一種酚類(lèi)化合物肝毒性快速預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于有毒物質(zhì)快速檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種酚類(lèi)化合物肝毒性快速預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明通過(guò)選取具有穩(wěn)定遺傳且細(xì)胞色素P450具有高表達(dá)的HepG2/C3A細(xì)胞系作為研究對(duì)象，選取6種自然界常見(jiàn)酚類(lèi)化合物，分別使其作用于細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞CYP1A線(xiàn)粒體去極化、ROS生成率等指標(biāo)分別進(jìn)行測(cè)試，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終確立預(yù)測(cè)模型。其方法簡(jiǎn)單快速，其用于預(yù)測(cè)藥物的肝毒性，結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確度提高，具有潛在的應(yīng)用推廣前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種酚類(lèi)化合物肝毒性快速預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于有毒物質(zhì)快速檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種酚類(lèi)化合物肝毒性快速預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]日常生活中，人們攝取的許多酚類(lèi)化合物具有致肝損傷的危害，然而肝損傷后有許多的響應(yīng)指標(biāo)，例如肝損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞線(xiàn)粒體電位去極化影響正常功能、造成ROS自由基的過(guò)量生成及DNA損傷、細(xì)胞色素P450表達(dá)異常等等，但這些指標(biāo)是不全面的。因此，單純的用一種指標(biāo)來(lái)判斷是不準(zhǔn)確的。
[0003]本發(fā)明通過(guò)前期對(duì)酚類(lèi)化合物致肝損傷響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行篩選，結(jié)合細(xì)胞系穩(wěn)定遺傳特性，并對(duì)指標(biāo)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行聚類(lèi)分析及鑒別，構(gòu)建出了簡(jiǎn)單快速的預(yù)測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種酚類(lèi)化合物肝毒性快速預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建方法。該方法用于酚類(lèi)化合物肝毒性的預(yù)測(cè)，得到的結(jié)果穩(wěn)定、快速，準(zhǔn)確度提高，具有潛在的應(yīng)用推廣前景。
[0005]本發(fā)明方法涉及檢測(cè)體系的建立，多維復(fù)雜數(shù)據(jù)指標(biāo)的化學(xué)計(jì)量學(xué)可視化分析及建模。這種建模方法全面地整合多個(gè)細(xì)胞指標(biāo)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中的復(fù)雜數(shù)據(jù)投影聚類(lèi)法，能對(duì)有毒物質(zhì)進(jìn)行全面評(píng)估。
[0006]本發(fā)明提供的一種酚類(lèi)化合物肝毒性快速預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建方法，通過(guò)選取具有穩(wěn)定遺傳且細(xì)胞色素P450具有高表達(dá)的H印G2/C3A細(xì)胞系作為研究對(duì)象，選取6種以上酚類(lèi)化合物，分別使其作用于細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞CYP1A2線(xiàn)粒體去極化、ROS生成率等指標(biāo)分別進(jìn)行測(cè)試，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終確立預(yù)測(cè)模型。具體步驟包括:
[0007](I)檢測(cè)體系的建立
[0008]選用!fepG2/C3A細(xì)胞系，鋪板后培養(yǎng)24_36h，此時(shí)細(xì)胞鋪板密度為1000~20000/孔，細(xì)胞代數(shù)為4~8代；其在酚類(lèi)化合物的作用下，經(jīng)步驟①、步驟②和步驟③重復(fù)檢測(cè)，分別得到酚類(lèi)化合物的線(xiàn)粒體去極化、ROS生成率、CYPlA酶活力和CYP2B3A酶活力4個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)集；
[0009]①線(xiàn)粒體去極化試驗(yàn):細(xì)胞經(jīng)酚類(lèi)化合物刺激2_3h后，加裝探針羅丹明123，共同作用30-40min左右，將孔板內(nèi)液體吸出，HBSS清洗后，加酚類(lèi)化合物24_36h，后于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)490nm，吸收波長(zhǎng)535nm進(jìn)行檢測(cè)，得到線(xiàn)粒體去極化指標(biāo)；
[0010]②ROS生成率試驗(yàn):前期加裝探針DCFHDA，30-40min后吸出，HBSS清洗后于細(xì)胞中加入酚類(lèi)化合物作用24-36h，后于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)485nm，吸收波長(zhǎng)525nm進(jìn)行檢測(cè)，得到ROS生成率指標(biāo)；
[0011]③細(xì)胞色素P450試驗(yàn):7-乙氧基試鹵靈及7-芐氧基試鹵靈分別作為底物，酚類(lèi)化合物作用細(xì)胞24-36h后，吸出酚類(lèi)化合物用HBSS清洗后，加入工作液，然后分別加入以上兩種底物，置于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)544nm，吸收波長(zhǎng)590nm進(jìn)行檢測(cè)，分別得到CYP1A、CYP2B3A酶活力指標(biāo)；
[0012](2)多維復(fù)雜數(shù)據(jù)指標(biāo)的化學(xué)計(jì)量學(xué)可視化分析
[0013]采用主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)的算法,先對(duì)步驟(1)中得到的4個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)可視化分析，得到得分，藉此對(duì)藥物樣本進(jìn)行分類(lèi)判斷，選擇主成分；再對(duì)主成分的載荷進(jìn)行分析，用于建立適用的參數(shù)化模型；
[0014](3)綜合分析指標(biāo)的建立
[0015]根據(jù)化學(xué)計(jì)量學(xué)可視化分析的結(jié)果，以主成分分析所得到的貢獻(xiàn)率最大的前兩個(gè)主成分的載荷為參量模型，結(jié)合主成分的載荷的對(duì)建模的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全面的聚類(lèi)情況分析，規(guī)定在一定的主成分載荷范圍內(nèi)的樣本為與相近的此類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品有類(lèi)似的毒性及毒理性質(zhì)，以此方法建立綜合分析指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)模型的建立。
[0016]本發(fā)明中，步驟(1)建立檢測(cè)體系時(shí)，選取6種酚類(lèi)化合物作用于H印G2/C3A細(xì)胞系，其由沒(méi)食子酸、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、綠茶、槲皮素和咖啡酸和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯組成。
[0017]本發(fā)明中，步驟(1)中細(xì)胞色素P450試驗(yàn)采用黑色底部不透明板進(jìn)行細(xì)胞鋪板，線(xiàn)粒體去極化試驗(yàn)和ROS生成率試驗(yàn)采用黑色底部透明板進(jìn)行細(xì)胞鋪板。
[0018]本發(fā)明中采用PCA算法進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)可視化分析。傳統(tǒng)的生物學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)作圖方式多為柱狀圖。它在探討單變量評(píng)價(jià)指標(biāo)中效果直觀(guān)有效，但是在評(píng)價(jià)指標(biāo)變多的情況下，圖表個(gè)數(shù)增多，因而分析繁雜，難以快速有效地進(jìn)行分析。而PCA是一種投影方法，其將多元數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)變換到 一個(gè)子空間中，可以盡可能體現(xiàn)各個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)樣品間的偏差(variance).投影的結(jié)果稱(chēng)為得分(score)，可以用一張二維或三維投影圖來(lái)表現(xiàn)。它反映了各個(gè)樣品間彼此關(guān)聯(lián)度的大小，藉此可以對(duì)樣本的分類(lèi)進(jìn)行判斷。投影的方向稱(chēng)為載荷(loading)，可以用線(xiàn)狀圖或柱狀圖來(lái)表現(xiàn)，它反映了測(cè)量的各個(gè)變量的重要程度。主成分分析方法利用線(xiàn)性組合，即一組主成分，對(duì)各個(gè)樣本計(jì)算得分把樣本集合數(shù)據(jù)投影至低維，并且保持了樣本數(shù)據(jù)中有用的信息，可以反映樣品的性質(zhì)等。
[0019]本發(fā)明選取的指標(biāo)能夠涵蓋肝損傷后常見(jiàn)的響應(yīng)變化，在!fepG2/C3A細(xì)胞系上具有穩(wěn)定的響應(yīng)值，指標(biāo)是可靠的和準(zhǔn)確的。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為R123樣品測(cè)定結(jié)果。
[0021]圖2為ROS樣品測(cè)定結(jié)果。
[0022]圖3為CYPlA樣品測(cè)定結(jié)果。
[0023]圖4為CYP2B/3A樣品測(cè)定結(jié)果。
[0024]圖5為主成分分析的得分矢量投影圖。
[0025]圖6為主成分載荷(loading)圖。
[0026]圖7為主成分分析的得分矢量投影圖，單寧酸測(cè)試集在圖中用X表示。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。[0028]實(shí)施例1
[0029]1.選用沒(méi)食子酸、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDCG)、綠茶、槲皮素、咖啡酸，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)等6種常見(jiàn)酚類(lèi)化合物，單體的濃度為10mg/ml，提取物濃度為100mg/ml。配制母液，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，確保DMSO濃度控制在0.5%以下。
[0030]2.細(xì)胞鋪板密度在20000/孔，200 μ 1，24小時(shí)后，將上清液吸出后，加入200 μ I藥物，作用2.5h后添加終重量體積濃度為Syg/ml羅丹明123，30min后將上清液吸出，HBSS清洗后，再加入200 μ I藥物，24小時(shí)后于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)490nm，吸收波長(zhǎng)535nm檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。
[0031]3.ROS生成率實(shí)驗(yàn):細(xì)胞鋪板濃度在20000/孔，200 μ 1，24小時(shí)后，將上清液吸出后，加入200 μ IJymDCFHDA探針，30min后將上清液吸出后，用HBSS清洗，然后加入200 μ I藥物，24h后置于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)485nm，吸收波長(zhǎng)525nm檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖2所
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[0032]4.CYP1A、CYP2B3A酶活力測(cè)試:細(xì)胞鋪板濃度在20000/孔，200 μ 1，24小時(shí)后，將上清液吸出后，加入200 μ I配制好的樣品，24h后將上清液吸出，用HBSS清洗后加入50 μ I工作液(水楊酰胺與雙香豆素的混合物)，后加入50 μ I提前預(yù)熱的酶反應(yīng)底物7-乙氧基試鹵靈及7-芐氧基試鹵靈，后置于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)544nm，吸收波長(zhǎng)590nm檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖3、圖4所示。
[0033]5.樣品的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析:所有樣品均進(jìn)行六重復(fù)測(cè)定。從上面的數(shù)據(jù)可以得出一個(gè)初步結(jié)論，不同的指標(biāo)側(cè)重于測(cè)量毒性對(duì)細(xì)胞不同方面的作用。因而，許多評(píng)價(jià)的體系得出的結(jié)果不完全一致。比如，NDCG的肝毒性在除羅丹明123的其它3個(gè)指標(biāo)中都表現(xiàn)了明顯的毒性，而綠茶在3個(gè)指標(biāo)中毒性很明顯，除了 ROS指標(biāo)不同。同樣，其它的樣品在不同的指標(biāo)中響應(yīng)不同。因此，對(duì)毒性做綜合評(píng)估需要更加另外的數(shù)學(xué)方法和手段。經(jīng)過(guò)空白樣與六個(gè)樣品的六重復(fù)測(cè)定建立了一個(gè)42個(gè)記錄的數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集輸入MATLAB R2013a軟件進(jìn)行處理。其主成分分析的得分矢量投影圖見(jiàn)圖5。
[0034]圖5中，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)的單位無(wú)量綱。主成分I和2的得分(score)分別在x軸和y軸上。A為0.5%DMS0溶液空白，B為沒(méi)食子酸，C為NDCG，D為綠茶，E為槲皮素，F(xiàn)為咖啡酸，G為EGCG。每類(lèi)樣品以不同的顏色標(biāo)示。從圖中可以看出，樣品聚集為明顯的幾個(gè)類(lèi)別。NDCG和綠茶各自與空白樣的距離比較大，而且它們之間的距離也比較大。結(jié)合前面的單指標(biāo)結(jié)果判斷，兩者都具有明顯肝毒性，并且兩者的毒性機(jī)理也有所不同。單寧酸和沒(méi)食子酸與空白溶液也存在距離，可以推斷為中低毒性物質(zhì)。槲皮素，咖啡酸，HGCG三物質(zhì)與空白樣之間的距離很近，接近于無(wú)毒性。
[0035]圖6標(biāo)示了主成分I和2的載荷(loading)。載荷是主成分分析中，各個(gè)主成分對(duì)于變量的權(quán)重。它是表示模型與變量關(guān)系一個(gè)重要指標(biāo)，可以反映數(shù)據(jù)的各個(gè)變量與數(shù)據(jù)區(qū)分度的大小的關(guān)系。它的絕對(duì)值越大，則表明該檢測(cè)指標(biāo)的重要性越大。圖6中，ROS對(duì)于主成分I的貢獻(xiàn)很大，而R123對(duì)于主成分I則貢獻(xiàn)很小。對(duì)于主成分2，情況正好相反。CYPlA和CYP2B/3A同屬于酶活力測(cè)試，其重要性在兩個(gè)主成分中也大致趨同。這種現(xiàn)象反映了綠茶和NDCG對(duì)ROS和R123兩個(gè)指標(biāo)有著不同的響應(yīng)，符合前面的單變量分析結(jié)果，也證明了利用主成分分析可以綜合挖掘各種指標(biāo)所包含的毒理信息。
[0036]6.綜合分析指標(biāo)的建立和驗(yàn)證:進(jìn)過(guò)上述的可視化分析步驟，以主成分I和2作為參量模型，提出了兩個(gè)指標(biāo)作為毒性物質(zhì)的綜合分析指標(biāo):
[0037]Pl=-0.029577236噸123+0.925580291*R0S+0.298203392
[0038]*CYPlA+0.231302939*CYP2B/3A
[0039]P2=-0.764237679*R123-0.243863606*R0S+0.266833164*CYPlA+0.534108018*CYP2B/3A [0040]所述指標(biāo)R123，ROS, CYP1A, CYP2B/3A必須經(jīng)過(guò)中心化處理，即原值減去建模時(shí)的數(shù)據(jù)集中該指標(biāo)的平均值。
[0041]選用單寧酸作為一個(gè)新的樣品集用已建立的指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。四個(gè)細(xì)胞毒理指標(biāo)測(cè)定的步驟和上述步驟一致，得到的指標(biāo)如下表:
[0042]表1:單寧酸的細(xì)胞測(cè)定結(jié)果
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種酚類(lèi)化合物肝毒性快速預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建方法，其特征在于，選取6種以上酚類(lèi)化合物，分別使其作用于H印G2/C3A細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞CYP1A2線(xiàn)粒體去極化、ROS生成率、CYPlA酶活力和CYP2B3A酶活力指標(biāo)分別進(jìn)行測(cè)試，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終確立預(yù)測(cè)模型；具體步驟包括: (1)檢測(cè)體系的建立 選用!fepG2/C3A細(xì)胞系，鋪板后培養(yǎng)24-36h，此時(shí)細(xì)胞鋪板密度為10000~20000/孔，細(xì)胞代數(shù)為4~8代；其在酚類(lèi)化合物的作用下，經(jīng)步驟①、步驟②和步驟③重復(fù)檢測(cè)，分別得到酚類(lèi)化合物的線(xiàn)粒體去極化、ROS生成率、CYPlA酶活力和CYP2B3A酶活力4個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)集； ①線(xiàn)粒體去極化試驗(yàn):細(xì)胞經(jīng)酚類(lèi)化合物刺激2-3h后，加裝探針羅丹明123，共同作用30-40min左右，將孔板內(nèi)液體吸出，HBSS清洗后，加酚類(lèi)化合物24_36h，后于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)490nm，吸收波長(zhǎng)535nm進(jìn)行檢測(cè)，得到線(xiàn)粒體去極化指標(biāo)； ②ROS生成率試驗(yàn):前期加裝探針DCFHDA，30-40min后吸出，HBSS清洗后于細(xì)胞中加入酚類(lèi)化合物作用24-36h，后于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)485nm，吸收波長(zhǎng)525nm進(jìn)行檢測(cè)，得到ROS生成率指標(biāo)； ③細(xì)胞色素P450試驗(yàn):7-乙氧基試鹵靈及7-芐氧基試鹵靈分別作為底物，酚類(lèi)化合物作用細(xì)胞24-36h后，吸出酚類(lèi)化合物用HBSS清洗后，加入工作液，然后分別加入以上兩種底物，置于酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)544nm，吸收波長(zhǎng)590nm進(jìn)行檢測(cè)，分別得到CYP1A、CYP2B3A酶活力指標(biāo)；` (2)多維復(fù)雜數(shù)據(jù)指標(biāo)的化學(xué)計(jì)量學(xué)可視化分析 采用主成分分析的算法，先對(duì)步驟(1)中得到的4個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)可視化分析，得到得分，藉此對(duì)藥物樣本進(jìn)行分類(lèi)判斷，選擇主成分；再對(duì)主成分的載荷進(jìn)行分析，用于建立適用的參數(shù)化模型； (3)綜合分析指標(biāo)的建立 根據(jù)步驟(2)中化學(xué)計(jì)量學(xué)可視化分析的結(jié)果，以主成分分析所得到的貢獻(xiàn)率最大的前兩個(gè)主成分的載荷為參量模型，結(jié)合主成分的載荷，對(duì)建模的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全面的聚類(lèi)情況分析，規(guī)定在一定的主成分載荷范圍內(nèi)的樣本與相近的此類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品有類(lèi)似的毒性及毒理性質(zhì)，以此方法建立綜合分析指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)模型的建立。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述酚類(lèi)化合物為6種，其由沒(méi)食子酸、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、綠茶、槲皮素和咖啡酸和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中細(xì)胞色素P450試驗(yàn)采用黑色底部不透明板進(jìn)行細(xì)胞鋪板，線(xiàn)粒體去極化試驗(yàn)和ROS生成率試驗(yàn)采用黑色底部透明板進(jìn)行細(xì)胞鋪板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中所述工作液為水楊酰胺與雙香豆素的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中，4個(gè)指標(biāo)重復(fù)6次檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述指標(biāo)R123，R0S，CYP1A，CYP2B/3A經(jīng)過(guò)中心化處理，即為原值減去建模時(shí)的數(shù)據(jù)集中該指標(biāo)的平均值。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(3)中，以綠茶和去甲二氫愈創(chuàng)木酸為參量模型，以Pl和P2兩個(gè)指標(biāo)作為毒性物質(zhì)的綜合分析指標(biāo)，具體公式如下: Pl=-0.029577236噸123+0.925580291*R0S+0.298203392 *CYPlA+0.23130293腫CYP2B/3A ； P2=-0.764237679*R123-0.243863606*R0S+0.266833164*CYPlA+0.534108018*CYP2B/3A ； 其中:R123表示線(xiàn)粒體去極化指標(biāo)；ROS表示ROS生成率指標(biāo)；CYP1A表示CYPlA酶活力指標(biāo)；CY P2B/3A表示P2B/3A酶活力指標(biāo)。
【文檔編號(hào)】G01N21/63GK103487412SQ201310461025
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】陸維盈, 劉潔, 史海明, 俞良莉 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)