專利名稱：一種金銀花有機(jī)酸及其制備方法和檢測(cè)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金銀花有機(jī)酸及其制備方法和金銀花或含有金銀花制劑的檢測(cè)分析方法。
背景技術(shù)：
金銀花為忍冬科多年生半常綠纏繞性木質(zhì)藤本植物忍冬的花蕾，又名忍冬、銀花、雙花等。性寒、味甘；歸肺、心、胃經(jīng)。有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效。中醫(yī)認(rèn)為“金銀花具有清熱解毒、涼血化瘀的功效，主治外感風(fēng)熱、紅腫熱痛”等病癥。自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥。早在3000年前，我們祖先就開始用它防治疾病，《名醫(yī)別錄》把它列為上品。李時(shí)珍指出用它煮汁釀酒，服之，有“輕身長(zhǎng)年益壽”之效?！缎滦薇静荨酚涊d金銀花常與黃芩、梔子、石膏、竹茹、蘆根等同用，具有清熱解毒、透邪外出、和胃止嘔作用，可用于邪熱壅阻，胃氣不和，發(fā)熱煩躁，胸隔痞悶，口渴干嘔，舌紅苔燥，脈象滑數(shù)。金銀花既能宣散風(fēng)熱，還善清解血毒，主治溫病發(fā)熱，熱毒血痢，癰疽疔毒等，為治療癰腫疔瘡陽證的要藥，用于各種熱性病，如身熱、發(fā)疹、發(fā)斑、熱毒瘡疔、咽喉腫痛等癥，均效果顯著。
金銀花有機(jī)酸是金銀花的主要活性物質(zhì)之一，它主要含有綠原酸chlorogenicacid、3，5-二咖啡酰奎寧酸3，5-di-O-caffeoylquinic acid、3，4-二咖啡?？鼘幩?b>3，4-di-O-caffeoylquinic acid等，具有抗菌抗病毒、止血、抗肝炎等作用；其抗菌譜廣，對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、腦膜炎雙球菌、肺炎雙球菌、綠膿桿菌以及流感病毒等都有明顯抑制作用，對(duì)鉤端螺旋體、流感病毒及致病霉菌等多種病原微生物亦有抑制作用，并有明顯的抗炎及解熱作用；因此，金銀花藥材或含有金銀花的制劑中，應(yīng)對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行充分的研究，在質(zhì)量檢測(cè)中應(yīng)以有機(jī)酸為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析。
現(xiàn)有文獻(xiàn)、專利、藥典在制備和檢測(cè)金銀花及其制劑時(shí)，都是以綠原酸為指標(biāo)進(jìn)行制備和檢測(cè)分析，這種制備方法和檢測(cè)分析方法并不能客觀評(píng)定金銀花、含有金銀花制劑的工藝和質(zhì)量，金銀花中有機(jī)酸還含有3， 5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩岬龋谥贫üに嚪椒ê蜋z測(cè)方法中建立3，5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡酰奎寧酸為標(biāo)準(zhǔn)品的方法是可行的，但因?yàn)?，5-二咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡?？鼘幩嵩跈z測(cè)中使用量需要g級(jí)，而這兩種成分提取純化過程比較復(fù)雜，得到標(biāo)準(zhǔn)品需要大量的工作，因此，建立一種簡(jiǎn)單的工藝方法和質(zhì)量分析方法并且可以客觀的反應(yīng)金銀花有機(jī)酸質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，是很多醫(yī)藥質(zhì)量分析人員急需解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，我們科研人員通過大量的實(shí)驗(yàn)研究確定了金銀花有機(jī)酸中綠原酸含量20％-55％，3，5-二咖啡?？鼘幩岷繛?0％-20％，3，4-二咖啡?？鼘幩岷繛?％-20％，總含量以綠原酸、3，4-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩嵊?jì)大于等于50％且小于等于95％；質(zhì)量分析人員通過大量的分析實(shí)驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)3，5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩岱迕娣e與綠原酸峰面積在高效液相色譜圖中具有一定的關(guān)系，通過校正因子方法，以綠原酸為對(duì)照品，建立了一種客觀的檢測(cè)分析方法。
本申請(qǐng)金銀花有機(jī)酸中主要含有綠原酸chlorogenic acid、3，5-二咖啡酰奎寧酸3，5-di-O-caffeoylquinic acid、3，4-二咖啡?？鼘幩?b>3，4-di-O-caffeoylquinicacid等；本申請(qǐng)金銀花有機(jī)酸可以與具有清熱解毒等作用的中藥有效成分或有效部位進(jìn)行組合；如金銀花有機(jī)酸與黃芩苷組合，金銀花有機(jī)酸與黃芩苷、魚腥草素鈉組合，金銀花有機(jī)酸與黃連素組合，金銀花有機(jī)酸與連翹苷組合等等；一.金銀花有機(jī)酸制備方法取金銀花，加水回流提取2-4次，每次15-40分鐘，提取液濾過，合并濾液，濃縮，水溶液用鹽酸調(diào)pH值至1-4，再用乙酸乙酯萃取1-4次，乙酸乙酯用量分別為水相量的0.5-2.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；或取金銀花，用40％-90％乙醇回流提取2-4次，每次15-40分鐘，減壓濃縮至無醇味，水溶液用氯仿萃取2-4次，水相用鹽酸調(diào)pH值至1-4，再用乙酸乙酯萃取1-4次，乙酸乙酯用量分別為水相量的0.5-2.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸。
本申請(qǐng)金銀花有機(jī)酸與中藥有效部位或有效成分組合可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液體制劑、注射液和粉針劑中的一種。
二.金銀花及其金銀花制劑的檢測(cè)分析方法色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；梯度洗脫，流動(dòng)相變化為0-70分鐘時(shí)流動(dòng)相0.2％磷酸二氫鈉溶液乙腈體積比為94∶6-70∶30；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；流速1ml/min；柱溫30℃；對(duì)照品溶液的配制精密稱定綠原酸對(duì)照品，置容量瓶中，加無水乙醇，超聲處理，再加水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；供試品溶液的配制精密稱取樣品，加無水乙醇，超聲處理，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；或精密稱取金銀花藥材，加無水乙醇，超聲處理，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，即得；
總有機(jī)酸的峰面積以下列公式計(jì)算A總＝A綠原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎寧酸+0.93A3，4-二咖啡?？鼘幩帷?br> 綠原酸含量按照A綠原酸計(jì)算。
3，5-二咖啡?？鼘幩岷堪凑?.78A3，5-二咖啡?？鼘幩嵊?jì)算。
3，4-二咖啡酰奎寧酸含量0.93A3，4-二咖啡?？鼘幩嵊?jì)算。
綠原酸保留時(shí)間在24分鐘左右，3，5-二咖啡酰奎寧酸保留時(shí)間在51分鐘左右，3，4-二咖啡?？鼘幩岜Ａ魰r(shí)間在55分鐘左右。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1表1金銀花有機(jī)酸含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過上述分析實(shí)驗(yàn)表明，本申請(qǐng)有機(jī)酸具有實(shí)際意義，本申請(qǐng)檢測(cè)分析方法具有科學(xué)意義。
三.檢測(cè)方法學(xué)的建立1.色譜條件的選擇金銀花有機(jī)酸主要含綠原酸，3，4-二咖啡酰奎寧酸，3，5-二咖啡酰奎寧酸，在下文中，為敘述方便，將兩種異綠原酸成分(3，5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩?的名稱寫為異綠原酸。
流動(dòng)相10.04％磷酸溶液-乙腈(75∶25)流動(dòng)相，進(jìn)樣，結(jié)果綠原酸峰出峰時(shí)間較早，且理論板數(shù)不高，而異綠原酸峰未出。因此，應(yīng)選擇梯度色譜條件進(jìn)行流動(dòng)相篩選。
在下述流動(dòng)相篩選過程中，為保證梯度條件的穩(wěn)定和可重現(xiàn)性，流速均為1.0ml/min，同時(shí)考慮到在試驗(yàn)過程中溫度控制的便利，柱溫均為30℃。
流動(dòng)相2流動(dòng)相(A)0.04％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脫，程序如下

此條件綠原酸峰與其相鄰峰分離度不好。
流動(dòng)相3流動(dòng)相(A)0.04％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脫，程序如下

此條件綠原酸峰與其相鄰峰分離度略有改善。
流動(dòng)相4流動(dòng)相(A)0.2％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脫，程序如下

此條件綠原酸峰與其相鄰峰分離度好，其余峰的分離度也較好。
流動(dòng)相5流動(dòng)相(A)0.4％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脫，程序如下

此條件綠原酸峰與其相鄰峰分離度較好，與條件4相比沒有改善。因此選擇條件4為本品的流動(dòng)相條件。
2.檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇由紫外吸收知，金銀花提取物中綠原酸峰在326nm，3，5-二咖啡酰奎寧酸峰在328nm，3，4-二咖啡酰奎寧酸峰在328nm，參考中國藥典2000年版一部藥材金銀花項(xiàng)下含量測(cè)定的波長(zhǎng)327nm(第177頁)，且各峰在327nm處均有較大吸收，因此本品選擇327nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
由以上試驗(yàn)確定金銀花提取物的檢測(cè)條件為色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Kromasil250×4.6mm，5μm)，ODS預(yù)柱；流動(dòng)相(A)0.2％磷酸溶液；(B)乙腈，梯度洗脫，程序如下

流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；柱溫30℃.
在選定條件下，綠原酸和異綠原酸峰出峰時(shí)間適當(dāng)，峰形對(duì)稱性均良好，與其相鄰色譜峰的分離度良好。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)不低于10000。
3.金銀花總有機(jī)酸含量測(cè)定方法的擬定金銀花總有機(jī)酸主要含綠原酸，3，4-二咖啡?？鼘幩?，3，5-二咖啡?？鼘幩?，測(cè)定此三種酸的含量總和可反映金銀花有機(jī)酸的含量水平。采用綠原酸對(duì)照品以外標(biāo)法測(cè)定，可直接測(cè)定金銀花總有機(jī)酸中的綠原酸含量，對(duì)于其他兩種異綠原酸的含量測(cè)定則可通過測(cè)定綠原酸相對(duì)于兩種異綠原酸的校正因子，從而用綠原酸對(duì)照品以外標(biāo)法間接測(cè)定兩種異綠原酸的含量。綠原酸保留時(shí)間在24分鐘左右，3，5-二咖啡?？鼘幩岜Ａ魰r(shí)間在51分鐘左右，3，4-二咖啡?？鼘幩岜Ａ魰r(shí)間在55分鐘左右。
采用綠原酸對(duì)照品以外標(biāo)法測(cè)定時(shí)，金銀花總有機(jī)酸的峰面積可表示為A總＝A綠原酸+αA3，5-二咖啡酰奎寧酸+βA3，4-二咖啡?？鼘幩崞渲笑?、β為綠原酸相對(duì)于兩個(gè)異綠原酸的校正因子；αA3，5-二咖啡酰奎寧酸項(xiàng)表示3，5-二咖啡酰奎寧酸的峰面積相當(dāng)于同等濃度的綠原酸的峰面積值；βA3，4-二咖啡?？鼘幩犴?xiàng)表示3，4-二咖啡?？鼘幩岬姆迕娣e相當(dāng)于同等濃度的綠原酸的峰面積值；通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得α、β的值，即可求得A總。
4.異綠原酸含量的測(cè)定測(cè)定異綠原酸與綠原酸的校正因子，應(yīng)采用符合規(guī)定的對(duì)照品來測(cè)定。其中，綠原酸對(duì)照品來源于中檢所，異綠原酸對(duì)照品為在金銀花提取物的基礎(chǔ)上精制而成，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證的研究。不同批次異綠原酸精制品的比較研究如下。
取3，4-二咖啡酰奎寧酸和3，5-二咖啡?？鼘幩岬膶?duì)照品及其他各批精制品各約20mg置50ml量瓶中，以無水乙醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，各精密量取續(xù)濾液5ml至10ml量瓶中，以50％乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由色譜圖的歸一化法計(jì)算各批異綠原酸的純度，按外標(biāo)法以各自異綠原酸對(duì)照品為對(duì)照，以峰面積計(jì)算其他各批異綠原酸的含量，見表2、3。
表2 3，5-二咖啡?？鼘幩峒兌扰c含量測(cè)定

表3 3，4-二咖啡?？鼘幩峒兌扰c含量測(cè)定

由上可知，不同批次異綠原酸精制品與各自的對(duì)照品比較，其含量相差不大，雜質(zhì)含量按峰面積歸一化法計(jì)算，均小于2.0％，實(shí)際上均已達(dá)到中藥對(duì)照品的要求。
因中藥對(duì)照品由提取精制而成，因此，不同的精制批次，其雜質(zhì)會(huì)略有差別。為使測(cè)定的異綠原酸的校正因子更具科學(xué)性、代表性，采用上述異綠原酸對(duì)照品與多批次的異綠原酸精制品分別測(cè)定其校正因子，并取其平均值作為標(biāo)準(zhǔn)校正因子。
5.異綠原酸校正因子的測(cè)定綠原酸對(duì)照品溶液的配制取綠原酸對(duì)照品約10mg置50ml量瓶中，加無水乙醇25ml超聲使溶解，再以水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。
異綠原酸溶液的配制取3，4-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡酰奎寧酸的對(duì)照品及其他各批精制品各約20mg置50ml量瓶中，以無水乙醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，各精密量取續(xù)濾液5ml至10ml量瓶中，以50％乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。
精密量取上述各溶液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積計(jì)算綠原酸及各批異綠原酸的響應(yīng)因子。結(jié)果見表4、5。
表4金銀花提取物中3，5-二咖啡?？鼘幩嵝Ｕ蜃訙y(cè)定

表5金銀花提取物中3，4-二咖啡?？鼘幩嵝Ｕ蜃訙y(cè)定

在上表中，響應(yīng)因子計(jì)算公式為fi＝Ai/Ci，i對(duì)應(yīng)于同一種酸；校正因子的計(jì)算公式為f異3，5＝(A綠/C綠)/(A異3，5/C異3，5)f異3，4＝(A綠/C綠)/(A異3，4/C異3，4)f異3，5校正因子的物理意義為，3，5-二咖啡?？鼘幩岬姆迕娣e折算為同等濃度的綠原酸的峰面積的系數(shù)，即為上述公式中的α；f異3，4校正因子的物理意義為，3，4-二咖啡?？鼘幩岬姆迕娣e折算為同等濃度的綠原酸的峰面積的系數(shù)，即為上述公式中的β；即總有機(jī)酸峰面積以下列公式計(jì)算A總＝A綠原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎寧酸+0.93A3，4-二咖啡酰奎寧酸由此，金銀花有機(jī)酸的含量可以用綠原酸對(duì)照品以外標(biāo)法測(cè)定。
四.藥理實(shí)驗(yàn)1.抗菌實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，體重190-230g；
菌種金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌；實(shí)驗(yàn)方法大鼠分組，雌雄各半，本申請(qǐng)金銀花有機(jī)酸及其組合物灌胃給藥2次/日，每次給藥量為200mg/kg，共5次，末次給藥后2小時(shí)，ip戊巴比妥鈉35mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈無菌采血，注入無菌負(fù)壓采血管，凝固后離心分離血清，新華1號(hào)濾紙片制備無菌的小圓片，分裝于無菌小瓶?jī)?nèi)，取上述血清加入小瓶中，浸泡1小時(shí)，置零下20℃冰箱保存。
菌種復(fù)活后，分別在MHA平板及MHA血平板上純培養(yǎng)15小時(shí)，用無菌生理鹽水洗取菌落，用無菌棉簽取菌液均勻涂布于平板表面，待平板略干后，在標(biāo)記位置上貼上上述不同方案的濾紙片，放入37℃溫箱24小時(shí)取出，攝像機(jī)攝像，圖象分析儀測(cè)量抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6表6金銀花有機(jī)酸及其組合物血清紙片抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注與空白血清組比較**P＜0.01，*P＜0.05；與陽性對(duì)照組方案1-11組比較##P＜0.012.采用半體內(nèi)法作抗病毒作用試驗(yàn)(1)對(duì)甲型流感病毒的影響實(shí)驗(yàn)采用半體內(nèi)法，不同方案組、正常對(duì)照組及空白對(duì)照組，將不同藥物相同濃度分別與病毒直接作用，立即接種于雞胚尿囊腔中，用石蠟封接種孔，置37℃孵箱培養(yǎng)48h，收取每胚之尿液，用0.5％雞紅血球凝集試驗(yàn)，判斷藥物的抗病毒活性，結(jié)果見表3
(2)對(duì)乙型流感病毒的影響接種方法、藥物劑量同甲型流感病毒實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見下表7。
表7對(duì)流感病毒的作用比較

注-代表無病毒生長(zhǎng)，+-代表少量病毒生長(zhǎng)，++代表較多病毒生長(zhǎng)，+++代表大量病毒生長(zhǎng)3.對(duì)內(nèi)毒素致兔發(fā)熱的解熱作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大耳白兔，級(jí)別健康一級(jí)，月齡4月，性別雄性，體重1.95±0.25kg。
實(shí)驗(yàn)方法雄性大耳白兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、本申請(qǐng)金銀花有機(jī)酸組。稱取動(dòng)物空腹體重，以計(jì)算給藥量。除空白對(duì)照組和模型組給予等量的蒸餾水外，其余各組動(dòng)物灌胃給予相應(yīng)的藥物，給藥量為500mg/kg。除空白對(duì)照組以1.0ml/kg的生理鹽水代替內(nèi)毒素外，其余各組供試大耳白兔給藥40min時(shí)耳緣靜脈注射內(nèi)毒素1200Eu/ml/kg造模，造模后0.5h、1h、2h、3h、4h和5h各測(cè)量一次肛溫。每次抓取兔的動(dòng)作要輕柔，體溫計(jì)插入肛門的深度與時(shí)間基本相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6表6不同制劑對(duì)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素致兔發(fā)熱的解熱作用

注與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05。
4.對(duì)CCl4致大鼠肝纖維化的影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇雄性健康Wistar大鼠，體重180-200g。
實(shí)驗(yàn)方法將大鼠均隨機(jī)分正常組、模型組、本申請(qǐng)金銀花有機(jī)酸組(2.2g/kg)，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠首次于皮下注射CCl45ml/kg，以后每周2次背部皮下注射40％CCl4橄欖油3ml/kg，共6周。在試驗(yàn)期間除正常組外，第1～2周各組均給予20％豬油加0.5％膽固醇的玉米粉飼料，第3～6周飼以普通飼料。各給藥組在造模開始時(shí)即同時(shí)灌胃給予相應(yīng)劑量的藥液，給藥體積1ml/100g，給藥時(shí)間共6周。各組用藥周期完成后，乙醚麻醉下剖腹，經(jīng)下腔門靜脈采血，分別檢測(cè)血清ALT、AST、Alb。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見7表7對(duì)肝纖維化模型大鼠血清生化指標(biāo)的影響

注與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過上述實(shí)驗(yàn)表明，本申請(qǐng)金銀花有機(jī)酸具有實(shí)際意義。
注金銀花有機(jī)酸與黃芩苷組合，金銀花有機(jī)酸與黃芩苷、魚腥草素鈉組合，金銀花有機(jī)酸與黃連素組合，金銀花有機(jī)酸與連翹苷組合等等組合在抗病毒、解熱、抗炎、抗氧化、保肝方面，也具有很好的藥理作用。
五.制備實(shí)施例實(shí)施例1取金銀花，加水回流提取4次，每次40分鐘，提取液濾過，合并濾液，濃縮，水溶液用鹽酸調(diào)pH值至4，再用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯用量分別為水相量的2.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；有機(jī)酸中綠原酸含量55％，3，5-二咖啡酰奎寧酸含量為20％，3，4-二咖啡?？鼘幩岷繛?0％，總含量為95％。
或取金銀花，用90％乙醇回流提取4次，每次40分鐘，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，水溶液用氯仿萃取4次，水相用鹽酸調(diào)pH值至4，再用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯用量分別為水相量的2.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸。有機(jī)酸中綠原酸含量55％，3，5-二咖啡?？鼘幩岷繛?0％，3，4-二咖啡酰奎寧酸含量為20％，總含量為95％。
金銀花有機(jī)酸與中藥有效部位或有效成分組合可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液體制劑、注射液和粉針劑中的一種。
實(shí)施例2取金銀花，加水回流提取2次，每次15分鐘，提取液濾過，合并濾液，濃縮，水溶液用鹽酸調(diào)pH值至1，再用乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯用量分別為水相量的0.5倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；有機(jī)酸中綠原酸含量20％，3，5-二咖啡酰奎寧酸含量為10％，3，4-二咖啡酰奎寧酸含量為20％，總含量為50％。
或取金銀花，用40％乙醇回流提取2次，每次15分鐘，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，水溶液用氯仿萃取2次，水相用鹽酸調(diào)pH值至1，再用乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯用量分別為水相量的0.5倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；有機(jī)酸中綠原酸含量20％，3，5-二咖啡?？鼘幩岷繛?0％，3，4-二咖啡酰奎寧酸含量為20％，總含量為50％。
金銀花有機(jī)酸與中藥有效部位或有效成分組合可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液體制劑、注射液和粉針劑中的一種。
實(shí)施例3
取金銀花，加水回流提取3次，每次30分鐘，提取液濾過，合并濾液，濃縮，水溶液用鹽酸調(diào)pH值至2，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量分別為水相量的1.5倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；有機(jī)酸中綠原酸含量47.5％，3，5-二咖啡酰奎寧酸含量為16.9％，3，4-二咖啡?？鼘幩岷繛?5.7％，總含量為80.1％。
或取金銀花，用60％乙醇回流提取3次，每次30分鐘，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，水溶液用氯仿萃取3次，水相用鹽酸調(diào)pH值至2，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量分別為水相量的1.5倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；有機(jī)酸中綠原酸含量43.2％，3，5-二咖啡酰奎寧酸含量為16.4％，3，4-二咖啡酰奎寧酸含量為14.9％，總含量為74.5％。
金銀花有機(jī)酸與中藥有效部位或有效成分組合可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液體制劑、注射液和粉針劑中的一種。
實(shí)施例4取金銀花，加水回流提取4次，每次35分鐘，提取液濾過，合并濾液，濃縮，水溶液用鹽酸調(diào)pH值至3，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量分別為水相量的2.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；有機(jī)酸中綠原酸含量53.8％，3，5-二咖啡酰奎寧酸含量為19.3％，3，4-二咖啡?？鼘幩岷繛?9.7％，總含量為92.8％。
或取金銀花，用85％乙醇回流提取3次，每次35分鐘，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，水溶液用氯仿萃取3次，水相用鹽酸調(diào)pH值至3，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量分別為水相量的2.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸。有機(jī)酸中綠原酸含量52.1％，3，5-二咖啡?？鼘幩岷繛?8.7％，3，4-二咖啡?？鼘幩岷繛?8.2％，總含量為89.0％。
金銀花有機(jī)酸與中藥有效部位或有效成分組合可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液體制劑、注射液和粉針劑中的一種。
實(shí)施例5取金銀花，加水回流提取2次，每次20分鐘，提取液濾過，合并濾液，濃縮，水溶液用鹽酸調(diào)pH值至1，再用乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯用量分別為水相量的1.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；有機(jī)酸中綠原酸含量32.5％，3，5-二咖啡?？鼘幩岷繛?4.7％，3，4-二咖啡?？鼘幩岷繛?.9％，總含量為55.1％。
或取金銀花，用45％乙醇回流提取2次，每次20分鐘，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，水溶液用氯仿萃取4次，水相用鹽酸調(diào)pH值至1，再用乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯用量分別為水相量的1.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；有機(jī)酸中綠原酸含量35.7％，3，5-二咖啡?？鼘幩岷繛?4.0％，3，4-二咖啡?？鼘幩岷繛?.1％，總含量為56.8％。
金銀花有機(jī)酸與中藥有效部位或有效成分組合可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液體制劑、注射液和粉針劑中的一種。
六.分析實(shí)施例實(shí)施例1金銀花藥材的檢測(cè)分析色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；梯度洗脫，流動(dòng)相變化為0-70分鐘時(shí)流動(dòng)相0.2％磷酸二氫鈉溶液∶乙腈體積比為94∶6-70∶30；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；流速為1.0ml/min；柱溫30℃；對(duì)照品溶液的配制精密稱定綠原酸對(duì)照品，置容量瓶中，加無水乙醇，超聲處理，再加水，超聲處理，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；
供試品溶液的配制精密稱取金銀花藥材粉碎過篩，加無水乙醇，超聲處理，再加水，超聲處理，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，即得；總有機(jī)酸的峰面積以下列公式計(jì)算A總＝A綠原酸+0.78A3，5-二咖啡?？鼘幩?0.93A3，4-二咖啡?？鼘幩?。
測(cè)定結(jié)果金銀花原藥材中有機(jī)酸含量為8.12％。
實(shí)施例2金銀花組分有效部位有機(jī)酸的檢測(cè)分析色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；梯度洗脫，流動(dòng)相變化為0-70分鐘時(shí)流動(dòng)相0.2％磷酸二氫鈉溶液∶乙腈體積比為94∶6-70∶30；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；流速為1.0ml/min；柱溫30℃；對(duì)照品溶液的配制精密稱定綠原酸對(duì)照品，置容量瓶中，加無水乙醇，超聲處理，再加水，超聲處理，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；供試品溶液的配制精密稱取樣品，加無水乙醇，超聲處理，再加水，超聲處理，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，即得；總有機(jī)酸的峰面積以下列公式計(jì)算A總＝A綠原酸+0.78A3，5-二咖啡?？鼘幩?0.93A3，4-二咖啡?？鼘幩?。
測(cè)定結(jié)果金銀花有機(jī)酸的含量為88.3％。
實(shí)施例3銀黃口服液的檢測(cè)分析(原料藥為金銀花、黃芩)色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；梯度洗脫，流動(dòng)相變化為0-70分鐘時(shí)流動(dòng)相0.2％磷酸二氫鈉溶液∶乙腈體積比為94∶6-70∶30；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；流速為1.0ml/min；柱溫30℃；對(duì)照品溶液的配制精密稱定綠原酸對(duì)照品，置容量瓶中，加無水乙醇，超聲處理，再加水，超聲處理，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；供試品溶液的配制精密稱取制劑，加無水乙醇，超聲處理，再加水，超聲處理，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，即得；總有機(jī)酸的峰面積以下列公式計(jì)算A總＝A綠原酸+0.78A3，5-二咖啡?？鼘幩?0.93A3，4-二咖啡?？鼘幩?。
測(cè)定結(jié)果每1ml含金銀花有機(jī)酸為5.2mg。
實(shí)施例4黃金魚片劑的檢測(cè)分析(原料藥為金銀花、黃芩、魚腥草素鈉)色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；梯度洗脫，流動(dòng)相變化為0-70分鐘時(shí)流動(dòng)相0.2％磷酸二氫鈉溶液∶乙腈體積比為94∶6-70∶30；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；流速為1.0ml/min；柱溫30℃；對(duì)照品溶液的配制精密稱定綠原酸對(duì)照品，置容量瓶中，加無水乙醇，超聲處理，再加水，超聲處理，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；供試品溶液的配制精密稱取制劑，加無水乙醇，超聲處理，再加水，超聲處理，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，即得；總有機(jī)酸的峰面積以下列公式計(jì)算A總＝A綠原酸+0.78A3，5-二咖啡?？鼘幩?0.93A3，4-二咖啡?？鼘幩?。
測(cè)定結(jié)果每片含金銀花有機(jī)酸為73.2mg。
注本發(fā)明所要求保護(hù)的具體技術(shù)方案，不限于上述實(shí)施例所表達(dá)的技術(shù)方案的具體組合。
權(quán)利要求
1.一種金銀花有機(jī)酸，其特征在于有機(jī)酸中綠原酸含量20％-55％，3，5-二咖啡酰奎寧酸含量為10％-20％，3，4-二咖啡?？鼘幩岷繛?％-20％，總含量以綠原酸、3，4-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩嵊?jì)大于等于50％且小于等于95％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金銀花有機(jī)酸，其制備方法為取金銀花，加水回流提取2-4次，每次15-40分鐘，提取液濾過，合并濾液，濃縮，水溶液用鹽酸調(diào)pH值至1-4，再用乙酸乙酯萃取1-4次，乙酸乙酯用量分別為水相量的0.5-2.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸；或取金銀花，用40％-90％乙醇回流提取2-4次，每次15-40分鐘，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，水溶液用氯仿萃取2-4次，水相用鹽酸調(diào)pH值至1-4，再用乙酸乙酯萃取1-4次，乙酸乙酯用量分別為水相量的0.5-2.0倍量，合并乙酸乙酯層，濃縮至浸膏狀，干燥，得到金銀花有機(jī)酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金銀花有機(jī)酸的檢測(cè)分析方法，包括金銀花藥材、含有金銀花的藥物制劑的高效液相色譜法檢測(cè)分析，其特征在于色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；梯度洗脫，流動(dòng)相變化為0-70分鐘時(shí)流動(dòng)相0.2％磷酸二氫鈉溶液∶乙腈體積比為94∶6-70∶30；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；流速1ml/min；對(duì)照品溶液的配制精密稱定綠原酸對(duì)照品，置容量瓶中，加無水乙醇，超聲處理，再加水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；供試品溶液的配制精密稱取樣品，加無水乙醇，超聲處理，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；或精密稱取金銀花藥材粉碎過篩，加無水乙醇，超聲處理，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，即得；總有機(jī)酸的峰面積以下列公式計(jì)算A總＝A綠原酸+0.78A3，5-二咖啡酰奎寧酸+0.93A3，4-二咖啡?？鼘幩?。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種金銀花有機(jī)酸作為藥物活性成分的藥物組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種金銀花有機(jī)酸作為藥物活性成分的藥物組合物，其藥物制劑形式選自片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液體制劑、注射液和粉針劑中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種金銀花有機(jī)酸作為藥物活性成分的藥物組合物在制備抑菌抗病毒、解熱、抗炎、抗氧化、保肝藥物方面中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金銀花有機(jī)酸及其制備方法和檢測(cè)分析方法，其特征在于有機(jī)酸中綠原酸含量20％－55％，3，5－二咖啡?？鼘幩岷繛?0％－20％，3，4－二咖啡?？鼘幩岷繛?％－20％，總含量以綠原酸、3，4－二咖啡?？鼘幩?、3，5－二咖啡?？鼘幩嵊?jì)大于等于50％且小于等于95％；有機(jī)酸采用水提、調(diào)pH值、乙酸乙酯萃取的方法得到，該工藝方法簡(jiǎn)單可行，適于工業(yè)化生產(chǎn)；有機(jī)酸采用綠原酸為標(biāo)準(zhǔn)品，異綠原酸以綠原酸為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正的方法進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，該分析方法易于操作，減少了操作步驟，降低了標(biāo)準(zhǔn)品的使用量。
文檔編號(hào)A61P39/06GK101019912SQ20071008655
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日
發(fā)明者顧群, 李志剛, 米長(zhǎng)江, 李桂芹, 阮愛華 申請(qǐng)人:北京本草天源藥物研究院