 16.275511.47385 17.6733114.963773.4320593.0664335928.911 02.447913 1.69965 5.6281115.9885520.7369110.7280296440.425 0.000742.5398183.135405 0.6266760.2760760.7295980.7087516636.6760.4908934.5637475.692105 3.808367 4.19122.2126072.2644557773.986 0 7.999113.070298 15.301822.24570812.856674.9886337834.893 2E-101.2243520.502353 2.4307570.502516 1.691950.9021257928.856 01.2940750.898312 3.5593060.5051832.1032590.7729037974.906 01.2983571.101824 3.2510130.5740352.3174360.6598768130.444 01.3031441.143661 9.433544 10.964622.320617.9166758149.85 01.8174010.621524 5.6585462.99113410.282923.0411618193.728 00.6114850.384816 2.5511692.5066834.7458092.8127228311.775 00.3430310.436634 1.9350041.5767894.4631232.0389498344.41 00.2942990.262069 1.7450172.2214814.6304062.2169718443.649 00.5845480.499413 1.1040330.689893 1.824330.9109988930.443 09.5544719.028158 10.021035.95513727.4396411.212238998.735 01.7697631.485501 2.5193161.2415026.1302012.6548049134.207 01.8286161.498003 2.4465461.0797447.0312033.3110539191.512 0 0.841170.464585 2.7163132.1884113.5694571.3163899292.3180.0005057.5786495.168482 10.25679 3.504275.5326512.47405711731.315.28E-071.3392430.761362 0.9260280.4031620.6448530.302607具體實(shí)施例
利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜診斷急性心肌梗死，首先制取蛋白質(zhì)組指紋圖譜，取一定量心電圖和心肌酶譜及病史確診的急性心肌梗死患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者及正常對(duì)照人員外周血，4℃冷藏析出血清后，離心吸取血清，分裝，-80℃?zhèn)溆谩z測(cè)時(shí)按一定濃度稀釋；采用金屬芯片；置入美國賽弗吉公司飛行質(zhì)譜儀，分析樣品血清蛋白質(zhì)組波譜；對(duì)比分析急性心肌梗死患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者及健康人員血清蛋白質(zhì)組波譜，獲得急性心肌梗死患者血清中特異的蛋白質(zhì)波峰；將發(fā)現(xiàn)的血清中特異的蛋白質(zhì)波峰進(jìn)行組合后形成蛋白質(zhì)指紋圖譜，采用此指紋圖譜雙盲法進(jìn)行臨床篩選試驗(yàn)，確定該指紋圖譜的陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、靈敏度、特異度。
利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜早期診斷急性心肌梗死，其操作步驟如下1)、血清的制備融解冰凍血清并4℃，20000g離心10min；每個(gè)樣品取20ml血清，分別置于1.5ml離心管中；每管加40μl U9緩沖液(含9mol/L尿素，2％CHAPS，50mmol/L Tris-HCl pH9.0)；4℃振蕩20min，使蛋白變性；取20μl變性后的樣品，每管加入240μl U1緩沖液(U9緩沖液9倍稀釋而成)，4℃振蕩30min。
2)、芯片的制備芯片的預(yù)平衡芯片每孔加100mmol/L硫酸銅50μl，室溫下200rpm振蕩5min，倒除硫酸銅；用去離子水沖洗5次后甩干，每孔中加入100mmol/L醋酸鈉(pH4.0)50μl，室溫下200rpm振蕩5min；芯片每孔加入結(jié)合/洗脫緩沖液(含100mmol/L磷酸鈉，500mmol/L氯化鈉pH7.0)150μl，置于振蕩器上，室溫孵育5min后除去緩沖液，重復(fù)1次。
加樣每孔加入50μl稀釋好的樣品，置于振蕩器上，4℃孵育60min。
洗脫用150μl結(jié)合/洗脫緩沖液沖洗3次，每次振蕩5min，最后1次用1mmol/L HEPES pH7.0快速?zèng)_洗加EAM在EAM(SPA)中加入75μl乙氰，75μl 1％TFA，充分振蕩5min確保SPA全部溶解，離心1min；每孔分2次加SPA(1μl/次)，2次之間允許各孔風(fēng)干。
3)、血清蛋白質(zhì)組波譜分析設(shè)定參數(shù)分別對(duì)三組所得質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，共測(cè)三組有差異的蛋白質(zhì)峰為38個(gè)，其中病人組與正常人組及良性病組在33處蛋白質(zhì)含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
4)、急性心肌梗死患者特異性蛋白質(zhì)峰的獲得99例急性心肌梗死患者與45例正常人和21例不穩(wěn)定型心絞痛患者血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8149.84Da，4649.63Da，3778.71Da三個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將急性心肌梗死患者與正常人及不穩(wěn)定型心絞痛患者準(zhǔn)確的分組。用這個(gè)生物標(biāo)志物分析數(shù)據(jù)共產(chǎn)生4個(gè)終節(jié)點(diǎn)其中終節(jié)點(diǎn)1只包含急性心肌梗死患者，共99例，滿足M8149.84≤3.042M代表相應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)含量，為終節(jié)點(diǎn)1；終節(jié)點(diǎn)2只包含正常人，其41例，滿足M4649.63≤2.603為終節(jié)點(diǎn)；終節(jié)點(diǎn)3只包含正常人，共4例，滿足M3778.71≤0.263為終節(jié)點(diǎn)3；終節(jié)點(diǎn)4只包含變異型心絞痛，其21例，滿足M3778.71≥0.263為終節(jié)點(diǎn)4。錯(cuò)誤分率為0％5)、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、靈敏度、特異度的確定用BioMarker Pattern軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析三組，結(jié)果顯示用這3個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)99/99例結(jié)急性心肌梗死患者與45/45例正常人及21/21例不穩(wěn)定型心絞痛患者被正確分組，準(zhǔn)確率為100％(165/165)。99例急性心肌梗死患者用本方法診斷為急性心肌梗死患者，45例正常人用本方法診斷為正常人，不穩(wěn)定型心絞痛患者均被本方法診斷為不穩(wěn)定型心絞痛患者。靈敏度和特異性分別為100％(99/99)，100％(66/66)。
6)、急性心肌梗死病程不同時(shí)期患者血清蛋白質(zhì)的比較蛋白組學(xué)分析我們同時(shí)研究了急性心肌梗死病程不同時(shí)期患者血清蛋白質(zhì)的變化，結(jié)直腸癌患者特異性蛋白質(zhì)峰的獲得分析急性心肌梗死病程不同時(shí)期患者血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6637.82Da，4470.70Da，8930.44Da，4826.50Da，6440.42Da五個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將急性心肌梗死病程不同時(shí)期患者準(zhǔn)確的分組。用這個(gè)生物標(biāo)志物分析數(shù)據(jù)共產(chǎn)生8個(gè)終節(jié)點(diǎn)(圖2)其中終節(jié)點(diǎn)1只包含急性心肌梗死患者入院后9小時(shí)血清標(biāo)本，共25例，滿足M6637.82≤1.633和M4470.70≤1.877(M代表相應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)含量，下同)為終節(jié)點(diǎn)1；終節(jié)點(diǎn)2只包含急性心肌梗死患者剛?cè)朐貉鍢?biāo)本，其45例，滿足M6637.82≤1.633和M4470.70≥1.877為終節(jié)點(diǎn)2；終節(jié)點(diǎn)3只包含急性心肌梗死患者入院后48小時(shí)血清標(biāo)本，共10例，滿足M4470.70≤0.701為終節(jié)點(diǎn)3；終節(jié)點(diǎn)4只包含急性心肌梗死患者入院后12小時(shí)血清，其24例，滿足M4470.70≥0.701為終節(jié)點(diǎn)4；終節(jié)點(diǎn)5只包含心肌梗死患者入院后6小時(shí)血清標(biāo)本，共2例，滿足M6440.42≤1.761為終節(jié)點(diǎn)5；終節(jié)點(diǎn)6只包含心肌梗死患者入院后3小時(shí)血清標(biāo)本，共12例，滿足M6440.42≥1.761為終節(jié)點(diǎn)6；終節(jié)點(diǎn)7只包含心肌梗死患者入院后6小時(shí)后血清標(biāo)本，共20例，滿足M4826.50≥5.114為終節(jié)點(diǎn)7；終節(jié)點(diǎn)8只包含心肌梗死患者入院后24小時(shí)后的血清標(biāo)本，共16例，滿足M6637.82≥14.956為終節(jié)點(diǎn)8。錯(cuò)誤分率為0％。
7)、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性從我們的試驗(yàn)結(jié)果看，SELDI-TOF-MS方法[4，5，6]的重復(fù)性很好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，兩樣品孔測(cè)定的結(jié)果滿足。y＝0.9865x+0.098；R2＝0.9583。
權(quán)利要求
1.一種用利用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜診斷急性心肌梗死的方法，其特征在于所述的指紋圖譜診斷急性心肌梗死的方法，首先制取蛋白組模板，取一定量心電圖和心肌酶譜診斷為急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛患者及正常對(duì)照人員外周血，4℃冷藏析出血清后，離心吸取血清，分裝，-80℃?zhèn)溆?；檢測(cè)時(shí)按一定濃度稀釋；用美國賽弗吉公司的金屬芯片，置入美國賽弗吉公司飛行質(zhì)譜儀，分析樣品血清蛋白質(zhì)組波譜；對(duì)比分析急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛患者及健康人員血清蛋白質(zhì)組波譜，獲得急性心肌梗死患者血清中特異的蛋白質(zhì)波峰；將發(fā)現(xiàn)的血清中特異的蛋白質(zhì)波峰進(jìn)行組合后形成蛋白質(zhì)模板，采用此模板雙盲法進(jìn)行臨床篩選試驗(yàn)，確定該指紋圖譜的陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、靈敏度、特異度。
2.實(shí)施如權(quán)利要求1所述的用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜早期診斷診斷急性心肌梗死的方法，其特征在于所述診斷急性心肌梗死，其操作步驟如下1)、血清的制備融解冰凍血清并4℃，20000g離心10min；每個(gè)樣品取20ml血清，分別置于1.5ml離心管中；每管加40μl U9緩沖液(含9mol/L尿素，2％CHAPS，50mmol/L Tris-HCl pH9.0)；4℃振蕩20min，使蛋白變性；取20μl變性后的樣品，每管加入240μl U1緩沖液(U9緩沖液9倍稀釋而成)，4℃振蕩30min。2)、芯片的制備芯片的預(yù)平衡芯片每孔加100mmol/L硫酸銅50μl，室溫下200rpm振蕩5min，倒除硫酸銅；用去離子水沖洗5次后甩干，每孔中加入100mmol/L醋酸鈉(pH4.0)50μl，室溫下200rpm振蕩5min；芯片每孔加入結(jié)合/洗脫緩沖液(含100mmol/L磷酸鈉，500mmol/L氯化鈉pH7.0)150μl，置于振蕩器上，室溫孵育5min后除去緩沖液，重復(fù)1次。加樣每孔加入50μl稀釋好的樣品，置于振蕩器上，4℃孵育60min。洗脫用150μl結(jié)合/洗脫緩沖液沖洗3次，每次振蕩5min，最后1次用1mmol/L HEPES pH7.0快速?zèng)_洗加EAM在EAM(SPA)中加入75μl乙氰，75μl1％TFA，充分振蕩5min確保SPA全部溶解，離心1min；每孔分2次加SPA(1μl/次)，2次之間允許各孔風(fēng)干。3)、血清蛋白質(zhì)組波譜分析設(shè)定參數(shù)分別對(duì)三組所得質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，共測(cè)三組有差異的蛋白質(zhì)峰為38個(gè)，其中病人組與正常人組及良性病組在33處蛋白質(zhì)含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。4)、急性心肌梗死患者特異性蛋白質(zhì)峰的獲得99例急性心肌梗死患者與45例正常人和21例不穩(wěn)定型心絞痛患者血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8149.84Da，4649.63Da，3778.71Da三個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將急性心肌梗死患者與正常人及不穩(wěn)定型心絞痛患者準(zhǔn)確的分組。用這個(gè)生物標(biāo)志物分析數(shù)據(jù)共產(chǎn)生4個(gè)終節(jié)點(diǎn)其中終節(jié)點(diǎn)1只包含急性心肌梗死患者，共99例，滿足M8149.84≤3.042M代表相應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)含量，為終節(jié)點(diǎn)1；終節(jié)點(diǎn)2只包含正常人，其41例，滿足M4649.63≤2.603為終節(jié)點(diǎn)；終節(jié)點(diǎn)3只包含正常人，共4例，滿足M3778.71≤0.263為終節(jié)點(diǎn)3；終節(jié)點(diǎn)4只包含變異型心絞痛，其21例，滿足M3778.71≥0.263為終節(jié)點(diǎn)4，錯(cuò)誤分率為0％5)、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、靈敏度、特異度的確定用BioMarker Pattern軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析三組，結(jié)果顯示用這3個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)99/99例結(jié)急性心肌梗死患者與45/45例正常人及21/21例不穩(wěn)定型心絞痛患者被正確分組，準(zhǔn)確率為100％；99例急性心肌梗死患者用本方法診斷為急性心肌梗死患者，45例正常人用本方法診斷為正常人，不穩(wěn)定型心絞痛患者均被本方法診斷為不穩(wěn)定型心絞痛患者；靈敏度和特異性分別為100％，100％。6)、急性心肌梗死病程不同時(shí)期患者血清蛋白質(zhì)的比較蛋白組學(xué)分析。研究了急性心肌梗死病程不同時(shí)期患者血清蛋白質(zhì)的變化，結(jié)直腸癌患者特異性蛋白質(zhì)峰的獲得分析急性心肌梗死病程不同時(shí)期患者血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6637.82Da，4470.70Da，8930.44Da，4826.50Da，6440.42Da五個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將急性心肌梗死病程不同時(shí)期患者準(zhǔn)確的分組。用這個(gè)生物標(biāo)志物分析數(shù)據(jù)共產(chǎn)生8個(gè)終節(jié)點(diǎn)其中終節(jié)點(diǎn)1只包含急性心肌梗死患者入院后9小時(shí)血清標(biāo)本，共25例，滿足M6637.82≤1.633和M4470.70≤1.877M代表相應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)含量，為終節(jié)點(diǎn)1；終節(jié)點(diǎn)2只包含急性心肌梗死患者剛?cè)朐貉鍢?biāo)本，其45例，滿足M6637.82≤1.633和M4470.70≥1.877為終節(jié)點(diǎn)2；終節(jié)點(diǎn)3只包含急性心肌梗死患者入院后48小時(shí)血清標(biāo)本，共10例，滿足M4470.70≤0.701為終節(jié)點(diǎn)3；終節(jié)點(diǎn)4只包含急性心肌梗死患者入院后12小時(shí)血清，其24例，滿足M4470.70≥0.701為終節(jié)點(diǎn)4；終節(jié)點(diǎn)5只包含心肌梗死患者入院后6小時(shí)血清標(biāo)本，共2例，滿足M6440.42≤1.761為終節(jié)點(diǎn)5；終節(jié)點(diǎn)6只包含心肌梗死患者入院后3小時(shí)血清標(biāo)本，共12例，滿足M6440.42≥1.761為終節(jié)點(diǎn)6；終節(jié)點(diǎn)7只包含心肌梗死患者入院后6小時(shí)后血清標(biāo)本，共20例，滿足M4826.50≥5.114為終節(jié)點(diǎn)7；終節(jié)點(diǎn)8只包含心肌梗死患者入院后24小時(shí)后的血清標(biāo)本，共16例，滿足M6637.82≥14.956為終節(jié)點(diǎn)8，錯(cuò)誤分率為0％。7)、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性從我們的試驗(yàn)結(jié)果看，SELDI-TOF-MS方法[4，5，6]的重復(fù)性很好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，兩樣品孔測(cè)定的結(jié)果滿足。y＝0.9865x+0.098；R2＝0.9583。
全文摘要
一種用血清特異性蛋白質(zhì)組指紋圖譜診斷急性心肌梗死的方法，首先制取蛋白組模板，取一定量心電圖和心肌酶譜診斷為急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛患者及正常對(duì)照人員外周血，4℃冷藏析出血清后，離心吸取血清，分裝，－80℃?zhèn)溆?；檢測(cè)時(shí)按一定濃度稀釋；用美國賽弗吉公司的金屬芯片，置入美國賽弗吉公司飛行質(zhì)譜儀，分析樣品血清蛋白質(zhì)組波譜；對(duì)比分析急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛患者及健康人員血清蛋白質(zhì)組波譜，獲得急性心肌梗死患者血清中特異的蛋白質(zhì)波峰；將發(fā)現(xiàn)的血清中特異的蛋白質(zhì)波峰進(jìn)行組合后形成蛋白質(zhì)模板，采用此模板雙盲法進(jìn)行臨床篩選試驗(yàn)，確定該指紋圖譜的陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、靈敏度、特異度。
文檔編號(hào)G01N30/88GK1588047SQ20041006044
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月30日
發(fā)明者高春芳, 趙光, 宋國英 申請(qǐng)人:高春芳