同時檢測牛奶中多種霉菌毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時檢測牛奶中多種霉菌毒素的方法，該方法包括以下步驟：（1）提取牛奶中的霉菌毒素，得到霉菌毒素粗提取物；（2）將霉菌毒素粗提取物純化、濃縮；（3）濃縮后的霉菌毒素上色譜柱，用流動相梯度洗脫，收集洗脫物；（4）將收集的洗脫物用質(zhì)譜儀進行定性定量檢測。本發(fā)明建立了一種高效、靈敏、穩(wěn)定的同時檢測牛奶中黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的方法。本發(fā)明在生鮮乳、液態(tài)奶和奶粉中驗證了本發(fā)明檢測方法的線性、靈敏度、回收率、精確性和重現(xiàn)性，驗證結果證明本發(fā)明檢測方法線性范圍好、靈敏度高、可信性好、穩(wěn)定性強。
【專利說明】同時檢測牛奶中多種霉菌毒素的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測牛奶中霉菌毒素的方法，尤其涉及一種采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測牛奶中黃曲霉毒素Ml、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α -玉米赤霉烯醇的方法，屬于牛奶中霉菌毒素的檢測領域。
【背景技術】
[0002]牛奶已成為人們生活的必需品，尤其嬰幼兒牛奶是母乳的最佳替代品，但霉菌毒素已成為牛奶的主要質(zhì)量安全風險因子之一，嚴重威脅人類健康。霉菌毒素在牛奶加工過程中，無論是巴氏殺菌還是高溫殺菌均無法降解霉菌毒素，霉菌毒素可以完整殘留至奶產(chǎn)品中，因此，牛奶中霉菌毒素越來越受到人們的廣泛關注，特別是黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素Α、玉米赤霉烯酮和α -玉米赤霉烯醇因其污染程度和毒性而受到重視。
[0003]目前，奶業(yè)發(fā)達國家已經(jīng)積極監(jiān)測牛奶中霉菌毒素污染狀況，但在中國相關報道較少，這可能與缺少高通量的檢測技術存在一定關系。傳統(tǒng)的檢測方法各有其優(yōu)缺點。酶聯(lián)免疫吸附法作為當今最具代表性的快速檢測方法，已廣泛應用于霉菌毒素分析檢測，但由于假陽性和不能精確定量等缺點限制了其進一步應用。因此，基于薄層色譜法、氣相色譜、高壓液相色譜等技術的定量檢測方法已經(jīng)建立，但這些方法只能檢測一種或一類霉菌毒素，已不能滿足現(xiàn)代奶業(yè)中霉菌毒素的監(jiān)測和科研需求。近年來，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)因其高靈敏、高選擇性和高通量已成為多霉菌毒素分析的最普遍方法，廣泛應用于食品、飼料、血漿、尿液和中草藥中霉菌毒素的檢測。隨著人們?nèi)找骊P注牛奶中霉菌毒素污染，牛奶中UPLC-MS/MS多霉菌毒素同時檢測方法成為研究的熱點，但是該方法不同程度的存在著靈敏度低、可信性差、穩(wěn)定性弱等缺陷，有待改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種時檢測牛奶中多種霉菌毒素的方法，該方法具有線性范圍好、靈敏度高、可信性好、穩(wěn)定性強等優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:
[0006]一種同時檢測牛奶中多種霉菌毒素的方法，該方法包括以下步驟:
[0007](I)提取牛奶中的霉菌毒素，得到霉菌毒素粗提取物；(2)將霉菌毒素粗提取物純化后濃縮；(3)將濃縮后的霉菌毒素上色譜柱，用流動相梯度洗脫，收集洗脫物；(3)將收集的洗脫物用質(zhì)譜儀進行定性定量檢測。
[0008]牛奶中霉菌毒素的提取效果對檢測是否成功具有決定性影響。有學者在飲料、牛奶和小麥中霉菌毒素檢測時，提取前利用甲酸或乙酸酸化樣品，這主要是為了提高伏馬菌素的回收率，而對黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素Α、玉米赤霉烯酮和α -玉米赤霉烯醇的回收率沒有顯著影響。適合的提取劑可大大提高牛奶中霉菌毒素的提取效率，在樣品中加入甲醇或乙腈既可以沉淀蛋白還可以提取霉菌毒素，但不同的基質(zhì)和霉菌毒素，甲醇和乙腈的提取效率存在差別，本發(fā)明比較了提取溶劑甲醇和乙腈的提取效果，結果表明乙腈對這四種霉菌毒素的提取效率非常顯著的優(yōu)于甲醇的提取效果，因此，本發(fā)明優(yōu)選采用乙腈作為提取溶劑提取牛奶中的霉菌毒素。
[0009]采用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測牛奶中的多霉菌毒素普遍存在基質(zhì)效應?；|(zhì)效應影響信號強度、定量限和準確度，因此UPLC-MS/MS必須考察和避免基質(zhì)效應，這已成為霉菌毒素的UPLC-MS/MS檢測方法開發(fā)的重點。而減弱或消除基質(zhì)效應影響的最佳辦法是對樣品進行預處理，預處理可去除干擾物、富集痕量樣品、使得樣品與采用的分離和檢測技術更匹配。
[0010]在痕量分析中凈化和富集步驟對靈敏度具有巨大的作用。分析結果顯示，未經(jīng)凈化和富集的粗提取液樣品直接進樣，干擾峰較多，信號較差，因基質(zhì)效應發(fā)生強烈的信號抑制作用，因此直接注入提取液不能滿足相關限量標準的檢測要求，需要凈化和富集樣品中的霉菌毒素。本發(fā)明比較了 mycosep226和HLB柱對霉菌毒素的純化效果，結果顯示，Mycos印226柱凈化富集時，OTA和a -ZOL的信號較差，以致無法準確定量OTA和a -Z0L。而HLB柱的凈化富集效率較高，有效的去除了干擾物質(zhì)。因此，本發(fā)明優(yōu)選采用HLB柱凈化η集牛奶中黃曲霉毒素Ml、赫曲霉毒素Α、玉米赤霉稀麗和α -玉米赤霉稀醇這四種霉圃毒素。
[0011]在確定了 HLB柱為最適宜的凈化富集牛奶中黃曲霉毒素Ml、赭曲霉毒素Α、玉米赤霉烯酮和α -玉米赤霉烯醇這四種霉菌毒素方式后，本發(fā)明對包括霉菌毒素粗提取物過柱PH值、過柱速度、水洗體積和洗脫溶劑等參數(shù)進行了優(yōu)化以提高霉菌毒素的吸附和洗脫效率。
[0012]本發(fā)明根據(jù)24+1全因子實驗設計篩選出關鍵影響因子。實驗結果發(fā)現(xiàn)，當其它參數(shù)不變時，過柱粗提液PH和洗脫液是影響純化和富集結果的兩個最關鍵參數(shù)。從響應面圖中可看出，霉菌毒素粗提取液pH值越低，洗脫液中甲醇含量越高，信號越好。隨pH(5.0 -8.5)增高，信號抑制作用增強，回收率迅速降低。因此，本發(fā)明確定霉菌毒素粗提取液過柱最佳pH值為5.0，洗脫液優(yōu)選為100%甲醇?，F(xiàn)有文獻報道pH低于6.0時，回收率會快速降低；過柱粗提取液pH為8.5時回收率最大，基質(zhì)效應最小。本發(fā)明所優(yōu)化的參數(shù)與文獻報道的參數(shù)差異較大。
[0013]在確定過HLB柱粗提取液pH5.0和100%甲醇洗脫液后，本發(fā)明進一步考察了水洗體積和過柱速度對凈化富集效果的影響，本發(fā)明通過多水平因子設計最終發(fā)現(xiàn)，當過柱速度為1.5mL/min和水洗體積2mL時,具有最佳的富集效果。
[0014]本發(fā)明中所用色譜分離采用BEH C18色譜柱(2.1 X 50mm，1.7 μ m)，流動相為甲醇和0.1%氨水,梯度洗脫霉菌毒素分析物；
[0015]采用正、負離子掃描方式進行儀器方法學研究，確定豐度比最高的離子對為監(jiān)測離子分別為定性和定量離子，采用多離子反應監(jiān)測模式進行檢測。
[0016]靈敏度檢測結果表明，采用本發(fā)明進行檢測，四種霉菌毒素的LOD和LOQ范圍分別為0.001 - 0.005 μ g/kg和0.003 - 0.015 μ g/kg，完全滿足中國、歐盟和美國等各國對牛奶中霉菌毒素檢測的限量要求。
[0017]不同加標水平和牛奶基質(zhì)中，本發(fā)明監(jiān)測方法回收率為87.0%_109%，相對標準偏差為3.4%-9.9%，這表明本發(fā)明檢測方法精密度較高。本發(fā)明方法在三個不同水平和基質(zhì)中，相對標準偏差和重現(xiàn)性均低于10%，這表明本發(fā)明檢測方法具備較高穩(wěn)定性。[0018]本發(fā)明建立了一種高效、靈敏、穩(wěn)定的同時檢測牛奶中黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α -玉米赤霉烯醇的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。以0.1%氨水和甲醇為流動相進行梯度洗脫，利用BEH C18色譜柱在2min內(nèi)就能成功分離這四種霉菌毒素。本發(fā)明檢測方法分別在生鮮乳、液態(tài)奶和奶粉中得到驗證，線性、靈敏度、回收率、精確性和重現(xiàn)性都證明本發(fā)明檢測方法線性范圍好、靈敏度高、可信性好、穩(wěn)定性強。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1 0.025 μ g/kg混合標準溶液在多反應監(jiān)測模式下的選擇性離子流圖。
[0020]圖2不同霉菌毒素提取劑的回收率:甲醇和乙腈牛奶樣品加標濃度0.025 μ g/kg。
[0021]圖3加標0.025 μ g/kg的牛奶樣品直接進樣的結果。
[0022]圖4加標0.025 μ g/kg的牛奶樣品過HLB柱對霉菌毒素的純化效果。
[0023]圖5加標0.025 μ g/kg的牛奶樣品過mycosep226柱對霉菌毒素的純化效果。
[0024]圖6 AFM1的過柱因子效應按減序排列的帕累托圖。
[0025]圖7 AFM1的響應面圖；水洗體積2mL，固相萃取流速0.5mL/min?！揪唧w實施方式】
[0026]通過下列實施例將更具體說明本發(fā)明的實施方式，但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。1.實驗儀器及試劑
[0027]1.1主要實驗儀器
[0028]表1主要實驗儀器
[0029]
【權利要求】
1.一種同時檢測牛奶中多種霉菌毒素的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:(1)提取牛奶中的霉菌毒素，得到霉菌毒素粗提取物；(2)將霉菌毒素粗提取物純化、濃縮；(3)將濃縮后的霉菌毒素上色譜柱，用流動相梯度洗脫，收集洗脫物；(3)將收集的洗脫物用質(zhì)譜儀進行定性定量檢測。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:用乙腈作為提取溶劑提取牛奶中的霉菌毒素。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:將霉菌毒素粗提取物過固相萃取柱HLB柱進行純化、濃縮。
4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于:將霉菌毒素粗提取液pH值調(diào)為5.0 - 8.5后上固相萃取柱HLB柱，水洗后再用洗脫液洗脫，收集洗脫液。
5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:將霉菌毒素粗提取液pH值調(diào)為5.0后再上固相萃取柱HLB柱。
6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于:所述的洗脫液是100%甲醇。
7.按照權利要求3或4所述的方法，其特征在于:將霉菌毒素粗提取液按照0.5-1.5mL/min的過柱速度過固相萃取柱HLB柱；優(yōu)選的，將霉菌毒素粗提取液按照1.5mL/min的過柱速度過固相萃取柱HLB柱。
8.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:水洗體積為2-6mL，優(yōu)選為2mL。
9.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:色譜分離采用BEHC18色譜柱，流動相為甲醇和0.1%氨水,梯度洗脫霉菌毒素分析物。
10.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的霉菌毒素是黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和α -玉米赤霉烯醇。
【文檔編號】G01N30/02GK103543221SQ201310461017
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權日:2013年9月30日
【發(fā)明者】王加啟, 鄭楠, 黃良策, 程建波, 李松勵, 張養(yǎng)東 申請人:王加啟, 鄭楠, 黃良策