乳品真蛋白的sds-page檢測方法及其鑒定圖譜庫的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法及其鑒定圖譜庫。所述檢測方法是將預處理待檢樣品后，以不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，并以UVP凝膠成像儀攝像結(jié)合Labwork軟件進行分析，將泳道的蛋白質(zhì)斑點密度與樣品中真蛋白濃度關聯(lián)，并對照標準曲線從而計算蛋白含量本發(fā)明所述的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法可以快速靈敏便捷地檢測處乳品中真蛋白的組成及其含量，且過程中處理所得樣品可直接用于乳品中總蛋白的含量測定。真正實現(xiàn)一次測量得到目標結(jié)果。同時采用上述方法建立了乳品真蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜庫?？捎糜诖郎y乳品的SDS-PAGE比對，以便直接進行判定與評價。具備非常好的應用前景。
【專利說明】乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法及其鑒定圖譜庫
【技術領域】
[0001]本發(fā)明應用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測技術，建立乳品中真蛋白組份和含量的準確檢測方法，同時建立乳品蛋白SDS-PAGE鑒定圖譜庫。
【背景技術】
[0002]乳品質(zhì)量問題是關系到國計民生的大事。2008年我國發(fā)生“三聚氰胺毒奶粉事件”，嚴重威脅人民健康生命，中國奶業(yè)遭遇最深刻的行業(yè)重創(chuàng)以及最嚴重的信任危機，一些地方名牌和全國名牌也上了 “黑名單”。2011年，“皮革水解蛋白”奶粉卷土重來，“皮革奶”的消息又讓人談奶色變。目前，我國乳制品的突出問題是摻假，不法商人受成本及利益的驅(qū)動，利用乳品蛋白檢測技術和標準的缺失或局限等原因，除了將化工原料“三聚氰胺”摻入乳品中獲取暴利，更在食品中摻入普通方法不易檢測出的非乳品蛋白成份。 [0003]目前常規(guī)蛋白 質(zhì)檢驗方法，不能確切反映乳品蛋白質(zhì)的含量、來源和組成，對于在乳中摻入廉價的水解蛋白或在牛乳中摻入其他動物乳等新的摻假方式，傳統(tǒng)的檢測方法難以檢出?，F(xiàn)行的乳品摻假檢驗研究，大多針對某假定的單一物質(zhì)進行定性定量，要實現(xiàn)多個摻假物的檢測操作繁瑣，尤其是對乳品中可能出現(xiàn)的未知物難以評判。我國乳品檢測急需建立適應新?lián)郊偾闆r的快速、準確的檢測方法，找到直接測定真蛋白質(zhì)含量的可靠方法，這是徹底堵住假蛋白摻假的唯一手段。因此，迫切需要建立便捷靈敏的檢測方法，來有效鑒別食品中真蛋白的含量，進而堵住了市場監(jiān)管上的漏洞，使偽劣產(chǎn)品無所遁形。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種快速靈敏的乳品真蛋白含量及檢測乳品中蛋白質(zhì)組分和含量SDS-PAGE檢測方法。同時建立各進口和國產(chǎn)乳品品牌蛋白質(zhì)組分及含量分析的SDS-PAGE電泳圖譜庫。
[0005]本發(fā)明所述的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法，包括如下步驟:
[0006]①預處理待檢樣品，制備測試樣品，所述待檢樣品包括待檢乳粉樣品、待檢乳清粉樣品和待檢含乳飲料樣品；
[0007]②向步驟I制備的測試樣品中按照Img:20μ L的比例加入濃度為50mmol/L的Tris-HCL緩沖液,振動混合5min, 100°C水浴5min, 10000r/min離心5min,以上清液進行后續(xù)檢測；所述的Tris-HCL緩沖液的pH值6.8，其還含0.05kg/L SDS,0.lkg/?β-巰基乙醇，體積百分含量為20%的甘油以及0.002kg/L溴酚蘭；
[0008]③采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行樣品分析，上樣量為30 μ L，25mA恒流電泳5h ;然后取出膠片并用2.5%的考馬斯亮蘭染色4h，繼而使用甲醇-冰醋酸按照體積比30:10混合而成的脫色液脫色至透明；
[0009]④脫色后的電泳膠片置于UVP凝膠成像儀攝像，采用Labwork軟件，分析記錄每泳道的蛋白質(zhì)斑點密度，對照標準曲線I計算蛋白含量；所述標準曲線I由標準蛋白的含量對以相同方法獲得的蛋白斑點密度作圖所得。[0010]本發(fā)明的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法中所述的不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)選濃縮膠濃度為4%，分析膠濃度為12.5%。
[0011]本發(fā)明的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法中所述的待檢乳粉樣品的預處理方法是:取Ig待檢乳粉樣品加入至10mL60°C蒸餾水中，溶解后加入濃度為0.6mol/L的三氯乙酸水溶液ImL,振動混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min離心5min ;傾去醚層和水層，以濃度為50mmol/L、pH值為8.0的Tris-HCI溶液洗滌沉淀物洗滌3次，真空干燥成粉，即得測試樣品。
[0012]本發(fā)明的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法中所述的待檢乳清粉樣品的預處理方法是:取Ig待檢乳清粉樣品加入至IOmL蒸餾水中，溶解后過0.45 μ針頭式過濾，濾液真空干燥成粉，即得測試樣品。
[0013]本發(fā)明的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法中所述的含乳飲料樣品的預處理方法是:取標識蛋白質(zhì)含量< 2.9%的待檢含乳飲料樣品500 μ L或者標識蛋白質(zhì)含量> 2.9%的待檢含乳飲料樣品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮過夜，10000r/min離心15min，沉淀以體積濃度為80%的_20°C冷丙酮洗滌3次，真空干燥成粉即得測試樣品。
[0014]本發(fā)明的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法中，步驟④所述的標準蛋白是α _乳白蛋白和β-乳球蛋白。當然，還可以包括但不限于a sl-CN、a s2_CN、β-CN等酪蛋白。
[0015]本發(fā)明的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法中，還可以包括蛋白質(zhì)總含量的檢測步驟:向步驟①所或得的測試樣品中加入ImL濃度為lmol/L的NaOH溶液，溶解后吸取20 μ L樣品,加入6mL雙縮脲試劑,反應30min后，以蒸懼水做空白，在540nm波長下測定吸光值，并對照標準曲線II計算含量；所述標準曲線II的制備方法是:配制lmg/mL牛血清蛋白溶液，取O，10，20，40，60，80 μ L，分別加入6mL雙縮脲試劑，反應30min后，以蒸餾水為空白，測定540nm處吸光值，以濃度關聯(lián)吸光值作圖得標準曲線。
[0016]另一方面，本發(fā)明基于上述方法建立了乳品真蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜庫，所述圖譜庫具體通過下述方法建立:
[0017]①采集有效量的乳品樣本，所述樣本包括足夠數(shù)量的乳粉樣品、乳清粉樣品和待檢含乳飲料樣品；
[0018]②預處理所選擇的乳品樣本，制備測試樣品:
[0019]所述的待檢乳粉樣品的預處理方法是:取Ig待檢乳粉樣品加入至10mL60°C蒸餾水中，溶解后加入濃度為0.6mol/L的三氯乙酸水溶液ImL,振動混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min離心5min ;傾去醚層和水層，以濃度為50mmol/L、pH值為8.0的Tris-HCI溶液洗滌沉淀物洗滌3次，真空干燥成粉，即得測試樣品；
[0020]所述的待檢乳清粉樣品的預處理方法是:取Ig待檢乳清粉樣品加入至IOmL蒸餾水中，溶解后過0.45 μ針頭式過濾，濾液真空干燥成粉，即得測試樣品；
[0021]所述的待檢含乳飲料樣品的預處理方法是:取標識蛋白質(zhì)含量< 2.9%的待檢含乳飲料樣品500 μ L或者標識蛋白質(zhì)含量≤2.9%的待檢含乳飲料樣品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮過夜，10000r/min離心15min，沉淀以體積濃度為80%的_20°C冷丙酮洗滌3次，真空干燥成粉即得測試樣品；
[0022]③向步驟②制備的測試樣品中按照Img:20μ L的比例加入濃度為50mmol/L的Tris-HCL緩沖液,振動混合5min, 100°C水浴5min, 10000r/min離心5min,以上清液進行后續(xù)檢測；所述的Tris-HCL緩沖液的pH值6.8，其還含0.05kg/L SDS,0.lkg/?β-巰基乙醇，體積百分含量為20%的甘油以及0.002kg/L溴酚蘭；
[0023]④采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行樣品分析，上樣量為30 μ L，25mA恒流電泳5h ;然后取出膠片并用2.5%的考馬斯亮蘭染色4h，繼而使用甲醇-冰醋酸按照體積比30:10混合而成的脫色液脫色至透明；
[0024]⑤脫色后的電泳膠片置于UVP凝膠成像儀攝像，采集所有樣品的SDS-PAGE電泳圖譜入庫，建立乳品真蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜庫。
[0025]本發(fā)明所述的乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法可以快速靈敏便捷地檢測處乳品中真蛋白的組成及其含量，且過程中處理所得樣品可直接用于乳品中總蛋白的含量測定。真正實現(xiàn)一次測量得到目標結(jié)果。本發(fā)明所建立的乳品真蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜庫，可以直接將待測乳品樣品的SDS-PAGE圖譜與電泳圖譜庫中該品牌的電泳圖譜進行比對，直接進行該品牌乳品質(zhì)量的判定與評價。如果樣品本身質(zhì)量優(yōu)良，那就不必進一步進行假蛋白篩查；如果真蛋白檢測指標有可疑，產(chǎn)品可能有摻假，就要進行摻假檢測。因此具備非常好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]本發(fā)明附圖5幅，分別是:
[0027]圖1是實施例1的各種乳品蛋白質(zhì)組成的SDS-PAGE分析結(jié)果；其中，1、全脂乳粉；
2、乳清粉；3、β -乳球蛋白；4、α -乳白蛋白；5、含乳飲料i ;6、含乳飲料ii。
[0028]圖2是實施例2的β -LG、α -LA標準樣品和含乳飲料的SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0029]圖3是實施例3乳品蛋白SDS-PAGE鑒定圖譜庫1_10號建庫樣品的SDS-PAGE圖
[0030]圖4是實施例3乳品蛋白SDS-PAGE鑒定圖譜庫11_18號建庫樣品的SDS-PAGE圖 [0031]圖5是實施例3乳品蛋白SDS-PAGE鑒定圖譜庫19-22號建庫樣品的SDS-PAGE圖
【具體實施方式】
[0032]下面為本發(fā)明的具體實施例，其對本方法的建立及其應用作進一步的說明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0033]若無特殊說明，`本部分所使用的主要試劑、儀器及其商品來源如上述方法。
[0034]如無特殊說明，本發(fā)明中所使用的試劑包括:標準品α-乳白蛋白(a-LA)、i3-乳球蛋白(β-LG)，低分子量標準蛋白(15.5-97ku)，大連寶生物工程公司；大豆蛋白粉、明膠、乳清粉分析純，北京鼎國生物技術有限責任公司；酪蛋白(CN)優(yōu)級純，美國sigma公司；丙烯酰胺(Acr)優(yōu)級純，美國Amresc0公司；Tris，西安西京制藥廠；N_N甲叉雙丙烯酰胺(Bis)優(yōu)級純，美國Arnresco公司；TEMED，上海前進化學試劑廠；十二烷基硫酸鈉(SDS)優(yōu)級純，USB公司；過硫酸銨(Ap)分析純，北京化學試劑廠；四甲基乙二胺(TEMED)優(yōu)級純，北京化學試劑廠；巰基乙醇，天津市登峰化學試劑廠；BCA優(yōu)級純，美國sigma公司；碳酸鈉、酒石酸二鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、硫酸銅、乙酸、過硫酸銨、甘油、溴酚藍、甘氨酸、鹽酸、甲酸等均為分析純。
[0035] 儀器包括:SDS—PAGE電泳儀；電泳槽HoeferminiVE型，美國AmershamBiosciences (SF)Corp ；電泳儀BG.Power600型，北京百晶生物技術有限公司；捷達圖像分析系統(tǒng)JD ;高速冷凍離心機；727分柵分光光度計，上海精密科學有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；DYCZ-24D型垂直板電泳槽,北京市六一儀器廠。
[0036]本發(fā)明中所有的樣品，均采用下述方法進行檢測前的預處理:
[0037]待檢乳粉樣品的預處理:取Ig待檢乳粉樣品加入至10mL60°C蒸餾水中，溶解后加入濃度為0.6mol/L的三氯乙酸水溶液ImL,振動混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min離心5min ;傾去醚層和水層，以濃度為50mmol/L、pH值為8.0的Tris-HCI溶液洗滌沉淀物洗滌3次，真空干燥成粉，即得測試樣品。
[0038]待檢乳清粉樣品的預處理:取Ig待檢乳清粉樣品加入至IOmL蒸餾水中，溶解后過
0.45 μ針頭式過濾，濾液真空干燥成粉，即得測試樣品。
[0039]待檢含乳飲料樣品的預處理:取標識蛋白質(zhì)含量< 2.9%的待檢含乳飲料樣品500 μ L或者標識蛋白質(zhì)含量≥2.9%的待檢含乳飲料樣品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮過夜，10000r/min離心15min，沉淀以體積濃度為80%的_20°C冷丙酮洗滌3次，真空干燥成粉即得測試樣品。
[0040]以預處理所得的待測樣品進行以下實施例的試驗。
[0041]實施例中述及的蛋白質(zhì)含量測定是指雙縮脲比色法:向測試樣品中加入ImL濃度為lmol/L的NaOH溶液，溶解后吸取20 μ L樣品，加入6mL雙縮脲試劑，反應30min后，以蒸餾水做空白，在540nm波長下測定吸光值，并對照標準曲線II計算含量；所述標準曲線II的制備方法是:配制lmg/mL牛血清蛋白溶液，取0，10，20，40，60，80 μ L，分別加入6mL雙縮脲試劑，反應30min后，以蒸餾水為空白，測定540nm處吸光值，以濃度關聯(lián)吸光值作圖得標準曲線。
[0042]實施例中述及的SDS-PAGE分析方法是指:向所制備的測試樣品中按照Img:20 μ L的比例加入濃度為50mmol/L的Tris-HCL緩沖液，振動混合5min，100°C水浴5min，10000r/min離心5min,以上清液進行后續(xù)檢測；所述的Tris-HCL緩沖液的pH值6.8,其還含0.05kg/L SDS，0.lkg/L β -巰基乙醇，體積百分含量為20%的甘油以及0.002kg/L溴酚蘭；
[0043]進而，采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠濃度為4%，分析膠濃度為12.5%)進行樣品分析，上樣量為30 μ L，25mA恒流電泳5h ;然后取出膠片并用2.5%的考馬斯亮蘭染色4h，繼而使用甲醇-冰醋酸按照體積比30:10混合而成的脫色液脫色至透明；脫色后的電泳膠片置于UVP凝膠成像儀攝像，采用Labwork軟件，分析記錄每泳道的蛋白質(zhì)斑點密度，對照標準曲線I計算蛋白含量；所述標準曲線I由標準蛋白的含量對以相同方法獲得的蛋白斑點密度作圖所得。所述標準蛋白包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、a S1-酪蛋白(a sl-CN)、a s2_酪蛋白(a S2_CN)以及β-酪蛋白(β-CN)。
[0044]實施例1、全脂乳粉、乳清粉和含乳飲料各蛋白組分的相對含量
[0045]選擇市面上常見的全脂乳粉、乳清粉和含乳飲料作為測試對象，分析了 20種全脂乳粉中的蛋白組成(圖1)。根據(jù)標準分析量外推，測定出全脂乳粉中a sl-CN、as2-CN、β -CN等 3 種酪蛋白的含量比例分別為(34.4±1.64)%，(8.35 ±0.25)%和(38.50 ±2.32)%，α-乳白蛋白和乳球蛋白的含量比例為(9.57±0.54)%，(1.33±0.37)%;[0046]檢測的乳清粉(WPI)中的各蛋白組成(圖1中2)，WPI中牛血清白蛋白(BSA)、a s2_CN、a sl-CN, β -CN、β -LG 和 α -LA 的相對含量依次分別為(3.542±0.105)%、(18.532 + 1.203)%, (6.303 ± 2.4) %、(22.513 + 2.77)%, (33.848 + 0.32)% 和(12.446±0.158)%ο
[0047]檢測的含乳飲料中的a S2-CN、a sl-CN, β -CN、β -LG和α -LA的相對含量依次分另Ij 為(25.051 ± 1.204)%，(15.939± 1.092)%，(25.524±0.457)%，(12.595±0.768)%，(3.9463±0.431)%。其中β -LG和α -LA的相對含量明顯高于全脂乳粉中兩者的相對含量，說明含乳飲料A加入了乳清蛋白。因此，利用本方法可快速測定出含乳飲料的蛋白質(zhì)的組成、相對含量和來源。
[0048]實施例2、含乳飲料B各蛋白組分的絕對含量
[0049]為了準確測定含乳飲料中α -LA和β -LG的絕對含量，本發(fā)明利用SDS-PAGE電泳結(jié)合凝膠成像分析建立了標準曲線。α-LA和β-LG標準品分別以10mg/mL濃度溶于緩沖液，上樣量分別為5，10，15，20 μ L，分別含蛋白質(zhì)50，100，150，200 μ g，進行電泳，結(jié)果如圖2所。電泳膠片置于UVP凝膠成像儀分析，獲得各蛋白質(zhì)斑點密度，與a-LA和β-LG的相對含量、絕對含量關聯(lián)。以標準蛋白的絕對含量對蛋白斑點密度作圖得出相應的標準曲線。
[0050]根據(jù)檢測所得的含乳飲料B中β-LG和a-LA在電泳膠片上的蛋白質(zhì)斑點密度，在上述標準曲線中查出其絕對含量，經(jīng)過換算得出該含乳飲料中β-LG的絕對含量為
0.5434mg/mL ； a -LA的絕對含量為0.09mg/mL。本文根據(jù)雙縮脲比色法計算出該含乳飲料的蛋白質(zhì)含量為8.075mg/mL。由此可知含乳飲料B中β-LG占總?cè)榈鞍?.6% ； a -LA占總?cè)榈鞍椎?.1%。與全脂乳粉中兩者的相對含量相當，說明含乳飲料B未加入乳清粉。本文中，a-LA的測值偏低，可能與該蛋白很難被丙酮沉淀有關。a-LA是乳清蛋白中熱穩(wěn)定性最強的一種，具有極聞的未水性。
[0051]實施例3、乳品品牌蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜庫
[0052]本實施例廣泛收集市售奶粉和液態(tài)奶，編號為I?22 (僅為部分結(jié)果示例)。采用本發(fā)明的SDS-PAGE方法檢測真蛋白質(zhì)組分和含量，建立乳品品牌蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜庫。如附圖3-5所示。
【權利要求】
1.乳品真蛋白的SDS-PAGE檢測方法，包括如下步驟: ①預處理待檢樣品，制備測試樣品，所述待檢樣品包括待檢乳粉樣品、待檢乳清粉樣品和待檢含乳飲料樣品； ②向步驟I制備的測試樣品中按照Img:20μ L的比例加入濃度為50mmol/L的Tris-HCL緩沖液,振動混合5min, 100°C水浴5min, 10000r/min離心5min,以上清液進行后續(xù)檢測；所述的Tris-HCL緩沖液的pH值6.8，其還含0.05kg/L SDS,0.lkg/?β-巰基乙醇，體積百分含量為20%的甘油以及0.002kg/L溴酚蘭； ③采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行樣品分析，上樣量為30μ L，25mA恒流電泳5h ；然后取出膠片并用2.5%的考馬斯亮蘭染色4h，繼而使用甲醇-冰醋酸按照體積比30:10混合而成的脫色液脫色至透明； ④脫色后的電泳膠片置于UVP凝膠成像儀攝像，采用Labwork軟件，分析記錄每泳道的蛋白質(zhì)斑點密度，對照標準曲線I計算蛋白含量；所述標準曲線I由標準蛋白的含量對以相同方法獲得的蛋白斑點密度作圖所得。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠濃度為4%，分析膠濃度為12.5%。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的待檢乳粉樣品的預處理方法是:取Ig待檢乳粉樣品加入至10mL60°C蒸餾水中，溶解后加入濃度為0.6mol/L的三氯乙酸水溶液ImL,振動混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min離心5min ;傾去醚層和水層，以濃度為50mmol/L、pH值為8.0的Tris-HCI溶液洗滌沉淀物洗滌3次，真空干燥成粉，即得測試樣品。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的待`檢乳清粉樣品的預處理方法是:取Ig待檢乳清粉樣品加入至IOmL蒸餾水中，溶解后過0.45 μ針頭式過濾，濾液真空干燥成粉，即得測試樣品。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的待檢含乳飲料樣品的預處理方法是:取標識蛋白質(zhì)含量< 2.9%的待檢含乳飲料樣品500 μ L或者標識蛋白質(zhì)含量> 2.9%的待檢含乳飲料樣品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮過夜，10000r/min離心15min，沉淀以體積濃度為80%的_20°C冷丙酮洗滌3次，真空干燥成粉即得測試樣品。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟④的標準蛋白是α-乳白蛋白和β -乳球蛋白。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法中還包括蛋白質(zhì)總含量的檢測步驟:向步驟①所或得的測試樣品中加入ImL濃度為lmol/L的NaOH溶液，溶解后吸取20 μ L樣品,加入6mL雙縮脲試劑,反應30min后，以蒸懼水做空白，在540nm波長下測定吸光值，并對照標準曲線II計算含量； 所述標準曲線II的制備方法是:配制lmg/mL牛血清蛋白溶液，取0，10，20，40，60，80 μ L，分別加入6mL雙縮脲試劑，反應30min后，以蒸餾水為空白，測定540nm處吸光值，以濃度關聯(lián)吸光值作圖得標準曲線。
8.乳品真蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜庫，其特征在于通過下述方法建立: ①采集有效量的乳品樣本，所述樣本包括足夠數(shù)量的乳粉樣品、乳清粉樣品和待檢含乳飲料樣品；②預處理所選擇的乳品樣本，制備測試樣品: 所述的待檢乳粉樣品的預處理方法是:取1g待檢乳粉樣品加入至10mL60°C蒸餾水中，溶解后加入濃度為0.6mol/L的三氯乙酸水溶液lmL，振動混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min離心5min ;傾去醚層和水層，以濃度為50mmol/L、pH值為8.0的Tris-HCI溶液洗滌沉淀物洗滌3次，真空干燥成粉，即得測試樣品； 所述的待檢乳清粉樣品的預處理方法是:取Ig待檢乳清粉樣品加入至IOmL蒸餾水中，溶解后過0.45 μ針頭式過濾，濾液真空干燥成粉，即得測試樣品； 所述的待檢含乳飲料樣品的預處理方法是:取標識蛋白質(zhì)含量< 2.9%的待檢含乳飲料樣品500 μ L或者標識蛋白質(zhì)含量≥2.9%的待檢含乳飲料樣品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮過夜，10000r/min離心15min，沉淀以體積濃度為80%的_20°C冷丙酮洗滌3次，真空干燥成粉即得測試樣品； ③向步驟②制備的測試樣品中按照1mg: 20 μ L的比例加入濃度為50mmo l/L的Tris-HCL緩沖液,振動混合5min, 100°C水浴5min, 10000r/min離心5min,以上清液進行后續(xù)檢測；所述的Tris-HCL緩沖液的pH值6.8，其還含0.05kg/1 SDS,0.lkg/Lβ-巰基乙醇，體積百分含量為20%的甘油以及0.002kg/L溴酚蘭； ④采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行樣品分析，上樣量為30μ L，25mA恒流電泳5h ；然后取出膠片并用2.5%的考馬斯亮蘭染色4h，繼而使用甲醇-冰醋酸按照體積比30:10混合而成的脫色液脫色至透明； ⑤脫色后的電泳膠片置于UVP凝膠成像儀攝像，采集所有樣品的SDS-PAGE電泳圖譜入庫，建立乳品真蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜庫。
【文檔編號】G01N27/447GK103616429SQ201310670755
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權日:2013年12月11日
【發(fā)明者】鄭秋月, 曹際娟, 徐君怡, 徐楊 申請人:鄭秋月, 曹際娟, 徐君怡, 徐楊