以硝基苯并咪唑為rna識別基團的熒光染料、其制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料、其制備方法及應用，以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料具有通式I的結(jié)構(gòu)，其中D是染料發(fā)色基團，所述D的母體選自萘酰亞胺類染料、菁染料、羅丹明染料、熒光素染料、蒽吡啶酮類染料或苝酰亞胺類染料。本發(fā)明還提供了所述以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料在生物樣品中特異性RNA標記的應用。本發(fā)明熒光材料對RNA具有高效專一的識別能力，同時還具有高效的雙光子吸收能力，并且具有較低的光致毒性、生物毒性和光漂白性。
【專利說明】以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料、其制備方法及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熒光染料技術(shù)，尤其涉及一種以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料、其制備方法及應用。
【背景技術(shù)】
[0002]核糖核酸(即Ribonucleic acid，縮寫為RNA)是一種重要的生物大分子，因為分子由核糖核苷酸組成而得名。每個RNA分子都由核苷酸單元長鏈組成，每個核苷酸單元含有一個含氮堿基、一個核糖和一個磷酸基。RNA是具有細胞結(jié)構(gòu)的生物的遺傳訊息中間載體，并參與蛋白質(zhì)合成；還參與基因表達調(diào)控。對一部分病毒而言，RNA是其唯一的遺傳物質(zhì)。RNA存在于一切細胞的細胞質(zhì)和細胞核中，也存在于大多數(shù)已知的植物病毒和部分動物病毒以及一些曬菌體中。
[0003]RNA是由核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種:A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了 DNA中的T胸腺嘧啶而成為RNA的特征堿基。與DNA不同，RNA —般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，但是很多RNA也需要通過堿基配對原則形成一定的二級結(jié)構(gòu)乃至三級結(jié)構(gòu)來行使生物學功能。
[0004]隨著分子生物學技術(shù)方法的成熟與發(fā)展，DNA分析技術(shù)已經(jīng)在法醫(yī)學中得到廣泛應用，但RNA分析技術(shù)的應用還處于起步階段，法醫(yī)學中采用RNA分析判斷死亡間隔時間的第一篇文獻在1984年發(fā)表，隨后也只有一些零散的報導，直到上個世紀末期，RNA分析技術(shù)的發(fā)展促使了在體液分析中的應用和傷口愈合中分子變化的研究，RNA分析技術(shù)在法醫(yī)病理分子生物學中的研究及應用越來越多。
[0005]目前，已經(jīng)商業(yè)化的選擇性標記RNA突光染料只有invitrogen公司出品的S'K) RNA Select? Green-Fluorescent Cell Stain 一種染料,簡稱 SYTO。該染料在實
際成像應用中存在一些缺陷，例如與RNA響應時間較長、光致毒性大和光穩(wěn)定性差等，這些缺陷大大降低了該RNA染料在生物成像標記中的應用價值。此外,Song, Liu, Shirinfar和Chang等課題組也報道了一部分用于RNA標記的小分子熒光染料，這些染料不同程度的具有一定雙光子吸收性質(zhì)。但是這些RNA染料在RNA選擇性上均未達到專一性的要求，且其識別機理均不明確。因此，開展應用識別機理清楚的專一性的熒光染料對細胞內(nèi)RNA進行實時原位成像的工作變得尤為迫切。
[0006]綜上，現(xiàn)有RNA分析技術(shù)采用的RNA熒光染料與RNA響應時間較長、光致毒性大、光穩(wěn)定性差和在RNA選擇性上均未達到專一性要求的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，針對上述現(xiàn)有RNA分析技術(shù)存在光致毒性大、光穩(wěn)定性差和專一性差的缺陷，提出一種以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料，該熒光材料對RNA具有高效專一的識別能力，同時還具有高效的雙光子吸收能力，并且具有較低的光致毒性、生物毒性和光漂白性。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料，所述熒光染料具有通式I的結(jié)構(gòu):
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料，其特征在于，所述熒光染料具有通式I的結(jié)構(gòu):
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料，其特征在于，所述D的母體選自通式II的化合物、通式III的化合物或通式IV的化合物:
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料，其特征在于，所述通式I的化合物能與RNA上的堿基發(fā)生化學反應。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料，其特征在于，所述通式I的化合物能與RNA上的尿嘧啶發(fā)生氧化還原反應。
5.一種權(quán)利要求1-4任意一項所述以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:將D的母體與6-硝基苯并咪唑按摩爾比為1:1-1:5反應，反應溫度為25-150°C，反應時間為6-48小時，反應溶劑為二氯甲烷、乙醇和乙酸乙酯中的一種或多種，反應在有機堿存在條件下進行，以4- 二甲氨基吡啶為催化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料為具有通式V的化合物:
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法，其特征在于，步驟(1)中通式VI的化合物與乙醇胺摩爾為1:1-1:2.5，反應溫度為100-165°C，反應時間為1_9小時，反應溶劑為乙醇和/或乙二醇單甲醚。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法，其特征在于，步驟(2)的反應溫度為40-130°C，反應時間為7-32小時，反應溶劑為二氯甲烷、乙醇和乙酸乙酯中的一種或多種，反應在有機堿存在條件下進行，以4-二甲氨基吡啶為催化劑，通式VII的化合物與6-硝基苯并咪唑按照摩爾比1:1-1:3反應。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法，其特征在于，所述通式VI的化合物采用以下步驟制備而成:將4-溴-1，8-萘酐與通式VDI的化合物按照摩爾比1:1-1:5反應，反應溫度為70-150°C，反應時間為1-12小時，反應溶劑選自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯和醋酸中的一種或多種；
10.權(quán)利要求1-4任意一項所述以硝基苯并咪唑為RNA識別基團的熒光染料在生物樣品中特異性RNA標記的應用。
【文檔編號】G01N21/64GK103710021SQ201310691037
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】彭孝軍, 張雙喆, 樊江莉, 王靜云, 仉華 申請人:大連理工大學