專利名稱：一種苦味酸天狼猩紅染色法及其在篩選抗肝纖維化化合物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及利用膠原纖維的苦味酸天狼猩紅染色法進行體外高通量篩選抗肝纖維化的有效化合物。
背景技術：
肝纖維化(Liver fibrosis)是指許多慢性肝臟疾病發(fā)病過程中由各種致病因子所致肝內彌漫性細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)過度沉淀的病理過程,其中ECM包括膠原蛋白，纖維連接蛋白，彈性蛋白，層粘連蛋白，透明質酸和蛋白聚糖等。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肝內膠原及其它細胞外基質的主要來源。活化的星狀細胞表達α -平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle act in, a -SMA),分泌1、II1、IV型膠原，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)和金屬蛋白酶抑制劑(tissueinhibitor of metalloproteinase,TIMP)等促纖維化因子，對肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。鑒于HSCs及其功能在肝纖維化形成過程中的重要作用，未來抗肝纖維化一個重要目標就是針對活化的HSCs分泌過剩ECM的直接靶向性，有望提高療效、抑制纖維化形成、減小毒副作用。TGFii I由枯否細胞、淋巴細胞、竇內皮細胞及激活的HSC等合成，是一種對細胞生長、分化和多種生理、病理過程起重要調節(jié)作用的細胞因子，TGFii I信號主要促進ECM的生成。肝纖維化進一步發(fā)展為肝硬化，肝衰竭，往往需要肝移植來根治，由于器官來源嚴重短缺，許多病人在等待器官過程中死亡。我國慢性肝病中以慢性乙型肝炎居多，因病毒的持續(xù)性存在，可導致肝實質發(fā)生炎癥、壞死等病理變化，致使肝臟持續(xù)不斷的纖維增生而逐漸形成肝纖維化。隨著人民生活水平的提高，我國酒精性肝病的發(fā)病率也不斷上升，過度飲酒導致脂肪性肝炎，進一步發(fā)展為肝纖維化。由于其患病人數(shù)多，死亡率高，社會經(jīng)濟負擔重，已成為我國一個重要的公共衛(wèi)生問題。目前已有的測定成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白的方法主要是一些物理化學方法，包括顯色反應(特定的染料)，分子量比較( 瓊脂糖凝膠電泳和色譜法)，免疫反應(特定的抗原一抗體反應)和放射性反應(放射性同位素標記)。其中顯色反應成本低,無毒,簡便,通過多孔板可在體外實現(xiàn)高通量篩選抗肝纖維化化合物的目的。天狼猩紅是陰離子強酸染料，易與膠原纖維中的堿性基團反應。所以苦味酸天狼猩紅染液可使膠原纖維特異性地著染為猩紅色，非膠原纖維部分不見猩紅色背景。具相關文獻報道，苦味酸天狼猩紅染色法應用于心臟膠原纖維、腎臟膠原纖維的定量分析，酒精性肝纖維化的研究以及評價大鼠胰腺纖維化，但是苦味酸天狼猩紅染色多數(shù)是應用于動物組織切片的染色，由于動物體內實驗具有周期長，由于個體差異導致實驗結果不穩(wěn)定等的缺點，所以體內試驗很難實現(xiàn)高通量篩選抗肝纖維化化合物的目的。苦味酸天狼猩紅染色在動物細胞水平利用多孔板進行高通量篩選選抗肝纖維化化合物的研究還未見報道
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于通過膠原蛋白和特定的染料天狼猩紅F3B顯色反應，提供一種利用膠原纖維的苦味酸天狼猩紅染色測定肝星狀細胞分泌膠原含量的方法，該方法具有需要較少量的待測化合物樣品，可在體外高通量篩選抗肝纖維化的有效化合物，較為快速經(jīng)濟等特點。所用細胞為肝星狀細胞系CFSC-B。本發(fā)明提供的苦味酸天狼猩紅染色測定肝星狀細胞分泌膠原含量的方法，并重點對肝星狀細胞CFSC-8B分泌膠原含量進行了相關研究。應用苦味酸天狼猩紅染色測定肝星狀細胞CFSC-8B分泌膠原含量的方法，其步驟如下:
(I)細胞培養(yǎng)。大鼠肝星形細胞CFSC-8B購自中南大學湘雅中心實驗室。細胞培養(yǎng)液為 RPM1-1640 培養(yǎng)基，內含 10%FBS，青霉素 100IU/mL 和鏈霉素 100 μ g/Ml，在 37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞長到適當密度(80-90%融合)后，按1:5傳代。
(2)建模實驗。選取對數(shù)生長期的CFSC-8B細胞，用完全培養(yǎng)基將細胞懸液的濃度調至8 X IO4個/m L接種于96孔板，每孔100 μ L，待細胞長至70-80%時，以含0.5%FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細胞饑餓以達到同步化后，實驗分為以下幾組:
CFSC-8B 細胞常規(guī)培養(yǎng)(對照)組；CFSC-8B TGF-β I 造模劑量(0，2.5，5，10ng/mL)組；時間組(24h和48h);不同染色液體積(150，200，250 μ L)組。(3)苦味酸天狼猩紅染色。按照步驟(2)分別培養(yǎng)24h和48h后，用PBS潤洗細胞三次，Bouin’ s fluid室溫固定lh，吸棄固定液，培養(yǎng)板用PBS清洗三次(直到無黃色的固定液的顏色)，無菌臺空氣干燥；加入天狼猩紅染色液，在搖床上震蕩染色Ih (26°C, IOOrpm);吸棄染色液，0.0lNHCL潤洗細胞三次以除去沒有與細胞膠原結合的染料，用0.1N NaOH溶解與細胞結合的染料，在搖床上震蕩溶解30min (26°C, IOOrpm )，用酶標儀檢測OD54tlnm，以0.1N NaOH調零。其中步驟(3)所述的苦味酸天狼猩紅染色液的配制為:0.1 g天狼猩紅，溶解于100 mL苦味酸飽和水溶液中，Bouin，s fluid的成分及配比為:Bouin，s fluid:15mL飽和苦味酸溶液，5mL甲醒，ImL冰乙酸。本發(fā)明所述的膠原纖維的苦味酸天狼猩紅染色法可測定星狀細胞分泌膠原的含量，通過這個方法利用96孔板可以在體外高通量篩選抗肝纖維化的化合物，較為快速和經(jīng)濟。


圖1為本發(fā)明苦味酸天狼猩紅染色法模型的劑量研究。圖2為本發(fā)明苦味酸天狼猩紅染色法模型的作用時間研究。圖3為本發(fā)明苦味酸天狼猩紅染色法模型的染色液體積研究。
具體實施例方式通過下列實施例可以更好地理解本發(fā)明，它們只是解釋本發(fā)明，而不對其加以限制。實施例1模型建立。(I)選取對數(shù)生長期的CFSC-8B細胞，用完全培養(yǎng)基將細胞懸液的濃度調至8 X IO4個/mL，接種于96孔板，每孔100 μ L，待細胞長至70-80%時，以含0.5%FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細胞饑餓以達到同步化。(2)實驗分為以下幾組:
CFSC-8B細胞常規(guī)培養(yǎng)(對照)組；CFSC-8BTGF-0 I造模劑量(0，2.5,5,10ng/mL)組；時間組(24h和48h);不同染色液體積(150，200，250 μ L)組。(3)苦味酸天狼猩紅染色。按照步驟(2)分別培養(yǎng)24h和48h后，用PBS潤洗細胞三次，Bouin’ s fluid室溫固定lh，吸棄固定液，培養(yǎng)板用PBS清洗三次(直到無黃色的固定液的顏色)，無菌臺空氣干燥；加入天狼猩紅染色液，在搖床上震蕩染色Ih (26°C, IOOrpm)，吸棄染色液，0.0lNHCL潤洗細胞三次以除去沒有與細胞膠原結合的染料，用0.1N NaOH溶解與細胞結合的染料，在搖床上震蕩溶解30min (26°C, IOOrpm )，用酶標儀檢測OD54tol，以 0.1N NaOH 調零。(4)其中步 驟(3)所述的苦味酸天狼猩紅染色液的配制為:0.1 g天狼猩紅，溶解于100 mL苦味酸飽和水溶液中，Bouin’s fluid的成分及配比為:Bouin’s fluid:15mL飽和苦味酸溶液，5mL甲醛，ImL冰乙酸。實驗結果:經(jīng)苦味酸天狼猩紅染色，顯微鏡下TGF- β I刺激組較正常細胞組膠原纖維顏色尤其鮮艷。劑量效應結果見圖1，時間效應結果見圖2，染色液體積結果見圖3。實施例2抗肝纖維化化合物的篩選
(I)MTT檢測不同菌粉提取物對細胞的存活率。選取對數(shù)生長期的CFSC-8B細胞，用完全培養(yǎng)基將細胞懸液的濃度調至3 X IO4個/mL，接種于96孔板，每孔100 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入樟芝，靈芝，蟲草頭孢，蟲草被孢，天麻蜜環(huán)和猴頭菌粉不同極性提取物正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇(200μ g/ml、100、50、25、12.5、6.25,3.125μ g/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h，并且提前4h加入MTT(5mg/ml) 10 μ L，繼續(xù)孵育4h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSOlSOyL,震蕩lOmin，用酶標儀測570nm的OD值。細胞存活率按照以下公式計算:給藥組平均OD值/不加藥的對照組平均OD值X 100%，找到最佳的藥效濃度。(2)用0.5%FBS培養(yǎng)液將CFSC-8B細胞同步化后，實驗分為以下幾組:CFSC-8B細胞常規(guī)培養(yǎng)(對照)組；CFSC-8B TGF-β I造模(模型)組JGF-β I造模CFSC-8B細胞加各種菌粉不同提取物組。(3)細胞分別培養(yǎng)24h和48h后，按實施例1中的步驟(3)苦味酸天狼猩紅染色法從樟芝，靈芝，蟲草頭孢，蟲草被孢，天麻蜜環(huán)和猴頭菌粉不同極性提取物中篩選具有抗肝纖維化的化合物。
權利要求
1.一種苦味酸天狼猩紅染色法，其特征如下:包括以下步驟: (1)將細胞傳代后接種至96孔板，待細胞長至70-80%時，0.5%FBS將細胞進行同步化處理24h，實驗分為對照組及TGF- β I刺激組，作用不同的時間； (2)用PBS潤洗細胞三次，Bouin’s fluid室溫固定lh，吸棄固定液，培養(yǎng)板用PBS清洗三次(直到無黃色的固定液的顏色)，無菌臺空氣干燥； (3)加入天狼猩紅染色液，在搖床上震蕩染色lh，26°C，IOOrpm； (4)吸棄染色液，0.0lN HCL潤洗細胞三次以除去沒有與細胞膠原結合料； (5)用0.1N NaOH溶解與細胞結合的染料，在搖床上震蕩溶解30min，26°C，IOOrpm ； (6)用酶標儀檢測OD54tlnm,以0.1N NaOH調零。
2.權利要求1所述的方法在篩選抗肝纖維化化合物中的應用方法，所述TGF-βI刺激組所用的TGF- β 劑量為O、2.5、5、10ng/mL，所述作用不同時間為24h和48h，所述加入苦味酸天狼猩紅染色液的體積分別為150 μ L、200 μ L、250 μ L ;試驗表明TGF-β I的最佳劑量為10ng/mL,最佳作用時間為48h ,最佳苦味酸天狼猩紅染色液的體積為200 μ L。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及利用膠原纖維的苦味酸天狼猩紅染色法高通量篩選抗肝纖維化的有效化合物，所用細胞為肝星狀細胞系CFSC-8B。轉化生長因子TGF-β-1在劑量為10ng/mL，作用時間48h時可顯著誘導CFSC-8B細胞分泌膠原，利用苦味酸天狼猩紅染色法可有效檢測TGF-β1誘導CFSC-8B細胞膠原的分泌。使用膠原纖維的苦味酸天狼猩紅染色法篩選樟芝，靈芝，蟲草頭孢，蟲草被孢，天麻蜜環(huán)和猴頭菌粉不同極性提取物中具有抗肝纖維化活性的化合物，試驗表明樟芝正己烷和氯仿提取物，蟲草被孢乙酸乙酯提取物，天麻蜜環(huán)正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物可顯著抑制TGF-β1誘導CFSC-8B細胞膠原的分泌，且具有劑量依賴關系，差異顯著，具有抗肝纖維化作用，而其他提取物無顯著性抑制效應。
文檔編號G01N21/31GK103234928SQ20131014353
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月24日 優(yōu)先權日2013年4月24日
發(fā)明者耿燕, 王靜, 陸震鳴, 許泓瑜, 史勁松, 許正宏 申請人:江南大學