一種生物樣品純化的裝置及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物樣品純化的裝置及其應(yīng)用，該裝置包含強(qiáng)陽(yáng)或強(qiáng)陰離子交換捕集柱、連接部件和反相捕集柱，可實(shí)現(xiàn)生物樣品中強(qiáng)陽(yáng)或強(qiáng)陰離子表面活性劑或離子液體和鹽類的同時(shí)去除。該裝置具有高效、回收率高、快速、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組樣品的純化。
【專利說(shuō)明】一種生物樣品純化的裝置及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物樣品純化的裝置及其應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)生物樣品中強(qiáng)陽(yáng)離子或強(qiáng) 陰離子表面活性劑或離子液體和鹽類的同時(shí)去除。該裝置具有高效、回收率高、快速、操作 簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，并可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)樣品的純化。

【背景技術(shù)】
[0002] 表面活性劑是一類能顯著地改變通常液體表面張力或兩相間界面張力的物質(zhì)， 他們的分子中含有親水和憎水的兩個(gè)組成部分。表面活性劑一般分為陽(yáng)離子表面活性 齊U、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑。由于表面活性劑有著強(qiáng)大的增溶能力， 往往被用作生物樣品的增溶劑，用于溶解膜蛋白質(zhì)等難溶性生物樣品（Wisniewski，J. R. ;Zougman，A. ;Nagaraj，N. ;Mann，M.Nat Methods2009,6,359_362)。近年來(lái)，離子液體 由于其出色的溶解能力，也被用于膜蛋白質(zhì)等難溶性生物樣品的溶解（Sun, L. L. ; Tao, D. Y. ; Hanj Β. ; Maj J. F. ; Zhuj G. J. ; Liang, Z. ; Shan, Y. C. ; Zhang, L. H. ; Zhang, Y. K. Anal Bioanal Chem2011，399, 3387 - 3397)。此外，由于生物樣品預(yù)處理過(guò)程中對(duì)酸、堿性環(huán)境的 要求，需要添加適當(dāng)?shù)木彌_鹽來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)所需的pH值。
[0003] "Bottom-up"技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定中最常用的技術(shù)，該技術(shù)是先將蛋 白質(zhì)酶解成肽段，然后通過(guò)一維或者多維分離技術(shù)進(jìn)行分離及在線質(zhì)譜鑒定。而樣品預(yù)處 理過(guò)程中，添加的表面活性劑和鹽類對(duì)于液相色譜的分離及質(zhì)譜鑒定存在著極為不利的影 響。
[0004] 目前，存在著很多去除表面活性劑和鹽類的方法，例如采用離子交換色譜法 (Weber, K. ;Kuter, D. J. J. Biol. Chem. 1971，246, 4504-4509),反相液相色譜法（Abian J, Oosterkamp AJ, Gelpi E.J. Mass Spectrom. 1999, 34, 244-254)，透析法（Hjelmeland，L. Μ· Methods Enzymol. 1990，182, 277-282 ;Liu C，Wu Q，Harms AC, Smith RD. Anal. Chem. 1996, 68, 3295-3299)等。然而，目前所用的色譜方法，單次進(jìn)樣，只能去除表面活性劑 或鹽類，無(wú)法達(dá)到兩類物質(zhì)的同時(shí)去除。本發(fā)明發(fā)展了一種將兩根捕集柱串聯(lián)的裝置，該裝 置通過(guò)填充相應(yīng)的固定相，單次進(jìn)樣，即可實(shí)現(xiàn)表面活性劑和鹽類的同時(shí)去除，具有回收率 高、方便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，并且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及一種生物樣品純化的裝置，可實(shí)現(xiàn)生物樣品中強(qiáng)陽(yáng)離子或強(qiáng)陰離子表 面活性劑或離子液體和鹽類的同時(shí)去除。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 1、構(gòu)建生物樣品純化的裝置：填充強(qiáng)陽(yáng)離子交換捕集柱/強(qiáng)陰離子交換捕集柱和 反相捕集柱，用保護(hù)柱與分析柱連接件將兩根捕集柱連接起來(lái)。
[0008] 2、采用進(jìn)樣針，通過(guò)進(jìn)樣頭注入生物樣品，使其先后通過(guò)兩根捕集柱，保留于反相 捕集柱上。
[0009] 3、斷開(kāi)保護(hù)柱與分析柱連接件與反相捕集柱間的連接，采用進(jìn)樣針，通過(guò)進(jìn)樣頭， 向反相捕集柱內(nèi)注入80%的乙腈水溶液，將樣品從反相捕集柱上洗脫下來(lái)并收集。
[0010] 一種生物樣品純化的裝置，包括兩根捕集柱和連接件，于強(qiáng)陽(yáng)或強(qiáng)陰離子交換捕 集柱中填充強(qiáng)陽(yáng)或強(qiáng)陰離子交換材料，于反相捕集柱中填充反相材料，兩根捕集柱間用保 護(hù)柱與分析柱連接件連接。
[0011] 樣品固載過(guò)程中，于強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交換捕集柱的遠(yuǎn)離反相捕集柱的一端設(shè)有進(jìn) 樣頭，進(jìn)樣頭與注射器相連；反相捕集柱的遠(yuǎn)離強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交換捕集柱的一端與廢液 管相連；該裝置的連接順序從進(jìn)樣端開(kāi)始依次為：注射器與進(jìn)樣頭相連，進(jìn)樣頭與強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng) 陰離子交換捕集柱相連，強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交換捕集柱與保護(hù)柱與分析柱連接件相連，保護(hù) 柱與分析柱連接件與反相捕集柱相連，反相捕集柱與廢液管相連；生物樣品采用注射針，通 過(guò)進(jìn)樣頭注入，先后通過(guò)兩根捕集柱，并保留于反相捕集柱上；
[0012] 最后，將樣品從反相捕集柱上洗脫下來(lái)，收集洗脫液，即為純化后的生物樣品；樣 品洗脫過(guò)程中，從裝置上取下反相捕集柱，于反相捕集柱一端設(shè)有進(jìn)樣頭，進(jìn)樣頭與注射器 相連；反相捕集柱的另一端與收集管相連，該裝置的連接順序從進(jìn)樣端開(kāi)始依次為：注射 器與進(jìn)樣頭相連，進(jìn)樣頭與反相捕集柱相連，反相捕集柱與收集管相連。
[0013] 強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交換捕集柱和反相捕集柱的柱管內(nèi)部為橫截面直徑為0. 3-7mm的 圓柱體，柱管長(zhǎng)度為〇. 5-3cm，材質(zhì)為拋光不銹鋼或石英毛細(xì)管或塑料；于捕集柱的內(nèi)部二 端均設(shè)有篩板，篩板孔徑為3nm_20 μ m。
[0014] 強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料為含有磺酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)的硅膠或聚合物基質(zhì)材料(如：聚 丙烯酸酯類基質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)、或聚丙烯酰胺類基質(zhì)）；強(qiáng)陰離子交換材料為含有季銨 基團(tuán)的硅膠或聚合物基質(zhì)材料(如：聚丙烯酸酯類基質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)、或聚丙烯酰胺類 基質(zhì)）；
[0015] 反相材料為含有C4、C8、C12或C18基團(tuán)的硅膠或聚合物基質(zhì)材料（(聚丙烯酸酯類 基質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)、聚丙烯酰胺類基質(zhì))。
[0016] 所述裝置用于生物樣品的純化。
[0017] 所述生物樣品為含有表面活性劑和鹽的生物樣品，為：細(xì)胞提取液、胞漿提取液、 血漿提取液、蛋白質(zhì)溶液、或多肽溶液。
[0018] 單次注入樣品，即可完成表面活性劑和鹽類的同時(shí)去除。
[0019] 需要純化的生物樣品中同時(shí)含有兩大類物質(zhì)，一類是陽(yáng)離子或陰離子表面活性劑 或離子液體（陽(yáng)離子表面活性劑包括胺鹽型表面活性劑、季銨鹽型表面活性劑、雜環(huán)類陽(yáng)離 子表面活性劑、或鎗鹽型表面活性劑；陰離子離子液體包括磺酸鹽型、羧酸鹽型、硫酸酯鹽 型、或磷酸酯鹽型表面活性劑；離子液體包括咪唑類離子液體或吡啶類離子液體或季銨鹽 離子液體、季鱗鹽離子液體或吡咯鹽離子)，另一類是鹽類(尿素、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、醋酸鹽、甲酸鹽、碳酸鹽、或磷酸鹽）；
[0020] 若生物樣品中含有陽(yáng)離子表面活性劑和鹽類或離子液體和鹽類，則靠近注射器一 側(cè)的捕集柱中填裝強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料，生物樣品的PH需調(diào)節(jié)至pH > 8 ;
[0021] 若生物樣品中含有陰離子表面活性劑和鹽類，則靠近注射器一側(cè)的捕集柱中填裝 強(qiáng)陰離子交換材料，生物樣品的PH需調(diào)節(jié)至pH彡4。
[0022] 生物樣品采用注射針，通過(guò)進(jìn)樣頭注入，先后通過(guò)兩根捕集柱和，并保留于反相捕 集柱上；
[0023] 最后，將樣品從反相捕集柱上洗脫下來(lái)，收集洗脫液，即為純化后的生物樣品；
[0024] 樣品從反相捕集柱上的洗脫時(shí)，只需采用注射器，通過(guò)進(jìn)樣頭，向反相捕集柱內(nèi)注 入體積濃度為80%的乙腈水溶液，即可將樣品從反相捕集柱上洗脫下來(lái)并通過(guò)收集管收 集。
[0025] 該裝置可用于含有表面活性劑和鹽類或離子液體和鹽類的蛋白質(zhì)溶液的純化。
[0026] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] 1.裝置簡(jiǎn)單。只需通過(guò)保護(hù)柱與分析柱連接件將兩根捕集柱串聯(lián)即可。
[0028] 2.回收率高。表面活性劑和鹽類的去除，通過(guò)單次進(jìn)樣，即可完成。減少了多次 進(jìn)樣過(guò)程中，管路及連接部件的吸附。
[0029] 3.方便、快捷。采用本發(fā)明中的裝置，表面活性劑和鹽類的去除可手動(dòng)、離線操作， 且單次進(jìn)樣即可完成。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1.生物樣品純化流程圖。
[0031] 圖2.捕集柱再生示意圖。
[0032] 圖中：1 :注射器；2 :進(jìn)樣頭；3 :強(qiáng)陽(yáng)或強(qiáng)陰離子交換捕集柱；4 :保護(hù)柱與分析柱 連接件；5 :反相捕集柱；6 :廢液管；7 :收集管
[0033] 圖3.牛血清白蛋白的酶解產(chǎn)物未經(jīng)純化和純化后的MALDI-T0F質(zhì)譜圖；A :未經(jīng) 純化的BSA酶解產(chǎn)物質(zhì)譜圖，B :經(jīng)過(guò)純化的BSA酶解產(chǎn)物質(zhì)譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 1.裝置構(gòu)建：將強(qiáng)陰離子交換填料（日本東曹達(dá)，TSK-GELSuper Q-5PW，10 μ m， 1000 A)及C18反相填料(北京艾杰爾，Venusil XBP-C18, 5 μ m，120人）分別填裝到兩根捕 集柱3和5中，并將各部件按圖1連接。
[0035] 2.捕集柱的平衡：按圖1所示(上圖），用注射器1，通過(guò)進(jìn)樣頭2,注入50倍柱體 積的0. 1% (體積分?jǐn)?shù)）的甲酸水溶液。
[0036] 3.樣品的純化、富集：按圖1所示(上圖），用注射器1，通過(guò)進(jìn)樣頭2,注入500 μ L 摩爾濃度為〇. lmg/mL的牛血清白蛋白（BSA)酶解產(chǎn)物(含質(zhì)量濃度0. 5%SDS，20mM NH4HCO3) 后，再用注射器1注入5倍柱體積的0. 1% (體積分?jǐn)?shù)）的甲酸水溶液，BSA酶解產(chǎn)物被捕集 并富集于反相捕集柱5上。
[0037] 4.樣品洗脫、收集：按圖1所示(下圖)，采用注射器1，通過(guò)進(jìn)樣頭2,向反相捕集 柱5內(nèi)注入80% (體積分?jǐn)?shù)）的乙腈水溶液，將樣品從反相捕集柱5上洗脫下來(lái)，并通過(guò)收 集管7收集樣品。
[0038] 5.強(qiáng)陰離子交換捕集柱的再生：按圖2所示，用注射器1，通過(guò)進(jìn)樣頭2,注入50 倍柱體積的IM NaCl水溶液進(jìn)行沖洗，洗脫吸附的SDS并活化強(qiáng)陰離子交換捕集柱3。
[0039] 6.將未經(jīng)純化的BSA酶解產(chǎn)物和步驟4中收集的純化的BSA酶解產(chǎn)物，用 MALDI-T0F質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3,數(shù)據(jù)檢索結(jié)果見(jiàn)表1。
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種生物樣品純化的裝置，其特征在于： 包括兩根捕集柱和連接件，于強(qiáng)陽(yáng)或強(qiáng)陰離子交換捕集柱（3)中填充強(qiáng)陽(yáng)或強(qiáng)陰離子 交換材料，于反相捕集柱（5)中填充反相材料，兩根捕集柱間用保護(hù)柱與分析柱連接件（4) 連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于： 樣品固載過(guò)程中，于強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交換捕集柱（3)的遠(yuǎn)離反相捕集柱（5)的一端設(shè) 有進(jìn)樣頭（2)，進(jìn)樣頭（2)與注射器（1)相連；反相捕集柱（5)的遠(yuǎn)離強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交換 捕集柱（3)的一端與廢液管（6)相連；該裝置的連接順序從進(jìn)樣端開(kāi)始依次為：注射器（1) 與進(jìn)樣頭（2)相連，進(jìn)樣頭（2)與強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交換捕集柱（3)相連，強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交 換捕集柱（3)與保護(hù)柱與分析柱連接件（4)相連，保護(hù)柱與分析柱連接件（4)與反相捕集 柱（5)相連，反相捕集柱（5)與廢液管（6)相連；生物樣品采用注射針（1)，通過(guò)進(jìn)樣頭（2) 注入，先后通過(guò)兩根捕集柱（3)和（5)，并保留于反相捕集柱（5)上； 最后，將樣品從反相捕集柱上洗脫下來(lái)，收集洗脫液，即為純化后的生物樣品；樣品洗 脫過(guò)程中，從裝置上取下反相捕集柱（5)，于反相捕集柱（5) -端設(shè)有進(jìn)樣頭（2)，進(jìn)樣頭 ⑵與注射器⑴相連；反相捕集柱（5)的另一端與收集管（7)相連，該裝置的連接順序從 進(jìn)樣端開(kāi)始依次為：注射器（1)與進(jìn)樣頭（2)相連，進(jìn)樣頭（2)與反相捕集柱（5)相連，反 相捕集柱（5)與收集管（7)相連。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于： 強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陰離子交換捕集柱（3)和反相捕集柱（5)的柱管內(nèi)部為橫截面直徑為 0. 3-7mm的圓柱體，柱管長(zhǎng)度為0. 5-3cm，材質(zhì)為拋光不銹鋼或石英毛細(xì)管或塑料；于捕集 柱的內(nèi)部二端均設(shè)有篩板，篩板孔徑為3nm_20 μ m。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于： 強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料為含有磺酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)的硅膠或聚合物基質(zhì)材料(聚丙烯酸酯 類基質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)、聚丙烯酰胺類基質(zhì)）；強(qiáng)陰離子交換材料為含有季銨基團(tuán)的硅膠 或聚合物基質(zhì)材料(聚丙烯酸酯類基質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)、聚丙烯酰胺類基質(zhì)）； 反相材料為含有C4、C8、C12或C18基團(tuán)的硅膠或聚合物基質(zhì)材料（(聚丙烯酸酯類基 質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)、聚丙烯酰胺類基質(zhì))。
5. -種權(quán)利要求1、2、3或4所述裝置的應(yīng)用，其特征在于： 所述裝置用于生物樣品的純化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述裝置的應(yīng)用，其特征在于： 所述生物樣品為含有表面活性劑和鹽的生物樣品，為：細(xì)胞提取液、胞漿提取液、血漿 提取液、蛋白質(zhì)溶液、或多肽溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述裝置的應(yīng)用，其特征在于： 單次注入樣品，即可完成表面活性劑和鹽類的同時(shí)去除。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述裝置的應(yīng)用，其特征在于：需要純化的生物樣品中同時(shí)含 有兩大類物質(zhì)，一類是陽(yáng)離子或陰離子表面活性劑或離子液體（陽(yáng)離子表面活性劑包括胺 鹽型表面活性劑、季銨鹽型表面活性劑、雜環(huán)類陽(yáng)離子表面活性劑、鎗鹽型表面活性劑；陰 離子離子液體包括磺酸鹽型、羧酸鹽型、硫酸酯鹽型、磷酸酯鹽型表面活性劑；離子液體包 括咪唑類離子液體或吡啶類離子液體或季銨鹽離子液體、季鱗鹽離子液體和吡咯鹽離子)， 另一類是鹽類(尿素、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、醋酸鹽、甲酸鹽、碳酸 鹽、磷酸鹽）； 若生物樣品中含有陽(yáng)離子表面活性劑和鹽類或離子液體和鹽類，則靠近注射器一側(cè)的 捕集柱中填裝強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料，生物樣品的pH需調(diào)節(jié)至pH > 8 ; 若生物樣品中含有陰離子表面活性劑和鹽類，則靠近注射器一側(cè)的捕集柱中填裝強(qiáng)陰 離子交換材料，生物樣品的pH需調(diào)節(jié)至pH彡4。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述裝置的應(yīng)用，其特征在于： 生物樣品采用注射針（1)，通過(guò)進(jìn)樣頭（2)注入，先后通過(guò)兩根捕集柱（3)和（5)，并保 留于反相捕集柱（5)上； 最后，將樣品從反相捕集柱上洗脫下來(lái)，收集洗脫液，即為純化后的生物樣品； 樣品從反相捕集柱上的洗脫時(shí)，只需采用注射器，通過(guò)進(jìn)樣頭，向反相捕集柱內(nèi)注入體 積濃度為80%的乙腈水溶液，即可將樣品從反相捕集柱上洗脫下來(lái)并通過(guò)收集管收集。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述裝置的應(yīng)用，其特征在于：該裝置可用于含有表面活性劑 和鹽類或離子液體和鹽類的蛋白質(zhì)溶液的純化。
【文檔編號(hào)】G01N1/34GK104236984SQ201310237476
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
【發(fā)明者】張麗華, 趙群, 楊開(kāi)廣, 吳慈, 張玉奎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所