低背景的P16-INK4a染色試劑盒及其應用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種低背景的P16-INK4a染色試劑盒及其應用方法，該試劑盒包括：試劑A、試劑B、試劑C、試劑D；其中，所述試劑A包括：P16-INK4a單克隆抗體、背景去除劑、稀釋度1:1000-1:6000為0.05MPBS；所述試劑B包括：生物素標記的二抗、背景去除劑；所述試劑C包括:辣根過氧化物酶標記的長臂鏈霉親和素復合物；所述試劑D包括:DAB顯示液。本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、低背景的特點；檢測方法操作方便、簡單，便于醫(yī)院使用和推廣。
【專利說明】低背景的P16-1 NK4a染色試劑盒及其應用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞學涂片染色【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種低背景的P16_INK4a染色試 劑盒及其應用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] P16_INK4a是第一個確定的直接參與細胞周期調(diào)控的抑癌基因，定位于人類染色 體9p21，全長8. 5kb，編碼一種分子量為16000的蛋白質(zhì)，故又稱pl6基因，pl6蛋白為 cyclinD-CDK4復合物的抑制蛋白，故又稱P16-INK4a。P16-INK4a蛋白通過抑制視網(wǎng)膜母 細胞瘤蛋白（pRb)的磷酸化，阻止細胞由G1期進入S期，抑制細胞增殖。在此調(diào)節(jié)級 聯(lián)中，pRb對P16-INK4a蛋白表達進行負反饋抑制，但在HR-HPV感染的宮頸癌組織中，由 于HR-HPV E7蛋白結(jié)合pRb，使其功能失活，解除了 pRb對P16-INK4a蛋白表達的負反饋 抑制，引起P16_INK4a過表達，P16-INK4a蛋白可作為一種生物學標記物進行宮頸癌的早期 篩查。
[0003] 宮頸癌（cervical cancer,CC)是全球婦女惡性腫瘤中第二大常見惡性腫瘤，宮 頸癌病因?qū)W研究確立了人乳頭瘤病毒（HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的主要因素。在正常宮頸 上皮一宮頸上皮內(nèi)瘤變一宮頸癌這一進展過程中，HPV導致某些基因結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生變化， 其中，P16-INK4a基因作為抑癌基因直接作用于細胞周期，控制細胞生長與分化，參與腫瘤 形成與發(fā)展。研究顯示，P16_INK4a幾乎在100% HRHPV感染導致的宮頸癌和癌前病變中過 表達，而在HPV陰性的宮頸癌和正常組織中無表達，其作為一種生物學標記物可用于宮頸 癌的早期篩查。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種低背景的P16-INK4a染色試劑盒及其應用方法，以簡 單，快速，準確對宮頸液基細胞學涂片染色。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的低背景的P16-INK4a染色試劑盒包括：試劑A、 試劑B、試劑C、試劑D ;其中，所述試劑A包括：P16-INK4a單克隆抗體、背景去除劑、稀釋度 1:1000-1:6000為0. 05M PBS (磷酸鹽緩沖液）；所述試劑B包括：生物素標記的二抗、背景 去除劑；所述試劑C包括：辣根過氧化物酶標記的長臂鏈霉親和素復合物；所述試劑D包 括：DAB (二氨基聯(lián)苯胺，Diaminobenzidine，簡稱DAB)顯不液。
[0006] 優(yōu)選地，所述背景去除劑為多種短鏈蛋白質(zhì)混合物。
[0007] 優(yōu)選地，所述背景去除劑包括牛血清白蛋白，兔肌動蛋白。
[0008] 優(yōu)選地，所述DAB顯示液為1滴DAB原液混合1ml DAB緩沖液；其中，所述DAB緩 沖液包括：咪唑3. 4g、蒸餾水1000ml、H202 (濃度30%) 2ml、6N鹽酸調(diào)至PH=7. 4 ;所述DAB 原液為125mM DAB配制，包括DAB1. 5g、丙二醇19. 5ml、6N鹽酸0. lml。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種上述低背景的P16-INK4a染色試劑盒的應用 方法，其包括以下步驟：宮頸細胞涂片至水，抗原修復；3%H202室溫孵育5-10分鐘，以消 除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5秒鐘；滴加試劑A，30min ; PBS沖洗， 5秒鐘；滴加試劑B，10分鐘；PBS沖洗，5秒鐘；滴加試劑C，10分鐘；PBS沖洗，5秒鐘；滴 加試劑D，顯色3-5分鐘；自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
[0010] 本發(fā)明提供一種試劑盒及其在檢測宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞中的應用方法， 其中，試劑盒具有靈敏度高、低背景的特點；檢測方法操作方便、簡單，便于醫(yī)院使用和推 廣。

【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0012] 本發(fā)明提供的染色試劑盒包括四種試劑，分別為試劑A、試劑B、試劑C、試劑D，四 者可以用或塑料瓶、或玻璃瓶等承裝。
[0013] 其中，試劑A包括P16-INK4a單克隆抗體、背景去除劑、稀釋度為1:1000-1:6000 的（λ 05M PBS。
[0014] 試劑B包括生物素標記的二抗、背景去除劑。
[0015] 試劑C包括辣根過氧化物酶標記的長臂鏈霉親和素復合物。
[0016] 試劑D包括DAB顯示液，其按照1滴DAB原液混合1ml DAB緩沖液配制。優(yōu)選地， DAB緩沖液包括咪唑3.4g、蒸餾水 1000ml、H202 (濃度30%)2ml、6N鹽酸調(diào)至PH=7.4。DAB 原液由125mM DAB配制，具體而言，按照DAB1.5g、丙二醇19. 5ml、6N鹽酸0. lml的配制。
[0017] 優(yōu)選地，背景去除劑為多種短鏈蛋白質(zhì)混合物，更優(yōu)選地你，含牛血清白蛋白，兔 肌動蛋白等。
[0018] 在應用上述P16_INK4a染色試劑盒時，可以應用以下操作步驟： 宮頸細胞涂片至水，抗原修復。
[0019] 3%H202室溫孵育5-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
[0020] 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5秒鐘。
[0021] 滴加試劑A工作液30min。
[0022] PBS沖洗，5秒鐘。
[0023] 滴加適量試劑B工作液10分鐘。
[0024] PBS沖洗，5秒鐘 滴加適量的試劑C工作液，10分鐘。
[0025] PBS沖洗，5秒鐘。
[0026] 滴加試劑D液，顯色3-5分鐘。
[0027] 自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
[0028] 另外，介紹常規(guī)免疫組化操作步驟如下： 宮頸細胞涂片至水，抗原修復。
[0029] 3%H202室溫孵育5-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
[0030] 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘x2。
[0031] 5-10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘，傾去血清，勿洗。滴加一 抗工作液，37°C孵育1-2小時或4°C過夜。
[0032] PBS沖洗，5分鐘x3次。
[0033] 滴加適量生物素標記二抗工作液，37°C孵育10-30分鐘。
[0034] PBS沖洗，5分鐘x3次。
[0035] 滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37°C孵育10-30分 鐘。
[0036] PBS沖洗，5分鐘x3次。
[0037] 滴加顯色劑DAB顯色3-15分鐘。
[0038] 自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
[0039] 綜上，在宮頸液基細胞學涂片染色時，不加 P16_INK4a (-抗)，常規(guī)免疫組化可 以顯示部分陽性，而本發(fā)明的P16-INK4a染色試劑盒全陰性，表明常規(guī)免疫組化染色在宮 頸液基細胞學染色時存在非特異性染色，而P16_INK4a試劑盒不存在非特異性染色。由上 可知，本發(fā)明提供的P16_INK4a染色試劑盒是一種適合在宮頸液基細胞學涂片染色的試劑 盒，P16-INK4a試劑盒不存在非特異性染色，沖洗時間縮短，染色時間減短，操作簡單，快速， 準確。
[0040] 由技術(shù)常識可知，本發(fā)明可以通過其它的不脫離其精神實質(zhì)或必要特征的實施方 案來實現(xiàn)。因此，上述公開的實施方案，就各方面而言，都只是舉例說明，并不是僅有的。所 有在本發(fā)明范圍內(nèi)或在等同于本發(fā)明的范圍內(nèi)的改變均被本發(fā)明包含。
【權(quán)利要求】
1. 一種低背景的P16-INK4a染色試劑盒，其特征在于，包括：試劑A、試劑B、試劑C、試 劑D ; 其中，所述試劑A包括：P16-INK4a單克隆抗體、背景去除劑、稀釋度1:1000-1:6000為 0. 05M PBS ； 所述試劑B包括：生物素標記的二抗、背景去除劑； 所述試劑C包括：辣根過氧化物酶標記的長臂鏈霉親和素復合物； 所述試劑D包括：DAB顯示液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低背景的P16-INK4a染色試劑盒，其特征在于，所述背景去除 劑為多種短鏈蛋白質(zhì)混合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的低背景的P16-INK4a染色試劑盒，其特征在于，所述背景去除 劑包括牛血清白蛋白，兔肌動蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低背景的P16-INK4a染色試劑盒，其特征在于，所述DAB顯示 液為1滴DAB原液混合lml DAB緩沖液； 其中，所述DAB緩沖液包括：咪唑3.4g、蒸餾水 1000ml、H202 (濃度30%)2ml、6N鹽酸 調(diào)至 ΡΗ=7· 4 ; 所述DAB原液為125mM DAB配制，包括DAB1. 5g、丙二醇19. 5ml、6N鹽酸0. lml。
5. -種權(quán)利要求1-4任一所述低背景的P16_INK4a染色試劑盒的應用方法，包括以下 步驟：宮頸細胞涂片至水，抗原修復； 3%H202室溫孵育5-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性； 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5秒鐘； 滴加試劑A，30min ; PBS沖洗，5秒鐘； 滴加試劑B，10分鐘； PBS沖洗，5秒鐘； 滴加試劑C，10分鐘； PBS沖洗，5秒鐘； 滴加試劑D，顯色3-5分鐘； 自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
【文檔編號】G01N1/30GK104155167SQ201310200618
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月27日
【發(fā)明者】徐顯輝 申請人:廈門菲爾科生物技術(shù)有限公司