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      一種五味子有機(jī)酸分析方法

      文檔序號(hào):6186855閱讀:514來源:國知局
      一種五味子有機(jī)酸分析方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種五味子有機(jī)酸分析方法。本發(fā)明提供了采用GC-MS分析五味子炮制品中有機(jī)酸的分析方法,同時(shí)提供了五味子炮制品中4-氧代戊酸的含量測定方法。該分析方法是:取五味子粉加入硫酸甲醇、NaCl及乙醚-氯仿混合液、無水硫酸鈉,干燥,制得樣品;進(jìn)行GC-MS分析。本發(fā)明針對(duì)五味子炮制品的有機(jī)酸的分析方法具有較強(qiáng)的專屬性和良好的重現(xiàn)性,為五味子炮制前后有機(jī)酸的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。
      【專利說明】一種五味子有機(jī)酸分析方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及中藥飲片的質(zhì)量控制領(lǐng)域,具體涉及五味子飲片有機(jī)酸的分析方法及其中代表性物質(zhì)4-氧代戊酸的質(zhì)量控制方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002]五味子是木蘭科五味子Schisandra Chinese (Turcz.) Baill.的干燥成熟的果實(shí),具有收斂固澀,益氣生津,補(bǔ)腎寧心之效。臨床用于久嗽虛喘,夢遺滑精,遺尿尿頻,久瀉不止,自汗,盜汗,津傷口渴,短氣脈虛,內(nèi)熱消渴,心悸失眠?!吨袊幍洹?010版收載的五味子的炮制品種是五味子及醋蒸五味子,在五味子的臨床應(yīng)用上亦以此兩種為主,醋蒸后酸澀作用增強(qiáng),澀精止瀉作用增強(qiáng)。五味子中主要成分包括木脂素、揮發(fā)油、有機(jī)酸類等。其中,木脂素的成分主要為聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素,現(xiàn)代研究多認(rèn)為其為五味子中最主要的生物活性成分,具有保肝、抗氧化等藥理作用,以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等為代表,揮以油主要以a-菔烯,莰烯,(6-菔烯,月桂烯,a-萜品烯,檸檬烯,Y -萜品烯等為主,而有機(jī)酸多以小分子有機(jī)酸為主,如枸櫞酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸等。
      [0003]目前藥典及各研究報(bào)道主要集中在對(duì)其所含木脂素成分的研究,有較多的文獻(xiàn)對(duì)五味子炮制前后的木脂素含量進(jìn)行了分析,其結(jié)果說明五味子經(jīng)醋蒸后木脂素含量稍有增加,但基本無顯著性差異,現(xiàn)版藥典中關(guān)于五味子飲片及醋五味子飲片的質(zhì)量控制均只以木脂素代表性成分五味 子醇甲作為其指標(biāo)性成分,且限度相同。但五味子在醋蒸前后的藥效作用及臨床運(yùn)用有較大的差異,且五味子醋蒸后主要體現(xiàn)的是止瀉作用增強(qiáng),尚無其增強(qiáng)止瀉的相關(guān)成分的文獻(xiàn)報(bào)道。因此對(duì)五味子炮制品進(jìn)行全面的質(zhì)量評(píng)價(jià),特別是選擇與藥效作用相關(guān)成分并確定其限度,才能更加有效地保證五味子炮制品的質(zhì)量,以保證其在臨床上發(fā)揮最大的功效。
      [0004]作為收斂固澀藥的代表,五味子中的有機(jī)酸成分亦不容忽視。五味子的藥效作用應(yīng)是多成分的綜合作用,不僅僅體現(xiàn)在其主要的木脂素類成分,因此對(duì)五味子中有機(jī)酸的化學(xué)成分、藥理作用亦應(yīng)深入研究,特別是炮制前后在有機(jī)酸上的差異。文獻(xiàn)上對(duì)五味子有機(jī)酸的分析主要采取的是電位滴定法測定其所含的總有機(jī)酸含量,而對(duì)其具體的有機(jī)酸成分報(bào)道較少,特別是醋蒸后有機(jī)酸成分的變化無文獻(xiàn)報(bào)道。
      [0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有研究的空白,采用新的手段對(duì)五味子中的有機(jī)酸進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià),特別是對(duì)生五味子及醋五味子有機(jī)酸采取了直接甲酯化的方法,并采用氣質(zhì)聯(lián)用的方法進(jìn)行了全面的分析,研究過程中發(fā)現(xiàn)五味子醋蒸后4-氧代戊酸的含量明顯增加,通過藥理實(shí)驗(yàn)證明4-氧代戊酸具有止瀉的作用,測定了其中4-氧代戊酸的含量并規(guī)定了限度,解決了五味子炮制品有機(jī)酸質(zhì)量控制的難題,充分體現(xiàn)了與藥效相關(guān)的指標(biāo)來控制飲片質(zhì)量的要求,提高后的有機(jī)酸質(zhì)量檢測能更好地控制五味子炮制品中的有機(jī)酸的質(zhì)量,本方法具有較強(qiáng)的專屬性和良好的重現(xiàn)性。
      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006]為了解決上述問題,本發(fā)明的目的在于提供一種五味子有機(jī)酸分析檢測的方法,并建立五味子炮制品中4-氧代戊酸的含量測定方法。為了達(dá)到這個(gè)目的,采用如下技術(shù)方案:
      [0007]—種五味子炮制品有機(jī)酸的分析方法,包括以下步驟:
      [0008](I)樣品制備方法:取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g,精密稱定,置具塞試管中,精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得。
      [0009](2)GC-M S分析條件:質(zhì)譜條件:EI離子源;電子能量70eV ;離子源溫度230°C;四級(jí)桿溫度150°C;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱(30mX 250 u m,0.5 u m);氦氣(99.999%)為載氣,流速 1.0mL/min ;柱前壓 0.17IMPa ;進(jìn)樣 口溫度 250°C ;分流進(jìn)樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C,以5°C /min的速率升至260°C (恒溫lOmin)。
      [0010]采用上述方法分析五味子炮制品有機(jī)酸,結(jié)果表明:五味子醋蒸后,4-氧代戊酸在生五味子飲片中其相對(duì)含量為0.692%,而在醋五味子飲片中相對(duì)含量達(dá)到1.653%,醋五味子中4-氧代戊酸相對(duì)含量是生五味子中的2.38倍。
      [0011]本發(fā)明還公開一種利用上述有機(jī)酸分析方法的4-氧代戊酸的含量測定方法,該方法包括以下步驟:
      [0012](I)對(duì)照品溶液的制備:分別精密吸取4-氧代戊酸對(duì)照品適量置5mL量瓶中,各加10%硫酸甲醇溶液溶解并定容至刻度。
      [0013](2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取水楊酸甲酯適量至IOOmL量瓶中,用乙醚-氯仿混合液(2:1)溶解并稀釋至刻度。
      [0014](3)供試品溶液的制備取五味子飲片粉末(60目)0.2g,精密稱定,置具塞試管中,精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL溶液,置于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2:1) 2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min),精密吸取上清液lmL,加入水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液lmL,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得。
      [0015](4) GC-MS分析條件質(zhì)譜條件:EI離子源;電子能量70eV;離子源溫度230°C ;四級(jí)桿溫度150 °C ;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱(30mX250umX0.5um);氦氣(99.999%)為載氣,流速 1.0mL/min ;柱前壓 0.17IMPa ;進(jìn)樣口溫度250°C ;分流進(jìn)樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C,以5°C /min的速率升至140。。。
      [0016](5)含量測定:精密吸取對(duì)照品及供試品溶液I U 1,注入氣相色譜儀,測定(n=3),即得。
      [0017]本發(fā)明還公開了一種五味子質(zhì)量控制方法,是用上述方法測定五味子中4-氧代戊酸含量,按照五味子干燥品中4-氧代戊酸含量計(jì),結(jié)果不少于設(shè)定值。生五味子與醋五味子的設(shè)定值分別為0.28%,0.60%。本發(fā)明對(duì)五味子有機(jī)酸進(jìn)行了全面的分析并提出了質(zhì)量控制方法,該方法提供了氣相色譜法測定藥物中4-氧代戊酸成分的含量,本發(fā)明的質(zhì)量控制方法具有較強(qiáng)的專屬性和良好的重現(xiàn)性?!緦@綀D】

      【附圖說明】
      [0018]圖1為五味子炮制品有機(jī)酸甲酯化GC-MS總離子流色譜圖。
      [0019]圖2為五味子炮制品有機(jī)酸部位甲酯化GC-MS總離子流色譜圖。
      [0020]圖3為4-氧代戊酸甲酯質(zhì)譜圖。
      [0021]圖4為4-氧代戊酸含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
      [0022]圖5為五味子炮制品4-氧代戊酸含量測定GC-MS總離子流圖。
      【具體實(shí)施方式】
      [0023]結(jié)合【具體實(shí)施方式】,對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明如下:
      [0024]實(shí)施例1、五味子不同炮制品有機(jī)酸的分析比較
      [0025]1.1儀器與試藥
      [0026]1.1.1 儀器
      [0027]美國Agilent GC6890-MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有NIST2005標(biāo)準(zhǔn)譜庫),LXJ-2B多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),METTLER AE240電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司),THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。
      [0028]1.1.2 試劑
      [0029]甲醇、濃硫酸、氯仿、乙醚、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純。
      [0030]1.2樣品的制備
      [0031]1.2.1五味子飲片甲酯化樣品的制備
      [0032]取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g,精密稱定,置具塞試管中,精密加A 10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,力口適量無水硫酸鈉,干燥,即得。
      [0033]1.2.2飲片試樣空白的制備
      [0034]取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g,精密稱定,置具塞試管中,精密加入甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得。
      [0035]1.2.3醋甲酯化試樣的制備
      [0036]取IOmL醋按醋蒸五味子的炮制工藝,常壓蒸5h后,加水定容至25mL,精密吸取0.1mL溶液(相當(dāng)于0.2g藥材中加入的輔料醋的量),置具塞試管中,精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得。
      [0037]1.2.4醋試樣空白的制備
      [0038]取IOmL醋按醋蒸五味子的炮制工藝,常壓蒸5h后,加水定容至25mL,精密吸取
      0.1mL溶液(相當(dāng)于0.2g藥材中加入的輔料醋的量),置具塞試管中,精密加入甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得。
      [0039]1.2.5試劑甲酯化空白的制備
      [0040]精密吸取10%的硫酸甲醇1.0mL溶液置具塞試管中,于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2:1)2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得。
      [0041]1.2.6試劑空白的制備
      [0042]精密吸取甲醇1.0mL置具塞試管中,于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2: l)2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得。
      [0043]1.3GC-M S 分析條件
      [0044]質(zhì)譜條件:EI離子源;電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級(jí)桿溫度150°C ;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。
      [0045]色譜條件:HP-5色譜柱(30mX250iim,0.5iim);氦氣(99.999%)為載氣,流速
      1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進(jìn)樣口溫度250°C ;分流進(jìn)樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C,以5°C /min的速率升至260°C (恒溫IOmin)。
      [0046]將各供試品溶液1.0 ii L按1.3項(xiàng)下條件進(jìn)行GC-MS分析。
      [0047]1.4 結(jié)果
      [0048]在實(shí)驗(yàn)過程中,對(duì)甲酯化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)選:分別比較了甲酯化試劑10%硫酸甲醇溶液和苯-10%硫酸甲醇溶液(1: 1),硫酸濃度8%硫酸-甲醇、10%硫酸-甲醇、12%硫酸-甲醇,甲酯化試劑的用量lmL、2mL、3mL,甲酯化時(shí)間12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí),根據(jù)GC分析結(jié)果,以出峰的個(gè)數(shù)與豐度為指標(biāo),確定10%硫酸-甲醇ImL振蕩24小時(shí)甲酯化基本完全;對(duì)萃取溶劑苯和氯仿-乙醚進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)以苯為提取溶劑的色譜圖,溶劑出峰時(shí)間晚,為了避免對(duì)有機(jī)酸成分的干擾,選用氯仿-乙醚(2:1)作為萃取溶劑;為促進(jìn)甲酯化液分液,在其中加入了飽和氯化鈉溶液,并對(duì)其的用量比例進(jìn)行了為1、1.5mL、2mL考察,確定2mL飽和氯化鈉符合酸度要求。
      [0049]將五味子炮制品有機(jī)酸甲酯化物及空白樣品用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分離、鑒定,經(jīng)與NIST2005標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)比檢索,結(jié)果從生、醋五味子飲片中檢出69、70種成分,分別占其總量的93.360%、92.226%。具體結(jié)果見表I及圖1。
      [0050]從表I檢出的結(jié)果可以看出,生五味子與醋五味子的有機(jī)酸在化學(xué)成分組成有一定的相似性。同時(shí),兩者在化學(xué)成分的種類及成分組成的相對(duì)比例上均有一定的差別。
      [0051]有些成分在五味子醋蒸后已無法檢測到,即生五味子飲片中有,而對(duì)應(yīng)的醋品中未檢測到,如9.478min的丙二酸二甲酯(生五味子中的百分含量為0.033%)。
      [0052]但同時(shí)在醋蒸后,有一些新的化合物的被檢測到,如4.522min的2-羥基丙酸甲酯為醋的特征峰,醋五味子及輔料醋中均檢出此物,而在對(duì)應(yīng)的生品中均無此物。22.807min的a -羥基苯丙酸甲酯(醋五味子中的百分含量為0.041%), 32.89min的未知物(醋五味子中的百分含量為0.029%), 39.148min的未知物(醋五味子中的百分含量為0.076%),以上物質(zhì)在生五味子中均未檢測到,因此說明此物質(zhì)可能是醋蒸加熱過程所產(chǎn)生。
      [0053]但較多的是成分在醋蒸后含量上產(chǎn)生了變化差別。醋蒸后,有的含量增高,如10.184min的2,2-二甲氧基丙酸甲酯(生藥0.016%,醋藥0.084%,);11.46min4_氧代戊酸甲酯(生藥0.692%,醋藥1.653%); 14.409min的未知物(生藥峰量小未積分,醋藥0.021%,);16.631min的未知物(生藥1.67%,醋藥3.284%) ;19.646min的未知物(生藥0.213,醋藥0.323%) ;21.536min 的未知物(生藥 0.006%,醋藥 0.019%) ;21.598min 的未知物(生藥0.016%,醋藥 0.024%);29.71min 的未知物(生藥 0.031%,醋藥 0.043%);31.163min 的 12-甲基十三酸甲酯(生藥0.068%,醋藥0.105%) ;33.063的未知物(生藥0.199%,醋藥0.516%);33.316min的十五酸甲酯(生藥0.067%,醋藥0.11%) ;33.473的未知物(生藥0.013%,醋藥0.031%) ;37.371min的十七酸甲酯(生藥0.021%,醋藥0.038%) ;39.711min的未知物(生藥0.366%,醋藥0.533%)。也有醋蒸后含量降低的,主要是一些非酸的化合物及未知化合物,且這些化合物的相對(duì)含量均小于0.2%,如22.431min的未知物、24.372min的1-丙烯-1,2,3-三羧酸三甲酯、25.732min 的 I, 2,3,4,4a, 5,6,8a_八氫_4a,8-二甲基-2-( 1-甲乙基)-萘;25.87min的2-十三烷酮;26.461min的1-甲基-4- (1,2,2-三甲基環(huán)戊基)苯;26.812min 的 1,6_ 二甲基-4- (1-甲基乙基)_1,2,3,4-四氫萘、27.326min 的 a -白菖考烯、29.187min 的 I, 2, 4a, 5,8,8a_ 六氫-4,7-二甲基-1-(1-甲乙基)-萘;29.483min的香橙烯;29.925min的1A, 2,3,4, 4A, 5,6, 7B-八氫化_1,1,4, 7-四甲基-1H-環(huán)丙烯并奧;30.096min 的 2,6,6,9-四甲基-三環(huán)[5.4.0.0 (2, 8)] ^^一 _9_ 烯;30.251min 的未知物;30.427min 的 6- 二甲基-4- (1-甲基乙基)萘;30.669 的 2,4a, 5,6,9a_ 六氫-3,5,5,9-四甲基(IH)苯并環(huán)庚烯;30.872min的1,5,5,9-四甲基-1,8-二烯-螺[55] 十一烷;32.171min的未知物;32.514min的未知物;33.563的未知物;33.96的未知物;36.907min的未知物;39.064的未知物。
      [0054]從五味子樣品甲酯化后GC-MS總離子流圖可見,五味子醋蒸后,4-氧代戊酸在生五味子飲片中其相對(duì)含量為0.692%,而在醋五味子飲片中相對(duì)含量達(dá)到1.653%,醋五味子有機(jī)酸相對(duì)含量是生五味子有機(jī)酸相對(duì)含量有2.38倍,提示其可能與醋蒸后五味子的藥效作用相對(duì)應(yīng)。
      [0055]表1五味子不同炮制品有機(jī)酸GC-MS分析結(jié)果
      [0056]
      【權(quán)利要求】
      1.一種五味子有機(jī)酸分析方法,其特征在于包括以下步驟: (1)樣品制備方法:取五味子粉末約0.2g,精密稱定,置具塞試管中,精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液2mL,混旋3min,離心5min,取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得; (2)GC-M S分析條件:質(zhì)譜條件:EI離子源;電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級(jí)桿溫度150°C ;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min ;色譜條件:HP_5色譜柱;氦氣為載氣,流速1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進(jìn)樣口溫度250°C ;分流進(jìn)樣;程序升溫:初始溫度40°C,以5°C /min的速率升至260°C,再保持lOmin。
      2.一種測定4-氧代戊酸含量的方法,其特征在于包括以下步驟: (1)對(duì)照品溶液的制備分別精密吸取4-氧代戊酸對(duì)照品適量置5mL量瓶中,各加10%硫酸甲醇溶液溶解并定容至刻度; (2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取水楊酸甲酯適量至IOOmL量瓶中,用乙醚-氯仿混合液溶解并稀釋至刻度; (3)供試品溶液的制備取五味子粉末0.2g,精密稱定,置具塞試管中,精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL溶液,置于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h后,精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液2mL,混旋3min,離心5min,精密吸取上清液ImL,加入水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液lmL,加適量無水硫酸鈉,干燥,即得; (4)GC-MS分析條件 質(zhì)譜條件:EI離子源;電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級(jí)桿溫度150°C;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱;氦氣為載氣,流速1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進(jìn)樣口溫度250°C ;分流進(jìn)樣;程序升溫:初始溫度40°C,以50C /min的速率升至140°C ; (5)含量測定精密吸取對(duì)照品及供試品溶液IU 1,注入氣相色譜儀,測定,即得。
      3.—種五味子質(zhì)量控制方法,其特征在于,用權(quán)利要求2的方法測定五味子中4-氧代戊酸含量,按照五味子干燥品中4-氧代戊酸含量計(jì),結(jié)果不少于設(shè)定值。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述4-氧代戊酸的含量測定方法,其特征在于按照五味子炮制品干燥品中4-氧代戊酸含量計(jì),生五味子與醋五味子的設(shè)定值分別為0.28%, 0.60%。
      【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103604890SQ201310654107
      【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
      【發(fā)明者】殷放宙, 殷武, 李林, 陸兔林, 蔡寶昌, 李偉東 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)
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