采用免疫磁納米粒子和spr技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法
【專利摘要】一種采用免疫磁納米粒子和SPR技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法，該方法是將免疫磁納米粒子加入到含溴氰菊酯的待測樣品溶液中，使免疫磁納米粒子與溴氰菊酯發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)外加磁場分離后得到結(jié)合物，將該結(jié)合物直接注入經(jīng)殼聚糖修飾的SPR芯片表面，以檢測出待測樣品溶液中的溴氰菊酯含量。上述免疫磁納米粒子是將磁納米粒子表面的羧基用EDC/NHS混合液活化后，加入溴氰菊酯的單克隆抗體溶液，再加入乙醇胺封閉，經(jīng)外加磁場分離后，用PBS緩沖液定容制得。本方法將樣品前處理和檢測技術(shù)相結(jié)合，有效提高了檢測的靈敏度和準確性，且操作簡單，快速、選擇性高、重現(xiàn)性和再生性好，回收率符合要求，可直接對農(nóng)產(chǎn)品中溴氰菊酯的殘留進行檢測，具有重要的實際應(yīng)用價值。
【專利說明】采用免疫磁納米粒子和SPR技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)藥分析及生物傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的是涉及一種利用免疫磁納米粒子檢測農(nóng)產(chǎn)品中殘留的溴氰菊酯的SPR免疫傳感器方法。
【背景技術(shù)】
[0002]溴氰菊酯，是目前菊酯類殺蟲劑中毒力最高的一種。溴氰菊酯屬于中毒毒類，皮膚接觸可引起刺激癥狀，出現(xiàn)紅色丘疹。急性中毒時，輕者有頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、食欲不振、乏力，重者還可出現(xiàn)肌束顫抖和抽搐。目前溴氰菊酯殘留的檢測方法主要有氣相色譜、高效液相色譜、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析等。其中色譜分析法儀器設(shè)備貴重，樣品前處理復(fù)雜，需專業(yè)人員；而酶聯(lián)免疫分析方法相對復(fù)雜，靈敏度較低，耗時，成本較高，且均需要復(fù)雜的樣品前處理。與上述檢測方法相比，表面等離子共振(surface pIasmonresonance, SPR)傳感技術(shù)是一種基于物質(zhì)折射率變化的、可實時動態(tài)監(jiān)測的現(xiàn)代檢測技術(shù)，具有快速、高靈敏、耗樣量少、無需標記、芯片可重復(fù)使用等特性，且操作簡單，但無法直接高靈敏地檢測溴氰菊酯農(nóng)藥小分子。
[0003]農(nóng)藥殘留分析是復(fù)雜混合物中痕量組分的分析技術(shù)，采用適當?shù)霓r(nóng)藥殘留提純方法是成功建立準確、快速、高靈敏農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的關(guān)鍵。近年來發(fā)展的磁性納米材料是一種新型的親和性固相載體，在外加磁場下具有可控運動的特點，所需設(shè)備簡單，操作柔和。將磁納米粒子與各種分析方法相結(jié)合應(yīng)用于檢測，可以在復(fù)雜的體系中快速富集待檢物，得到濃縮、純凈的樣品，有助于縮短檢測時間及檢測的準確度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有SPR傳感器無法實現(xiàn)直接高靈敏檢測溴氰菊酯農(nóng)藥小分子，以及農(nóng)產(chǎn)品樣品前處理復(fù)雜的問題，提供一種采用免疫磁納米粒子和SPR技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法。該方法不僅將樣品前處理和檢測技術(shù)相結(jié)合，提高了方法的靈敏度和準確性，且操作簡單，檢測快速、選擇性高、重現(xiàn)性和再生性好，回收率符合要求，可直接對農(nóng)產(chǎn)品中溴氰菊酯殘留進行檢測，具有重要的實際應(yīng)用價值。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種采用免疫磁納米粒子和SPR技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法，該方法是將免疫磁納米粒子加入到含溴氰菊酯的待測樣品溶液中，使免疫磁納米粒子與溴氰菊酯發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)外加磁場分離后得到結(jié)合物，將該結(jié)合物直接注入經(jīng)殼聚糖修飾的SPR芯片表面，以檢測出待測樣品溶液中的溴氰菊酯含量。
[0006]上述檢測溴氰菊酯的過程詳述如下，請結(jié)合參見圖1:
[0007]1、磁納米粒子的制備和表征:取0.5g富里酸加入60mL純水并置于圓底燒瓶中，通入氮氣除氧的同時并用恒溫磁力攪拌器200r/min攪拌加熱至沸騰，沸騰后立即加入5mL含有0.6g NaOHU.08g FeCl3.6H20和0.6g FeSO4.7H20的混合溶液，回流2h。待溶液冷卻至室溫后，經(jīng)磁性分離，多次純水洗滌至中性，分別采用紫外光譜、傅里葉紅外光譜和透射電子顯微鏡表征，結(jié)合參見圖2。
[0008]上述羧基化磁納米粒子的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，可參考已報道的表面羧基化磁納米粒子的合成方法[Chunjiao Zhou et al, Fulvic acid coated iron oxidenanoparticles for magnetic resonance imaging contrast agent, Funct.Mater.Lett.03(2010)197-200 頁]。[0009]2、免疫磁納米粒子的制備:取200 μ L1.9-3.8mM的羧基化磁納米粒子溶液，加入400 μ L的EDC/NHS (0.4Μ/0.1Μ)混和液，漩渦震蕩5-lOmin，冰浴超聲5-lOmin后，加入200 μ L0.27-0.55mg/mL溴氰菊酯單克隆抗體溶液，漩渦震蕩5_10min，冰浴超聲5-10min后，加入0.1M乙醇胺200 μ L，漩渦震蕩5-10min，靜置15_20min后，經(jīng)外加磁場分離后，用PBS緩沖液(10mM、pH7.4)清洗并定容至200 μ L，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫謩e采用紫外光譜、傅里葉紅外光譜和透射電子顯微鏡進行表征，結(jié)合參見圖2。
[0010]上述0.27-0.55mg/mL的溴氰菊酯單克隆抗體溶液是取3.3mg溴氰菊酯單克隆抗體(購買于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)加入Iml PBS緩沖液(10mM、pH7.4)配制成3.3mg/mL的母液，再用PBS緩沖液(10mM、pH7.4)稀釋而成。
[0011]3、SPR傳感器的構(gòu)建:將SPR芯片在無水乙醇中浸泡3_8min，經(jīng)純水沖洗，氮氣吹干后，用氫火焰灼燒15-30s，冷卻后裝入SPR儀器，待基線走平后，以10-20μ?7min的流速通入50-100 μ L0.4mg/mL的巰基乙胺溶液，再以10-20 μ L/min的流速通入50-100 μ L1.2-1.8mg/mL的殼聚糖醋酸溶液，使該殼聚糖醋酸溶液在SPR芯片表面進行自組裝(利用巰基乙胺的氨基與殼聚糖表面的羧基反應(yīng)，使殼聚糖固定在芯片表面)制得。
[0012]上述1.2-1.8mg/mL的殼聚糖醋酸溶液是取200mg殼聚糖溶于50mL50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH3.6)中，60°C磁力攪拌2-4h，冷卻后，再用50mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH3.6)稀釋而成。
[0013]4、免疫磁納米粒子高效富集待測物溴氰菊酯:取上述制備的免疫磁納米粒子加入含有溴氰菊酯的樣品溶液，漩渦震蕩5-10min后，冰浴超聲5_10min，然后靜置15_20min，經(jīng)外加磁場分離后得到結(jié)合物，該結(jié)合物用PBS緩沖液(10mM、pH7.4)反復(fù)洗滌3次，用PBS
定容后備用。
[0014]5、將上述得到的免疫磁納米粒子和溴氰菊酯的結(jié)合物直接注入傳感器進行檢測，即可得到樣品溶液中溴氰菊酯的的含量。
[0015]本發(fā)明利用免疫磁納米粒子與溴氰菊酯會發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)外加磁場分離后得到的結(jié)合物直接注入經(jīng)殼聚糖修飾的SPR芯片表面，殼聚糖表面的氨基與溴氰菊酯的溴原子可發(fā)生霍夫曼烷基化反應(yīng)，使芯片表面的折射率隨著結(jié)合物中溴氰菊酯濃度的變化而變化，從而引起SPR響應(yīng)信號的變化，據(jù)此可對溴氰菊酯直接進行定量分析，最低檢測限為
2.5pg/mL。
[0016]本發(fā)明與傳統(tǒng)的檢測方法及同類傳感器比較，其2.5pg/mL的檢測限比大多數(shù)文獻報道的更低，見表1。
[0017]表1本發(fā)明與傳統(tǒng)檢測方法及同類傳感器的對比
[0018]
【權(quán)利要求】
1.一種采用免疫磁納米粒子和SPR技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法，其特征在于，該方法是將免疫磁納米粒子加入到含溴氰菊酯的待測樣品溶液中，使免疫磁納米粒子與溴氰菊酯發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)外加磁場分離后得到結(jié)合物，將該結(jié)合物直接注入經(jīng)殼聚糖修飾的SPR芯片表面，以檢測出待測樣品溶液中的溴氰菊酯含量。
2.如權(quán)利要求1所述的采用免疫磁納米粒子和SPR技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法，其特征在于，所述免疫磁納米粒子是取200 μ L1.9-3.8mM的羧基化磁納米粒子溶液，加入0.4M的EDC和0.1M的NHS混合溶液共400 μ L，漩渦震蕩5_10min，冰浴超聲5_10min后，再加入200 μ L0.27-0.55mg/mL溴氰菊酯單克隆抗體溶液，漩渦震蕩5_10min，冰浴超聲5-10min，加入0.1M乙醇胺200 μ L，漩渦震蕩5_10min，靜置15_20min，經(jīng)外加磁場分離后，用PBS緩沖液清洗并定容至200 μ L，得到。
3.如權(quán)利要求1所述的采用免疫磁納米粒子和SPR技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法，其特征在于，所述溴氰菊酯單克隆抗體溶液是取3.3mg溴氰菊酯單克隆抗體加入PBS緩沖液Iml配制成3.3mg/mL的母液,再用PBS緩沖液稀釋而成。
4.如權(quán)利要求1所述的采用免疫磁納米粒子和SPR技術(shù)相結(jié)合檢測溴氰菊酯的方法，其特征在于，所述經(jīng)殼聚糖修飾的SPR芯片是將SPR芯片在無水乙醇中浸泡3-8min，經(jīng)純水沖洗，氮氣吹干后，用氫火焰灼燒15-30S，冷卻后裝入SPR儀器，待基線走平后，以10-20 μ L/min的流速通入50-100 μ L0.4mg/mL的巰基乙胺溶液，再以10-20 μ L/min的流速通入50-100 μ L1.2-1.8mg/mL的殼聚糖醋酸溶液，使該殼聚糖醋酸溶液在SPR芯片表面進行自組裝制得。
5.如權(quán)利要求4所述的殼聚糖修飾的SPR芯片，其特征在于，所述殼聚糖醋酸溶液是取200mg殼聚糖溶于pH值為3.6的50mL50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液中，60°C磁力攪拌2-4h，冷卻后，再用PH值為3.6的50mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋而成。
【文檔編號】G01N33/53GK103472219SQ201310460621
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】劉霞, 李文進, 李蕾, 毛璐剛, 楊陽 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)