專利名稱：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析尿液中苯和甲苯四種代謝產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及苯和甲苯代謝產(chǎn)物的分析，特別涉及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析尿液中苯和甲苯四種代謝產(chǎn)物(即反，反粘康酸、1，2-苯二酚、苯巰基尿酸和N-乙?；寤腚装彼?的方法，該分析方法快速、靈敏，準確度高。
背景技術(shù)：
苯和甲苯均為使用非常廣泛的化工原料和有機溶劑，由于其具有揮發(fā)性，所以在大氣以及環(huán)境中無處不在。國際癌癥研究會(IRAC)已經(jīng)證明，苯是一種致癌性化合物，長期暴露于苯環(huán)境中，會引發(fā)白血病、再生性障礙性貧血以及染色體異常等疾??；而甲苯的毒性雖略低于甲苯，但也對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有強烈的毒副作用。除了一些職業(yè)場所暴露外，如油漆廠、石化煉油廠、制鞋廠等外，苯、甲苯在我們?nèi)粘Ｉ钪械谋┞对粗饕獊碜允覂?nèi)裝修材料、家具、油漆以及汽車尾氣等。因此監(jiān)測一些職業(yè)暴露場所以及普通人群體內(nèi)的苯、甲苯暴露水平，既預(yù)估其面臨的環(huán)境風(fēng)險值，也可以用于其健康效應(yīng)的早期評價。苯有三條不同的代謝途徑。苯進入體內(nèi)，經(jīng)P450酶催化，轉(zhuǎn)化為苯酚、1，2-苯酚、反，反-粘康酸以及苯巰基尿酸等代謝產(chǎn)物，最終隨尿排出體外。反，反-粘康酸是以往研究中使用最多的一種指示苯暴露水平的生物標志物。但由于反，反-粘康酸同時也是一種食品添加劑-山梨酸的代謝產(chǎn)物，因此僅僅用反，反-粘康酸的濃度水平來評價苯的暴露水平是不科學(xué)的。最近，苯巰基尿酸也被用于指示苯的環(huán)境暴露。甲苯也有不同的代謝途徑，絕大多數(shù)的甲苯代謝為馬尿酸以及各種甲基馬尿酸，只有約1%的甲苯代謝為N-乙?；寤腚装彼?。但馬尿酸也是尿的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，因此不是甲苯的特異性生物標志物。而N-乙?；寤腚装彼嶙?993年來首次被認定為甲苯的代謝產(chǎn)物，相對于馬尿酸和鄰甲酚，是個更為特異性的甲苯代謝生物標志物，適用于低濃度的甲苯暴露環(huán)境。由于苯、甲苯代謝的途徑多樣化，且基因差異對不同代謝途徑的效率有影響，因此僅僅用反，反-粘康酸或苯巰基尿酸做生物標志物，不能全面地反映苯、甲苯的整體暴露水平和特點。因此利用多個生物標志物(包括反，反粘康酸、1，2-苯二酚、苯巰基尿酸和N-乙?；寤腚装彼?，發(fā)展快速、靈敏的檢測方法，聯(lián)合監(jiān)測苯、甲苯暴露水平和特點成為目前研究的方向和熱點。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明目的在于提供一種固相萃取(SPE)和超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC/MS/MS)技術(shù)分析尿液中苯和甲苯的四種代謝產(chǎn)物(即反，反粘康酸(t，t-MA)、l，2-苯二酚(1，2-DB)、苯巰基尿酸(S-PMA)和N-乙酰基卞基半胱氨酸(S-BMA))的方法。本發(fā)明目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析尿液中苯和甲苯四種代謝產(chǎn)物的方法，包括以下步驟:(I)選取反，反粘康酸、1，2-苯二酚、苯巰基尿酸和N-乙?；寤腚装彼嶙鳛楸胶图妆降奶卣鞔x產(chǎn)物；配制含有上述四種特征代謝產(chǎn)物的單一標準品儲備溶液、含有上述四種特征代謝產(chǎn)物同位素內(nèi)標物的單一標準品儲備溶液、以及含有上述四種特征代謝產(chǎn)物及其相應(yīng)的同位素內(nèi)標物的混合工作標準品溶液；特征代謝產(chǎn)物及其相應(yīng)同位素內(nèi)標物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示:
權(quán)利要求
1.一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析尿液中苯和甲苯四種代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)選取反，反粘康酸、1，2-苯二酚、苯巰基尿酸和N-乙?；寤腚装彼嶙鳛楸胶图妆降奶卣鞔x產(chǎn)物；配制含有上述四種特征代謝產(chǎn)物的單一標準品儲備溶液、含有上述四種特征代謝產(chǎn)物同位素內(nèi)標物的單一標準品儲備溶液、以及含有上述四種特征代謝產(chǎn)物及其相應(yīng)的同位素內(nèi)標物的混合工作標準品溶液； (2)配制系列濃度的混合標樣工作液；系列濃度的混合標樣工作液中，內(nèi)標的濃度保持不變，而目標化合物濃度成比例增長；將系列濃度的混合標樣工作液注入色譜柱進行儀器分析，以(標樣峰面積/內(nèi)標樣峰面積)為響應(yīng)值；根據(jù)響應(yīng)值與工作標樣濃度之間存在的線性關(guān)系，即W=fXA，制成標準曲線； (3)取待測尿樣，加入一定量的含四種特征代謝產(chǎn)物同位素內(nèi)標物混合工作標準品溶液，使內(nèi)標物的濃度介于標準曲線各濃度點的中部；調(diào)節(jié)待測樣品的PH值為4.5，然后用甲醇、水、醋酸緩沖液分別活化后的固相萃取小柱吸附目標化合物；接著用醋酸緩沖液和水淋洗固相萃取小柱，除去雜質(zhì)；真空抽干固相萃取小柱，然后用乙腈洗脫目標化合物；洗脫液用氮氣吹干后，用少量甲醇溶液溶解，然后進行儀器分析；得到四種特征代謝產(chǎn)物的響應(yīng)值； (4)根據(jù)已知的系數(shù)f，求出尿樣中四種特征代謝產(chǎn)物的濃度； 步驟(2)和(3)中所述的儀器分析是采用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，色譜柱采用粒徑〈2 μ m的反相C18色譜柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析尿液中苯和甲苯四種代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于:步驟(2)所述系列濃度的混合標樣工作液中，反，反粘康酸的濃度范圍是.15.63-4000 μ g/L，I, 2-苯二酚的濃度范圍是7.81-2000 μ g/L，苯巰基尿酸的濃度范圍是.0.20-200 μ g/L, N-乙?；寤腚装彼岬臐舛确秶?.39-100 μ g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析尿液中苯和甲苯四種代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于:所述的超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，質(zhì)譜條件見表I ;色譜分離條件見表.2 ； 表1:質(zhì)譜條件
全文摘要
本發(fā)明公開了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析尿液中苯和甲苯四種代謝產(chǎn)物的方法，該方法包括以下步驟配制系列濃度的混合標樣工作液，進行儀器分析，根據(jù)響應(yīng)值與工作標樣濃度之間存在的線性關(guān)系制成標準曲線；取待測尿樣，加入含四種特征代謝產(chǎn)物同位素內(nèi)標物混合工作標準品溶液；用固相萃取小柱吸附目標化合物，然后進行儀器分析；得到四種特征代謝產(chǎn)物的響應(yīng)值；根據(jù)已知的系數(shù)f，求出尿樣中四種特征代謝產(chǎn)物的濃度。所述的儀器分析是采用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，色譜柱采用粒徑<2μm的反相C18色譜柱。本發(fā)明方法簡化了樣品前處理步驟，縮短了樣品儀器分析時間，定量準確性高。同時，本發(fā)明方法的儀器檢出限和方法檢出限非常低，提高了低濃度非職業(yè)暴露人群的檢出率。
文檔編號G01N30/02GK103175921SQ201310067770
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者范瑞芳 申請人:華南師范大學(xué)