單頭煙蚜cmv、pvy帶毒檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，本發(fā)明主要采用試劑及材料有CMV、PVY一抗，對應酶標二抗，樣品稀釋液，洗滌液，顯色液，本發(fā)明的檢測板為煙蚜所攜帶CMV、PVY病毒蛋白抗原包被的硝酸纖維素膜（NCM），酶結合物工作液為CMV、PVY一抗（羊抗兔）及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體。本發(fā)明將單頭煙蚜通過一系列處理，利用抗原抗體反應基本原理，便可即時檢測煙蚜帶毒與否。本發(fā)明有益的積極效果是：特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測成本低，適合于田間大規(guī)模推廣應用，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其是一種單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法。
【背景技術】
[0002]煙姆(妙沿/5.persicae (Sulzer))是煙草的重要害蟲,在我國大部分煙區(qū)都有其為害，也是貴州煙區(qū)的主要蟲害。煙蚜不但刺吸危害煙草，還傳播黃瓜花葉病毒(CMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)，為害癥狀表現(xiàn)為花葉、矮化和褪綠等，發(fā)病流行速度極快，煙草生長發(fā)育停滯，嚴重減產(chǎn)，對煙草產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。
[0003]黃瓜花葉病毒病(Cucumber mosaic virus, CMV),雀麥花葉病毒科CSroffiOFirit/ae)黃瓜花葉病毒屬(Ci/cawoFirw1S)典型成員，于1961年被Doolittle首次發(fā)現(xiàn)，是寄主范圍最多、分布最廣、最具經(jīng)濟重要性的植物病毒之一；馬鈴薯Y病毒病(Potatovirus Y, PVY)馬鈴薯 Y 病毒(/biaio virus Y, PVY),馬鈴薯 Y 病毒科馬鈴薯Y病毒屬)(李凡等，2001)的典型成員。最早由K.M.Smith于1931年在馬鈴薯上首次發(fā)現(xiàn)。是危害煙草生產(chǎn)最重要的兩種世界性病害，在中國、日本和德國等地均有報道。為害癥狀表現(xiàn)為花葉、皺縮、褪緑、斑駁和壞死等，發(fā)病流行速度極快，生長發(fā)育停滯，嚴重減產(chǎn)，對煙草的質量造成嚴重的損失。
[0004]煙姆傳播CMV、PVY屬于非持久性傳播,病毒存在于煙姆體內(nèi)時間短、病毒量少，因此，其檢測方法在田間應用中具有重要影響。目前，國內(nèi)外對于煙蚜攜帶CMV、PVY檢測方法建立的研究較少，病毒檢測所用酶聯(lián)免疫吸附試驗等血清學檢測方法，具有一定局限性，不能有效進行檢測，很難大面積應用推廣。國內(nèi)外所建立的CMV、PVY的PCR診斷方法由于檢測成本過高，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上無法大規(guī)模應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是:提供一種單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，它可即時檢測煙蚜帶毒與否，并且特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測成本低，以克服現(xiàn)有技術的不足。
[0006]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，將單頭蟲體進行充分研磨、離心，取上清液在硝酸纖維素膜上進行點樣包被抗原，再經(jīng)封閉、抗體反應和染色進行抗原檢測。
[0007]取上清液在硝酸纖維素膜上進行點樣包被抗原，再經(jīng)封閉、抗體反應和染色進行抗原檢測的具體步驟如下:
I)取上清液加樣于硝酸纖維素膜，室溫晾干，重復點樣3次。
[0008]2)將點樣的硝酸纖維素膜浸入質量百分比為5%的脫脂奶粉封閉緩沖液中，在37°C 下封閉 60min ；
3)將封閉后的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min;加入待檢測病毒多抗抗體溶液，抗體與PBS緩沖液按1:200的體積比混合，在37°C下孵育1.5h ；
4)將經(jīng)過抗體反應的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min;將硝酸纖維素膜浸入辣根過氧化物酶標記的二抗的抗體溶液，抗體與PBS緩沖液按1:2500的體積比混合，在37°C下孵育1.5h ；
5)將經(jīng)二抗反應的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min ;將硝酸纖維素膜浸入顯色溶液，在37°C下顏色反應30min，自來水沖洗膜，晾干拍照保存；
所有操作均在震蕩條件下進行。
[0009]所述的緩沖液中按質量百分比計算，包含KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.12H20 0.29%，NaCl 0.8%, KCl 0.02%，其余為 ddH20, pH 為 7.4。
[0010]所述的洗滌液中按質量百分比計算，包含KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.12H20 0.29%，NaCl 0.8%, KCl 0.02%其余為ddH20，每IOOOml上述混合液中加入加入質量百分比為0.05%的 Tween-20 0.5mL，pH 為 7.4。
[0011]所述的顯色液為4-氯-1-萘酚6mg，無水乙醇2mL，PBS 10mL，加質量百分比為30% 的 H2O2 7 μ L。
[0012]所述的酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體。
[0013]由于采用了上述技術方案，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明將單頭煙蚜通過一系列處理，利用抗原抗體反應基本原理，便可即時檢測煙蚜帶毒與否，本發(fā)明特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測成本低，適合于田間大規(guī)模推廣應用，具有廣闊的應用前景。。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1單頭煙蚜CMV帶毒檢測；
CK，對照；顯色帶病毒樣品；無病毒樣品；
圖2單頭煙蚜PVY帶毒檢測；
CK，對照；顯色帶病毒樣品；無病毒樣品。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明的實施例:單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，
1)將單頭蟲體放入加入50μ I碳酸鹽緩沖液的0.2mL PCR管，用牙簽搗碎，8000r/min離心3min ；
2)取上清液3μ I加樣于硝酸纖維素膜，室溫晾干，重復點樣3次，
3)將點樣的硝酸纖維素膜浸入質量百分比為5%的脫脂奶粉封閉緩沖液中，在37°C下封閉60min ；
4)將封閉后的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min;加入待檢測病毒多抗抗體溶液，抗體與PBS緩沖液按1:200的體積比混合，在37°C下孵育1.5h ；
5)將經(jīng)抗體反應的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min;將硝酸纖維素膜浸入辣根過氧化物酶標記的二抗抗體溶液，抗體與PBS緩沖液按1:2500的體積比混合，在37°C下孵育1.5h ；
6)將經(jīng)二抗反應的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min;將硝酸纖維素膜浸入顯色溶液，在37°C下顏色反應30min，自來水沖洗膜，晾干拍照保存；
所有操作均在震蕩條件下進行。
[0016]所述的緩沖液中按質量百分比計算，包含KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.12H20 0.29%，NaCl 0.8%, KCl 0.02%，其余為 ddH20, pH 為 7.4。
[0017]所述的洗滌液中按質量百分比計算，包含KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.12H20 0.29%，NaCl 0.8%, KCl 0.02%其余為ddH20，每IOOOml上述混合液中加入加入質量百分比為0.05%的 Tween-20 0.5mL，pH 為 7.4。
[0018]所述的顯色液為4-氯-1-萘酚6mg，無水乙醇2mL，PBS 10mL，加質量百分比為30% 的 H2O2 7 μ L。
[0019]所述的酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體。
[0020]利用本發(fā)明進行單頭煙蚜CMV帶毒檢測的結構如圖1所示；利用本發(fā)明進行單頭煙蚜PVY帶毒檢測的結構如圖2所示。
[0021]結果表明，本發(fā)明可快速、準確的檢測出煙蚜帶毒與否。
【權利要求】
1.一種單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，其特征在于:將單頭蟲體進行充分研磨、離心，取上清液在硝酸纖維素膜上進行點樣包被抗原，再經(jīng)封閉、抗體反應和染色進行抗原檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，其特征在于:取上清液在硝酸纖維素膜上進行點樣包被抗原，再經(jīng)封閉、抗體反應和染色進行抗原檢測的具體步驟如下: 1)取上清液加樣于硝酸纖維素膜，室溫晾干，重復點樣3次； 2)將點樣的硝酸纖維素膜浸入質量百分比為5%的脫脂奶粉封閉緩沖液中，在37°C下封閉60min ； 3)將封閉后的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min;加入待檢測病毒多抗抗體溶液，抗體與PBS緩沖液按1:200的體積比混合，在37°C下孵育1.5h ； 4)將經(jīng)過抗體反應的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min;將硝酸纖維素膜浸入辣根過氧化物酶標記的二抗的抗體溶液，抗體與PBS緩沖液按1:2500的體積比混合，在37°C下孵育1.5h ； 5)將經(jīng)二抗反應的硝酸纖維素膜用洗滌液洗滌3次，每次3min;將硝酸纖維素膜浸入顯色溶液，在37°C下顏色反應30min，自來水沖洗膜，晾干拍照保存； 所有操作均在震蕩條件下進行。
3.根據(jù)權利要求2所述的單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，其特征在于:所述的緩沖液中按質量百分比計算，包含 KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.Iffi2O 0.29%, NaCl 0.8%, KCl 0.02%,其余為ddH20，pH為7.4。
4.根據(jù)權利要求2所述的單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，其特征在于:所述的洗滌液中按質量百分比計算，包含 KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.Iffi2O 0.29%, NaCl 0.8%, KCl 0.02%其余為ddH20，每IOOOml上述混合液中加入加入質量百分比為0.05%的Tween-20 0.5mL，pH 為 7.4。
5.根據(jù)權利要求2所述的單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，其特征在于:所述的顯色液為4-氯-1-萘酚6mg，無水乙醇2mL，PBS 10mL，加質量百分比為30%的H2O2 7 μ L。
6.根據(jù)權利要求2所述的單頭煙蚜CMV、PVY帶毒檢測方法，其特征在于:所述的酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體。
【文檔編號】G01N33/543GK103645309SQ201310684361
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權日:2013年12月16日
【發(fā)明者】張福莉, 劉磊磊, 劉童童 申請人:貴州大學