專利名稱：魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種脈沖場凝膠電泳分型方法，尤其是一種魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法。
背景技術：
鏈球菌是在自然界中廣泛存在的一種條件致病菌，2009年以來，由無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚鏈球菌(Streptococcus inia)引起的鏈球菌病嚴重制約了我國羅非魚產業(yè)的發(fā)展，并呈現(xiàn)發(fā)病區(qū)域逐年擴大、發(fā)病率和死亡率逐年升高，易感羅非魚規(guī)格范圍逐年擴大等新趨勢。傳染性疾病的爆發(fā)，需要對致病微生物進行分型，分型方法包括基于表型特征分析的表型方法和基于基因型特征的基因型方法。目前流行的基因型分型方法包括質粒分型、限制性內切酶分析(REA)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型和基于PCR(聚合酶鏈反應,polymerase chain react ion )技術的隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD )、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、細菌基因組重復序列PCR技術(I^p PCR)和多位點序列分型(MLST)等。質粒分型的缺點是檢測對象是質粒，而不是遺傳穩(wěn)定性更高的染色體；REA技術的缺點是大量小片段DNA用傳統(tǒng)瓊脂糖電泳難以區(qū)分和比較；PCR技術的優(yōu)點是快速便捷，缺點是檢測的都只是染色體的部分片段；而脈沖場凝膠電泳分型方法應用廣泛，重復性和穩(wěn)定性高，檢測的是整個染色體DNA，不受表型性狀易變的影響，被認為是微生物分子分型的金標準。但目前國 際上的鏈球菌脈沖場凝膠電泳的實驗流程一般需要6 8天，耗時較長。脈沖場凝膠電泳的結果取決于DNA分離應用的實驗條件以及所研究的微生物的屬和種。膠塊的制備、細胞的裂解、膠塊的水洗溫度和時間限制性內切酶選擇，電泳參數(shù)等許多因素都能影響脈沖場凝膠電泳的結果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中存在的不足，提供一種魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法，其對鏈球菌具有更強、更快的分型區(qū)分能力。按照本發(fā)明提供的技術方案，一種魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法，采用從魚源上分離并培養(yǎng)得到的鏈球菌作為分析樣品，特征是，包括以下工藝步驟:(I)膠塊制備:(1-1)、將鏈球菌樣品在血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 24小時后,用無菌接種環(huán)刮取單菌落重懸于2ml的TE緩沖液中，得到細菌懸濁液，調整細菌懸濁液的OD值為3.6 4.5 ;(1-2)、取160 185 μ L細菌懸濁液于1.5ml離心管中，加入5 10 μ L濃度為10mg/ml的溶菌酶，混合均勻；將細菌懸濁液與溶菌酶的混合溶液置于37°C水浴中孵育15 30分鐘；從水浴中取出離心管,加入5 10μ L濃度為20mg/ml的蛋白酶K和5 20 μ L濃度為lmg/ml的變溶菌素；(1-3)、將TBE緩沖液和低熔點瓊脂糖混合，每100ml TBE緩沖液中加入I 1.5g低熔點瓊脂糖，得到凝膠溶液；將凝膠溶液放置在42 45°C的水浴中平衡，備用；
(1-4)、將200 μ L凝膠溶液加入步驟(1_2)得到的細菌懸濁液中，混合均勻；(1-5)、將步驟(1-4)得到的混合物加入成膠模具進行凝固，避免氣泡產生，在室溫下凝固15分鐘，得到膠塊；(2)細胞裂解:(2-1)、配制細胞裂解液:將1.5ml的ES緩沖液加入到50 75 μ L濃度為20mg/ml的蛋白酶K中，混合均勻，得到細胞裂解液；將細胞裂解液置于冰上，備用；(2-2)、將1.5ml細胞裂解液加入到2ml的螺旋蓋離心管中；(2-3)、將步驟(1-5)得到的膠塊放入步驟(2-2)的螺旋蓋離心管中，用刀片削去成膠模具表面多余的膠塊，并保證膠塊在液面以下，不與離心管的管壁接觸；(2-4)、將步驟(2-3)的螺刻蓋離心管放置在54 56°C水浴搖床中孵育90 120min，搖床轉速為120 170轉/分鐘；(3)洗膠塊:(3-1)、將TE緩沖液和純水放置在50°C的水浴搖床中預熱，備用；(3-2)、將步驟(2-4)處理后的螺旋蓋離心管從水浴搖床中拿出，蓋上濾篩蓋，倒掉螺旋蓋離心管中的細胞裂解液；將膠塊轉移至5ml的螺旋蓋離心管中，向該5ml的螺旋蓋離心管中加入4ml經步驟(3-1)預熱后的純水，確保膠塊位于液面以下，將螺旋蓋離心管放回50°C水浴搖床中搖10 15分鐘，水浴處理結束將螺旋蓋離心管中的純水倒掉；再次向螺刻蓋離心管中加入4ml步驟(3-1)預熱后的純水，50°C水浴搖床中搖10 15分鐘，水浴處理后將螺旋蓋離心管中的純水倒掉；(3-3)、向步驟(3-2)處理后的膠塊中加入4ml經步驟(3_1)預熱后的TE緩沖液，再在50°C的水浴搖床中搖10 15分鐘，倒掉TE緩沖液；(3-4)、重復步驟(3-3)2 3次后，向膠塊中加入4ml的TE緩沖液，放置在4°C的冰箱中保存?zhèn)溆茫?4)膠塊內DNA的酶切:(4-1)、配制酶緩沖稀釋液:將180 μ L純水與20 μ L的Sma I限制性內切酶IOX緩沖液混合，得到200 μ L酶緩沖稀釋液；(4-2)、在1.5ml離心管中加入200 μ L酶緩沖稀釋液；(4-3)、將步驟(3-4)得到的膠塊放在培養(yǎng)皿上，切成2mm寬的小膠塊，將小膠塊放入步驟(4-2)的離心管中，確保小膠塊處在液面以下，并將離心管放在冰上孵育10 15分鐘；(4-4)、配制Sma I限制性內切酶的緩沖液:將174 μ L純水、2 μ L濃度為lmg/ml的牛血清蛋白、20 μ L的Sma I限制性內切酶IOX緩沖液和40U的Sma I限制性內切酶混合，得到200 μ L的Sma I限制性內切酶的緩沖液；(4-5)、向經步驟(4-3)孵育后的離心管中加入200 μ L的Sma I限制性內切酶的緩沖液，保證小膠塊位于液面以下，常溫孵育3 5小時；(5)加樣:(5-1)、使電泳梳子齒與膠槽的底面距離為I 2mm,調整膠槽至水平位置；(5-2)、倒掉步驟(4-5)所述離心管中的Sma I限制性內切酶緩沖液，并向離心管中加入200 μ L的TBE緩沖液，備用；
(5-3)、將電泳梳子平放在膠槽上，把步驟(5-2)所述離心管中的小膠塊取出加在電泳梳子齒上，用吸水紙邊緣吸去小膠塊周圍的液體，在室溫下風干3 5分鐘；(5-4)、將步驟(5-3)加過樣的電泳梳子放入膠槽，確保電泳梳子齒上所有的膠塊在一條直線上，并且膠塊與膠槽的底面距離為I 2mm ;從膠槽的下部中央緩慢倒入IOOml溫度為50 60°C的脈沖場瓊脂糖溶液，避免氣泡的生成，再在室溫下凝固20 30分鐘；所述脈沖場瓊脂糖溶液由Ig脈沖場瓊脂糖加入IOOml的TBE溶液中得到；(6)電泳:(6-1)、在電泳槽中加入2.2L的TBE緩沖液，關上蓋子，保持電泳槽中的溫度為14。。；(6-2)、將經步驟(5-4)凝固好的膠塊放入經步驟(6_1)處理后的電泳槽中，進行電泳；所述電泳時的電壓為6V/cm,脈沖時間為10 45秒，電場夾角為120° ,電泳時間為22小時；(7)圖像獲取:(7-1)、取出經步驟(6-2)電泳處理的膠塊，放在盛放有400ml濃度為0.5 μ g/ml的EB溶液的托盤內，將托盤放置在搖床上搖20 30分鐘；再在托盤中的EB溶液換成400ml純水，于搖床上脫色30 60分鐘；(7-2)、從托盤中取出膠塊，吸除膠塊上多余的水份，在凝膠成像系統(tǒng)下拍攝圖像。步驟(1-1)所述TE 緩沖液的組份為:IOOmM TrisUOOmM EDTA, pH 為 7.6。步驟(3-1)所述TE緩沖液的組份為:10mM TrisUmM EDTA, pH為 .6。步驟(1-3)、步驟(5-2)、步驟(5-4)、步驟(6-1)所述的TBE緩沖液為0.5ΧΤΒΕ緩沖液。步驟(2-1)所述的ES緩沖液的組份為:0.5M EDTA、lg/100ml十二烷基肌氨酸，pH為 9.0。本發(fā)明與已有技術相比具有以下優(yōu)點:本發(fā)明從溶菌酶、蛋白酶K和變溶菌素的用量、洗膠塊的水浴溫度和電泳參數(shù)三方面優(yōu)化了現(xiàn)有技術中的鏈球菌PFGE方案，使其成為一種適用于魚源鏈球菌的PFGE的最佳方案。與現(xiàn)有技術中的鏈球菌PFGE方案相比，本發(fā)明方法對魚源鏈球菌的區(qū)分能力更強，整個實驗流程耗時縮短了 3 4天，這對于魚源鏈球菌病監(jiān)測、傳染源追蹤、傳播途徑調查和識別等具有非常重要的意義。


圖1為采用實施例1的方法對2009 2011年我國羅非魚主產區(qū)收集的無乳鏈球菌(菌株信息見表I中標號I 14)進行脈沖場凝膠電泳分型后的電泳結果；1 14泳道，顯示無乳鏈球菌有4種不同的帶型，表明有4種不同基因型。圖2為采用實施例2的方法對2009 2011年我國羅非魚主產區(qū)收集及廣西水產研究所贈送的鏈球菌(菌 株信息見表I中標號15 21)進行脈沖場凝膠電泳分型后的電泳結果；15 18泳道為無乳鏈球菌，顯示有2種不同的帶型，表明有2種不同基因型；19 21泳道為海豚鏈球菌，顯示有3種不同的帶型，表明有3種不同基因型。
具體實施例方式下面結合具體附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明中所使用的Sma I限制性內切酶為市售產品，其中Sma I限制性內切酶IOX緩沖液是購買Sma I限制性內切酶時提供的和Sma I限制性內切酶配套使用的IOX緩沖液。本發(fā)明實施例1、實施例2所采用的鏈球菌樣品是從海南、廣西等羅非魚養(yǎng)殖場分離獲得的19株菌株，以及由廣西水產研究所贈送的2株鏈球菌菌株，具體如表I所示。表1 2009 2011年我國羅非魚主產區(qū)收集的鏈球菌
權利要求
1.一種魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法，采用從魚源上分離并培養(yǎng)得到的鏈球菌作為分析樣品，其特征是，包括以下工藝步驟: (1)I父塊制備: (1-1)、將鏈球菌樣品在血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 24小時后，用無菌接種環(huán)刮取單菌落重懸于2ml的TE緩沖液中，得到細菌懸濁液，調整細菌懸濁液的OD值為3.6 4.5 ; (1-2)、取160 185 μ L細菌懸濁液于1.5ml離心管中，加入5 10 μ L濃度為IOmg/ml的溶菌酶，混合均勻；將細菌懸濁液與溶菌酶的混合溶液置于37°C水浴中孵育15 30分鐘；從水浴中取出離心管，加入5 10^濃度為2011^/1111的蛋白酶K和5 20 μ L濃度為lmg/ml的變溶菌素； (1-3)、將TBE緩沖液和低熔點瓊脂糖混合，每100ml TBE緩沖液中加入I 1.5g低熔點瓊脂糖，得到凝膠溶液；將凝膠溶液放置在42 45°C的水浴中平衡，備用； (1-4)、將200 μ L凝膠溶液加入步驟(1-2)得到的細菌懸濁液中，混合均勻； (1-5)、將步驟(1-4)得到的混合物加入成膠模具進行凝固，避免氣泡產生，在室溫下凝固15分鐘，得到膠塊； (2)細胞裂解: (2-1)、配制細胞裂解液:將1.5ml的ES緩沖液加入到50 75 μ L濃度為20mg/ml的蛋白酶K中，混合均勻，得到細胞裂解液；將細胞裂解液置于冰上，備用； (2-2)、將1.5ml細胞裂解液加入到2ml的螺旋蓋離心管中； (2-3)、將步驟(1-5)得到的膠塊放入步驟(2-2)的螺旋蓋離心管中，用刀片削去成膠模具表面多余的膠塊，并保證膠塊在液面以下，不與離心管的管壁接觸； (2-4)、將步驟(2-3)的螺刻蓋離心管放置在54 56°C水浴搖床中孵育90 120min，搖床轉速為120 170轉/分鐘； (3)洗膠塊: (3-1)、將TE緩沖液和純水放置在50°C的水浴搖床中預熱，備用； (3-2)、將步驟(2-4)處理后的螺旋蓋離心管從水浴搖床中拿出，蓋上濾篩蓋，倒掉螺旋蓋離心管中的細胞裂解液；將膠塊轉移至5ml的螺旋蓋離心管中，向該5ml的螺旋蓋離心管中加入4ml經步驟(3-1)預熱后的純水，確保膠塊位于液面以下，將螺旋蓋離心管放回50°C水浴搖床中搖10 15分鐘，水浴處理結束將螺旋蓋離心管中的純水倒掉；再次向螺刻蓋離心管中加入4ml步驟(3-1)預熱后的純水，50°C水浴搖床中搖10 15分鐘，水浴處理后將螺旋蓋離心管中的純水倒掉； (3-3)、向步驟(3-2)處理后的膠塊中加入4ml經步驟(3_1)預熱后的TE緩沖液，再在50°C的水浴搖床中搖10 15分鐘，倒掉TE緩沖液； (3-4)、重復步驟(3-3)2 3次后，向膠塊中加入4ml的TE緩沖液，放置在4°C的冰箱中保存?zhèn)溆茫? (4)膠塊內DNA的酶切: (4-1)、配制酶緩沖稀釋液:將180 μ L純水與20 μ L的Sma I限制性內切酶IOX緩沖液混合，得到200 μ L酶緩沖稀釋液； (4-2)、在1.5ml 離心管中加入200 μ L酶緩沖稀釋液； (4-3),將步驟(3-4)得到的膠塊放在培養(yǎng)皿上，切成2mm寬的小膠塊，將小膠塊放入步驟(4-2)的離心管中，確保小膠塊處在液面以下，并將離心管放在冰上孵育10 15分鐘；(4-4)、配制Sma I限制性內切酶的緩沖液:將174 μ L純水、2 μ L濃度為lmg/ml的牛血清蛋白、20 μ L的Sma I限制性內切酶10 X緩沖液和40U的Sma I限制性內切酶混合，得到200 μ L的Sma I限制性內切酶的緩沖液； (4-5)、向經步驟(4-3)孵育后的離心管中加入200 μ L的Sma I限制性內切酶的緩沖液，保證小膠塊位于液面以下，常溫孵育3 5小時； (5)加樣: (5-1)、使電泳梳子齒與膠槽的底面距離為I 2_，調整膠槽至水平位置； (5-2)、倒掉步驟(4-5)所述離心管中的Sma I限制性內切酶緩沖液，并向離心管中加入200yL的TBE緩沖液，備用； (5-3)、將電泳梳子平放在膠槽上，把步驟(5-2)所述離心管中的小膠塊取出加在電泳梳子齒上，用吸水紙邊緣吸去小膠塊周圍的液體，在室溫下風干3 5分鐘； (5-4)、將步驟(5-3)加過樣的電泳梳子放入膠槽，確保電泳梳子齒上所有的膠塊在一條直線上，并且膠塊與膠槽的底面距離為I 2mm ;從膠槽的下部中央緩慢倒入IOOml溫度為50 60°C的脈沖場瓊脂糖溶液，避免氣泡的生成，再在室溫下凝固20 30分鐘；所述脈沖場瓊脂糖溶液由Ig脈沖場瓊脂糖加入IOOml的TBE溶液中得到； (6)電泳: (6-1)、在電泳槽中加入2.2L的TBE緩沖液，關上蓋子，保持電泳槽中的溫度為14°C ；(6-2)、將經步驟(5-4)凝固好的膠塊放入經步驟(6-1)處理后的電泳槽中，進行電泳；所述電泳時的電壓為6V/cm,脈沖時間為10 45秒，電場夾角為120° ,電泳時間為22小時； (7)圖像獲取: (7-1)、取出經步驟(6-2)電泳處理的膠塊，放在盛放有400ml濃度為0.5 μ g/ml的EB溶液的托盤內，將托盤放置在搖床上搖20 30分鐘；再在托盤中的EB溶液換成400ml純水，于搖床上脫色30 60分鐘； (7-2)、從托盤中取出膠塊，吸除膠塊上多余的水份，在凝膠成像系統(tǒng)下拍攝圖像。
2.如權利要求1所述的魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法，其特征是:步驟(1-1)所述 TE 緩沖液的組份為:100mM TrisUOOmM EDTA，pHS7.6。
3.如權利要求1所述的魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法，其特征是:步驟(3-1)所述TE緩沖液的組份為:10mM TrisUmM EDTA, pH為7.6。
4.如權利要求1所述的魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法，其特征是:步驟(1-3)、步驟(5-2)、步驟(5-4)、步驟(6-1)所述的TBE緩沖液為0.5 X TBE緩沖液。
5.如權利要求1所述的魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法，其特征是:步驟(2-1)所述的ES緩沖液的組份為:0.5M EDTAUg/lOOml十二烷基肌氨酸，pH為9.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種魚源鏈球菌脈沖場凝膠電泳快速分型方法，以經分離并培養(yǎng)得到的鏈球菌為分析樣品，依次進行以下各步驟膠塊制備、細胞裂解、洗膠塊、膠塊內DNA的酶切、加樣、電泳、圖像獲??；所述的膠塊制備、細胞裂解、洗膠塊、加樣和圖像獲取步驟都按照常規(guī)脈沖場凝膠電泳方法進行，并對各參數(shù)進行優(yōu)化；所述的洗膠塊的水浴溫度為50℃；所述的膠塊內DNA的酶切酶為SmaI酶；所述的電泳參數(shù)中，電壓為6V/cm，對應的脈沖時間為10~45秒，電場夾角為120°，電泳溫度為14℃，總電泳時間為22小時。本發(fā)明對魚源鏈球菌區(qū)分能力更強，整個實驗流程耗時縮短了3~4天，這對于魚源鏈球菌病監(jiān)測、傳染源追蹤、傳播途徑調查和識別等具有重要意義。
文檔編號G01N27/447GK103196980SQ20131010345
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月27日 優(yōu)先權日2013年3月27日
發(fā)明者楊弘, 祝璟琳, 鄒芝英, 單航宇, 韓玨 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心