專利名稱：環(huán)糊精的檢測和定量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在含蛋白質(zhì)的溶液中的環(huán)糊精以及環(huán)糊精衍生物的檢測和定量。本發(fā)明進一步涉及評估藥物制劑中的殘留環(huán)糊精的存在的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)糊精是一種環(huán)狀多糖，通常多由六個(α-環(huán)糊精)、七個(β_環(huán)糊精)或八個(Y-環(huán)糊精)葡萄糖單元組成，這些葡萄糖單元由α-1，4-葡萄糖苷鍵連接為環(huán)狀的環(huán)。這些葡萄糖單元形成 椅式構(gòu)象后，所有的仲羥基位于該環(huán)的一側(cè)，而所有的伯羥基基團均位于另一側(cè)。其結(jié)果是，其外部表面是親水的，從而使環(huán)糊精可水溶解。相反，環(huán)糊精的空腔是疏水的，因為它們由(:3和C5原子的氫以及醚樣氧連接。這種結(jié)構(gòu)允許環(huán)糊精與疏水化合物形成包合物(inclusion complex)?；谠撎匦?，環(huán)糊精廣泛地用于提高難水溶藥物的水溶性，加強藥物穩(wěn)定性，并降低藥物的不期望出現(xiàn)的負作用。該環(huán)糊精的羥基基團可以衍生，以改變分子的特性(例如:水溶性、結(jié)合特性)。甲基-β -環(huán)糊精(MB⑶)是其中一種最常使用的環(huán)糊精衍生物。環(huán)糊精也應(yīng)用在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中以將疏水營養(yǎng)物，例如膽固醇，轉(zhuǎn)運入細胞中。環(huán)糊精對培養(yǎng)膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞特別有用，例如膽固醇營養(yǎng)缺陷型CHO細胞、COS細胞以及NSO細胞。當細胞培養(yǎng)被用來制備自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或重組蛋白質(zhì)、特別是藥用蛋白質(zhì)時，在純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中作為殘留的污染物存在的環(huán)糊精在藥物制備中成為一個問題。因此，需要一種靈敏和快速的技術(shù)，以檢測和定量含蛋白質(zhì)溶液中的低水平的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物。Grosse 等人(J.Chromatography B694:219 (1997))披露了一種用于檢測 MBCD 的技術(shù)，該技術(shù)利用尺寸排除色譜法，并采用一種可與MBCD形成包合物的熒光團(1-萘酚)，從而允許對該包合物的熒光檢測。該技術(shù)被設(shè)計為用來檢測血漿樣本中的MBCD，以用作藥物動力學(xué)研究，其需要在運用色譜法之前，在流動相中利用有機溶劑萃取樣本，蒸發(fā)和溶解殘留物。Gage 等人(J.Pharm.Biomed.Analysis22:773 (2000))披露了一種利用 1-萘酚，用于測量在血漿樣本中的硫代丁基醚_β -環(huán)糊精的類似技術(shù)。該方法需要在運用色譜法之前處理樣本，包括固相萃取、蒸發(fā)、以及溶解殘留物。這些技術(shù)不能達到從蛋白質(zhì)組合物中分離環(huán)糊精的效果。在本技術(shù)領(lǐng)域中，需要一種用于檢測蛋白質(zhì)中環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的存在的方法，優(yōu)選地不需要樣本萃取步驟。

發(fā)明內(nèi)容
因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測在含蛋白質(zhì)溶液中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的存在的方法，該方法包括通過尺寸排除色譜法(SEC)從所述蛋白質(zhì)中分離可能存在的任何環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，將所述環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可檢測的包合物，以及測量來自于所述包合物的信號的存在。本發(fā)明的另一個方面，為一種用于確定在含蛋白質(zhì)溶液中可能存在的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的量的方法，該方法包括通過SEC從所述蛋白質(zhì)分離任何環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，將所述環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可檢測的包合物，測量來自于所述包合物的信號的存在，以及確定所述信號的大小，其中該信號的大小指示在該溶液中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的量。本發(fā)明的第三個方面，是一種評估藥物制劑的方法，該方法包括:(a)提供一種包括藥用蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑；(b)利用SEC分離所述藥物制劑；(C)將可能存在于所述藥物制劑中 的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可檢測的包合物；以及(d)檢測來自于所述包合物的信號，其中該信號的大小指示在該制劑中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的量。在本發(fā)明的一個實施方式中，該環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物為MB⑶。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該制劑為一種熒光團，例如，1-萘酚。該制劑可在由SEC進行分離之前、該分離期間或者分離后與該環(huán)糊精或該環(huán)糊精衍生物相接觸。在一個實施方式中，該溶液或藥物制劑的樣本可不作任何準備地被裝載于該SEC柱上，例如，該樣本不需利用有機溶劑進行萃取、干燥、再懸浮、濃縮或其它改變。


圖1顯示了有或沒有MB⑶的提純natilizumab藥物制劑的代表性色譜。(a)藥物制劑(19.6mg/mL natilizumab)； (b)制劑緩沖液；(c)摻入1.3 μ g/mL MBO)的藥物制劑(19.6mg/mL natilizumab)。圖2顯示了該MB⑶標準的線性曲線。圖3顯示了摻有MB⑶的natilizumab的藥物制劑的線性曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及在含蛋白質(zhì)的溶液中的低水平的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的檢測和定量。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法有助于評估由在環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物存在下生長的細胞所制備的純化的蛋白質(zhì)中的殘留環(huán)糊精的存在。相應(yīng)地，在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測含蛋白質(zhì)溶液中環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的方法，該方法包括通過SEC從所述蛋白質(zhì)中分離可能存在的任何環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，將所述環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可檢測的包合物，以及檢測來自于所述包合物的信號的存在。本發(fā)明的另一個方面，為一種用于測定在含蛋白質(zhì)溶液中可能存在的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的量的方法，該方法包括通過SEC從所述蛋白質(zhì)分離任何環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，將所述環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可檢測的包合物，檢測來自于所述包合物的信號的存在，以及確定所述信號的大小，其中該信號的大小指示在該溶液中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的量。本發(fā)明的第三個方面，是一種評估藥物制劑的方法，該方法包括:(a)提供一種包括藥用蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑；(b)利用SEC分離所述藥物制劑；(C)將任何可能存在于所述藥物制劑中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可檢測的包合物；以及(d)檢測來自于所述包合物的信號，其中該信號的大小指示在該藥物制劑中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的量。本文中，用語“環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物”是指任何已知的環(huán)糊精，尤其是α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和Y-環(huán)糊精，以及任何已知的環(huán)糊精衍生物。環(huán)糊精衍生物在美國申請?zhí)?3，426，011,3, 453，257,3, 453，258,3, 453，259,3, 453，260,3, 459，731,3, 553，191、3，565，887,4, 383，992,4, 535，152,4, 616，008,4, 638，058,4, 659，696,4, 746，734、4，678，598,5, 594，125,5, 710，268、以及5，831，081中被披露，這些美國申請在此均合并作為參考。環(huán)糊精衍生物的示例包括MB⑶、羥乙基-β -環(huán)糊精以及羥丙基-β -環(huán)糊精。環(huán)糊精以及環(huán)糊精衍生物可從美國Maize Products公司、Wacker Chemicals (USA)公司以及 Sigma-Aldrich Chemical 公司購得。本文中，用語“可與環(huán)糊精以及環(huán)糊精衍生物形成可檢測的包合物的制劑”是指任何可與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成包合物的制劑，其中該包合物通過由SEC柱洗脫而可被檢測。該用語包括本身不可測、但含有可測標簽(例如，放射性核素或熒光標簽)的制劑。該用語還包括本身不可測、但可與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可測的包合物的制劑。檢測方法的示例包括，但不限于，熒光檢測、紫外線檢測、放射檢測、比色檢測、熒光偏振檢測、蒸發(fā)光散射、毛細管電泳、紅外光譜、1H NMR、以及質(zhì)譜。在一個實施方式中，該可檢測制劑為熒光團，例如1-萘酚。也可使用其它的可檢測制劑，例如酚酞和8-苯胺萘1-磺酸。本文中，用語“藥物蛋白質(zhì)”是指任何已知可用于預(yù)防、治療或改善疾病或失調(diào)的任何肽或蛋白質(zhì)，例如抗體、生長因子、細胞表面受體、細胞因子、激素、毒素或者任何前述蛋白質(zhì)的片段和/或融合蛋白質(zhì)。用語“抗體”采用其最寬泛的含義，包括單克隆抗體、嵌合、人源化或完全人抗體以及抗原結(jié)合抗體片段和/或其衍生物，例如單鏈抗體、輕鏈或重鏈二聚物以及Fv、Fab和(Fab’)2片段。藥物蛋白質(zhì)的示例包括，但不限于，諸如促紅細胞生成素、生長激素、集落刺激因子、胰島素等蛋白質(zhì)，以及諸如natilizumab、英夫單抗(infliximab)、adalimumab、MabThera、Herceptin、Palivizumab、阿昔單抗(Abciximab)、Alemtuzumab λ 0KT3-muromonab_CD3、Basiliximab、Gemtuzumab Λ ozogamicin、Omalizumab、Ibritumomab tiuxetan、Edreco1mab-Mab17-1ΑΛ Tositumomab、efalizumab、bevacizumab以及cetuximab等藥用抗體。該蛋白質(zhì)可從在其中自然生長的細胞中分離出來，或者從已經(jīng)被遺傳工程化以表達(例如被重組表達)該蛋白質(zhì)的細胞中分離出來。 本文中，用語“至少90% (或更高)純度”以及“至少90% (或更高)同質(zhì)”，是指從其它蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸以及其它細胞組分物中提純出來的蛋白質(zhì)，從而使該蛋白質(zhì)占該提純制劑干重的至少90% (或更高)。在一些實施方式中，蛋白質(zhì)可至少為91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 純度。本文中，用于細胞系的用語“其衍生物”，是指任何由該細胞系產(chǎn)生的、具有至少一個新的特性的任何細胞。具有新的特性的細胞衍生物包括，但不限于，具有不同生長形式的細胞(例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型)，其可由選擇性的壓力產(chǎn)生，以及被遺傳工程化以表達蛋白質(zhì)或顯示出一些其它新的行為的細胞。在本發(fā)明的方法中，該SEC柱可以是任何合適的尺寸，并包括任何適用于從蛋白質(zhì)中分離環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的SEC介質(zhì)。在一個實施方式中，該SEC介質(zhì)具有一個從約5-20kDa到約75-300kDa的分離范圍。該SEC介質(zhì)可具有約2至約6微米、優(yōu)選地約3_5微米的粒度，例如，約4微米。一種合適的SEC介質(zhì)的示例為TSK凝膠G2000SWa (TosohBiosciences公司)。另外一種合適的SEC介質(zhì)為聚合體基TSK凝膠柱。在一個優(yōu)選的實施方式中，該分離由高壓液相色譜法(HPLC)實施。對于HPLC，SEC柱的合適大小為直徑在約5mm至約15mm的范圍內(nèi)，長度為約3cm至60cm。樣本大小可在約10 μ L至約500 μ L的范圍內(nèi)，優(yōu)選地為約50 μ L至約100 μ L0加載到該SEC柱上的樣本可以為來自于任何含蛋白質(zhì)溶液的樣本，并期望檢測該樣本中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的存在。在本發(fā)明的一個實施例中，該樣本來自含蛋白質(zhì)的溶液，該蛋白質(zhì)正在提純過程中，或者已經(jīng)被提純，并且在該蛋白質(zhì)中期望確定環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的存在或者含量。在一個實施方式中，該蛋白質(zhì)已經(jīng)被或正在被從細胞中純化，所述細胞生長在有環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物存在的細胞培養(yǎng)物中。該樣本可取自處于蛋白提純過程中任何階段的溶液，例如，在細胞裂解后，在一個或更多提純步驟后(例如離子交換色譜法，親和色譜法，等)或者在最終提純步驟后。溶液中的蛋白質(zhì)至少為90%純度，優(yōu)選地至少為95%、96%、97%、98%、或99%純度。在一個實施方式中，該樣本取自于具有小于20 μ g/mL環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的溶液，優(yōu)選地取自具有小于10 μ g/mL,5 μ g/mL,2 μ g/mL或I μ g/mL環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的溶液。該樣本可由含蛋白質(zhì)溶液獲取，并且只要該溶液的緩沖劑適合于SEC，該樣本即可直接裝載在SEC柱上。如有 必要，該樣本的緩沖劑可被調(diào)整為適合SEC。用于SEC的合適的緩沖劑為PH值在約2.0至約8.0之間，優(yōu)選地在約5.0至約7.5之間的含水緩沖液(aqueousbuffer)。合適的緩沖劑的示例包括，但不限于，磷酸鈉、磷酸鉀、醋酸鈉、檸檬酸鈉、硝酸鉀、以及Tris-HCL。緩沖液還應(yīng)包括足夠的鹽，以防止樣本中的蛋白質(zhì)粘附于SEC柱和SEC介質(zhì)。鹽的合適水平在約50mM至約300mM的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在約IOOmM至約200mM的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地為約140mM?？捎玫柠}的示例包括，但不限于，氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸銨、以及氯化鎂。優(yōu)選地該鹽為氯化鈉。在本發(fā)明的一個實施方式中，該樣本除必要時調(diào)整緩沖劑外，不進行任何準備步驟。例如，該樣本不萃取(例如，利用有機溶劑或固相柱)、干燥、再懸浮、濃縮或其它改變。本發(fā)明的優(yōu)點之一在于，可將樣本直接裝載在SEC柱上(例如，可在裝入處檢測藥物制劑)，而不需要復(fù)雜的萃取或其它操作(例如，可能會影響樣本回收的溶劑或固相萃取)。流動相可以是PH值為約2.0至約8.0之間，優(yōu)選地為約5.0至約7.5之間的含水緩沖液，并包括足夠的鹽，以防止樣本中的蛋白質(zhì)粘附于柱或SEC介質(zhì)(例如，約50mM至約300mM的鹽，優(yōu)選地約IOOmM至約200mM)。合適的緩沖劑和鹽如上述樣本制備中所列的那些。一個合適的流動相的示例為:140mM的NaCl，IOmM的磷酸鹽，pH值為6.45。
與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可檢測包合物的制劑可在樣本被SEC分離前，被分離過程中或者被分離后，與該樣本中任何環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物相接觸。例如，該制劑可在樣本裝載于柱之前而添加于該樣本，該制劑可在流動相中存在，該制劑可添加于從柱上收集的洗脫組分，或者上述情況的組合。在一個優(yōu)選的實施方式中，該制劑存在于流動相里。由于不同的環(huán)糊精具有不同的結(jié)合特性，因此制劑的選擇取決于將要被檢測的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物。合適的制劑在本領(lǐng)域中是熟知的，但依然要根據(jù)每種環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物而經(jīng)驗地確定。該制劑可具有固有的可檢測信號(例如，熒光)，或者可具有可檢測的附加標簽(例如，熒光團或放射性核素)。在另外的實施方式中，該制劑不具有固有的可檢測信號，但當該制劑結(jié)合到環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物時，形成的包合物產(chǎn)生可檢測信號。用作MBCD檢測的合適熒光化合物的一個示例為1-萘酚。其它合適的熒光化合物的示例包括酚酞和8-苯胺萘1-磺酸。如果該制劑可水溶，則可直接添加入該流動相。如果該制劑是不可水溶的，它可被溶解于一種有機溶劑，包括，但不限于，甲醇、乙醇、氯仿或者丙酮，然后添加入該流動相，以使該有機溶劑為低百分比(例如，小于10%，優(yōu)選地小于9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%)。該流動相中制劑的濃度可足夠用作要被檢測的信號。例如，1-萘酚或其它熒光化合物在流動相中的濃度為約I X 10_8至I X 10_2M，優(yōu)選地為約I X 10_5至I X 10_3M，更優(yōu)選地為約1X10_4M。該SEC分離可通過本領(lǐng)域中熟知的方法進行，采用合適的柱制備、樣本裝載、流動速率、組分收集和信號檢測技術(shù)。例如，參見:Deutscher, Meth.Enzymol:Guide to ProteinPurification, Vol.182,Academic Press, Inc., San Diego (1990), Chapter38;Balch等人,Meth.Enzymol., Vol.257, Academic Press, Inc., San Diego (1995),第 8章；Scopes,Protein Purification!Principles and Practice, Springer-Verlag(1994)
;Sambrook 等人，in Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel 等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,均通過引用并入。在一個優(yōu)選的實施方式中該分離通過HPLC完成。信號檢測器可以是任何有助于測量該制劑的檢測器，例如，熒光檢測器、紫外線檢測器或放射檢測器，并且可與該柱結(jié)合使用或者分開使用。當熒光團用作制劑時，熒光檢測器可以設(shè)置為本 領(lǐng)域中熟知的合適的激發(fā)和發(fā)射波長，例如，對于1-萘酚，分別為290nm和360nm。當該環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物要被定量時，該被檢測信號的大小可被測量，并與標準曲線(該標準曲線由摻入遞增量制劑的樣本制作)相比較，以測量樣本中環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的量。利用本發(fā)明的方法，環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的測量限度可小于ΙΟΟμ g/mL，優(yōu)選地小于 50 μ g/mL>20 μ g/mL、10 μ g/mL、5 μ g/mL、2 μ g/mL、或 I μ g/mL。蛋白質(zhì)，尤其是藥用蛋白質(zhì)，可從細胞培養(yǎng)中提純并制備為藥用制劑。細胞可在環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物存在下培養(yǎng)，尤其是當該細胞依賴于疏水化合物而生長時，例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞(例如，CH0、C0S、或NSO細胞的膽固醇缺陷型衍生物)。在本發(fā)明的一個方面，可以評估藥物制劑中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的存在。在本發(fā)明的方法中，可以使用任何本領(lǐng)域中熟知的用于蛋白質(zhì)表達的細胞。示例包括NSO細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，人類腎293細胞、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、HeLa細胞、以及鼠L細胞、BHK、HL-60、U937、HaK或者Jurkat細胞。細胞可利用本領(lǐng)域熟知的任何方法培養(yǎng)。在一個實施方式中，該細胞為膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞(例如，NSO細胞或者由其衍生的細胞)。在另一個實施方式中，該細胞在MBCD存在下培養(yǎng)。該培養(yǎng)的細胞可自然地表達將要被提純的蛋白質(zhì)，或者被遺傳工程化以表達該蛋白質(zhì)。用于遺傳工程化細胞以表達目的蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。例如，參見 Sambrook 等人，in Molecular Cloning:A Laboratory Manual ；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,均在此通過引用結(jié)合。細胞在環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物存在下培養(yǎng)。然后，利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(例如，離子交換色譜法、親和色譜法、尺寸排除色譜法、差示溶解度、超濾等)，從該培養(yǎng)的細胞中或者從培養(yǎng)基中提純蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)可提純?yōu)橹辽?0%同質(zhì)，優(yōu)選地至少95%、96%、97%、98%、或99%同質(zhì)。然后該提純的蛋白質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合以生產(chǎn)藥物制劑。藥學(xué)上可接受的載體包括藥學(xué)上可用的有利于將蛋白質(zhì)加工成藥劑的賦形劑和添加劑。賦形劑的示例包括，但不限于，水、鹽水、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、甘油、乙醇，及其類似物。本領(lǐng)域中熟知的添加劑包括，例如，表面活性劑(例如TWEEN，比如TWEEN-80)，防粘劑、消泡劑、緩沖劑、抗氧化劑(例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)以及生育酚例如α-生育酚(維生素E))、防腐劑、螯合劑、增稠劑、填充劑、結(jié)合劑、潤滑劑、粘度調(diào)節(jié)劑、增強劑(ton i c i fi er s )、食用香料、著色劑、氣味劑、不透明劑、懸浮齊U、以及塑形劑。優(yōu)選地，該藥物制劑為用于注射或口服給藥的合適的溶液，并含有約0.01%至約99%、優(yōu)選地約0.25%至約75%的蛋白質(zhì)及其賦形劑。環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的存在可在提純的任何階段被確定。在一個實施方式中，環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的存在在最終的藥物制劑中被確定。該方法可進一步包括形成一個在樣本中(例如，在最終提純的藥物制劑中)的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物水平的記錄(例如，打印或計算機可讀記錄，如標簽)。以下實施例為本發(fā)明的方法和組成的示例但非限制性說明。在色譜法、藥物制劑和評估中，其它多種情況和參數(shù)的合適的修改和調(diào)整是常見的，其對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的，亦應(yīng)在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。實施例1 Natilizumab在膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞中被重組表達，該細胞在約720mg/L MB⑶存在下培養(yǎng)?？贵w在三個常規(guī)色譜法步驟中被提純。開發(fā)出一種用于在每個提純步驟后以及在最終的抗體制劑(適合于藥物應(yīng)用)中確定存在的MBCD的量的方法。通過HPLC，樣本在SEC柱上被分離(TSK凝膠，G2000SWXl，7.8mmX30cm)o流動相包括140mM NaCl, IOmM磷酸鹽，pH6.45/2% (v/v)的甲醇和KT4M的1-萘酚，樣本的體積為50 μ L (Waters熒光檢測器)或IOOyL (Rainin熒光檢測器)。流動速率在等度條件下為ImL/分。該MBCD/1-萘酚包合物利用激發(fā)和發(fā)射波長分別為290和360nm的熒光檢測器檢測。利用在pH為6.1的含水緩沖液中的MBCD標準(水中1.0mg/mL的MBCD)的連續(xù)稀釋進行檢測限度測試。利用該技術(shù)，確定的檢測限度為1.3 μ g/mL。實施相同的測試，以確定來自于三個色譜柱中每個以及最終的提純抗體制劑的洗脫樣本的檢測限度。該樣本中的檢測限度非常低，范圍從1.3 μ g/mL到5.2 μ g/mL,平均為3.0 μ g/mL。代表性的色譜如圖1所示。為評定該測試的線性，5個含1.3,2.6、10、26、和65 μ g/mLMBCD的標準以50 μ L的體積被注入到HPLC柱。該線性最小平方回歸如圖2所示。結(jié)果顯示該測試具有高線性，相關(guān)系數(shù)為0.998。還利用摻入有1.3,2.6,5.0、10.0,20.0、和50.0 μ g/mL的MBCD的最終抗體制劑樣本觀察線性情況。結(jié)果(圖3)顯示該測試具有高線性，相關(guān)系數(shù)為0.999。通過將峰面積與對應(yīng)的MBCD標準中的那些峰面積相比較，計算出最終抗體制劑中的MBCD的回收。如表I中總結(jié)的那樣，檢測的MBCD濃度回收為從97%到117%。表I
權(quán)利要求
1.一種用于檢測含蛋白質(zhì)溶液中的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的存在的方法，該方法包括在尺寸排除色譜柱上裝載溶液樣本，其中所述樣本在裝載于所述柱之前不進行萃取步驟，通過尺寸排除色譜法(SEC)從所述蛋白質(zhì)中分離可能存在的任何環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，將所述環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成可檢測的包合物，以及檢測來自于所述包合物的信號的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物為甲基環(huán)糊精。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為藥用蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為重組蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶液包括小于20μ g/mL的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制劑為熒光化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述制劑為1-萘酚。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法具有小于10μ g/mL的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物檢測限度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述方法具有小于2μ g/mL的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物檢測限度。
全文摘要
本發(fā)明涉及含蛋白質(zhì)溶液中的環(huán)糊精和環(huán)糊精衍生物的檢測和量化。本發(fā)明進一步涉及評估藥物制劑中的殘留環(huán)糊精的存在的方法。
文檔編號G01N30/88GK103217500SQ20131009050
公開日2013年7月24日 申請日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月6日
發(fā)明者佐蘭·索希奇, 魯林·奎蘭, 詹姆斯·埃亨, 羅賓·姆哈特雷 申請人:比奧根艾迪克Ma公司