專利名稱：含有光不穩(wěn)定保護基團的偶聯(lián)劑及其在如固相載體官能化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有光不穩(wěn)定保護基團的偶聯(lián)劑及其在固相載體官能化中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及利用這種偶聯(lián)劑官能化的固相載體，并且涉及所述固相載體在目標生物分子，特別是核酸分子的固定中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人們提出了各種將目標生物分子，特別是例如寡核苷酸(ON)之類的核酸，共價移植在固相載體上的方法。在ON連接的具體內(nèi)容中，這些方法可分成兩個主要類別1.原位合成，其為通過亞磷酰胺途徑的合成原理，在固相載體上逐步構(gòu)建ON分子。在國際申請WO97/39151中經(jīng)特別說明的這個方法，可以制備具有高密度ON的表面。另外，利用一組空白板，和光不穩(wěn)定保護基團，使各種ON定位在載體上。然而，這種方法有不少主要的缺點。更具體而言，與載體連接的ON不能被表征，且很難引入帶有修飾的ON。
2.通過沉積或異位合成，其包括，首先，常規(guī)地制備ON，其次，利用合適的化學反應(yīng)將ON連接至固相載體。第二種方法的優(yōu)點特別在于所用的ON能夠在其連接至固相載體前被表征。
在下文中將特別說明的是關(guān)于本發(fā)明的沉積合成方法。
在現(xiàn)有技術(shù)中已說明了多種利用沉積的合成方法，特別是有關(guān)用于使ON進行定位移植(localizing the grafting)的各種技術(shù)。
首先，所提及的方法可以是利用電化學途徑的方法，其包括固定(anchoring)ON，將該ON預先用例如吡咯基團之類的導電性基團通過吡咯殘基的電聚合作用而官能化。在專利FR2703359中，特別說明了這種電化學ON沉積方法。盡管如此，此方法的缺陷在于需要使用導電性載體，使最終組分變得復雜。此外，在“Lab on a Chip”類組分中，各種制造步驟能夠損害電極的質(zhì)量，并因此損害其功能。
其次，所提及的方法可以是光化學途徑，其似乎是更令人滿意的，這是由于表面及所用的化學溶液的處理(management)是具體化的(externalized)。開發(fā)了兩個方案i.在表面和靶分子之間直接進行光移植。在此情況中，光移植的缺點在于涉及非選擇性的自由基反應(yīng)。
ii.使在載體上光不穩(wěn)定保護基團所保護的官能團游離，從而可其與靶ON隨后的反應(yīng)，以產(chǎn)生其連接。在此情況中，所用的載體通常由偶聯(lián)劑官能化，該偶聯(lián)劑是雙官能化合物，其包括在其一末端的官能團用于與載體表面連接，以及在另一末端的官能團，其對含有互補化學官能團的靶分子有反應(yīng)性，所述偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團被光不穩(wěn)定基團所保護。然而，為了競爭性，后面的方案必須滿足一定的條件。以下是這些條件-活化的載體與靶分子之間的反應(yīng)必須迅速；此反應(yīng)只能夠在偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團從其保護基團游離時發(fā)生(活化反應(yīng))；-由此反應(yīng)所得的產(chǎn)率必須要高；-用于制備偶聯(lián)劑的合成方法必須簡單易行，且包括盡量少的步驟；-使用溫和的反應(yīng)條件(例如水)；-偶聯(lián)劑與靶分子之間形成的鍵必須要在各種溫度和pH的條件下穩(wěn)定，從而可非常靈活的使用由此官能化的載體。
現(xiàn)在，到目前為止所提出的各種方法似乎都不能令人滿意地完全滿足這些條件，特別是由于所用的各種偶聯(lián)劑的性質(zhì)。
因此，發(fā)明人給他們自己所定的目標在于提供一種新穎的雙官能偶聯(lián)劑，該偶聯(lián)劑包括一個由光不穩(wěn)定基團保護的反應(yīng)性官能團，其由包括很少步驟且能夠在溫和條件下實施的方法而容易地合成，能夠有利于使用這些偶聯(lián)劑將固相載體官能化，為了使靶生物分子隨后連接在該載體上。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一個主題是具有以下通式(I)的偶聯(lián)劑A-X-B-Proc (I)其中-A表示用于與固相載體連接的官能團，所述官能團選自胺、亞磷酰胺、硅烷和活化的酯類的官能團；-X表示間隔臂(spacer arm)；-B是選自在光去保護后形成羥基胺(-ONH2)及其衍生物或酰肼(-NH-NH2)及其衍生物的反應(yīng)性官能團，所述官能團B被Proc基團保護；-Proc是以下通式(II)的光不穩(wěn)定保護基團 其中R1和R2可以相同或不同，其表示氫原子或C1-C4烷基。
根據(jù)本發(fā)明，官能團A將根據(jù)待與通式(I)的偶聯(lián)劑連接的載體的性質(zhì)而選擇。優(yōu)選的活化的酯類官能團是用N-羥基丁二酰亞胺，或用其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的合適的活化劑(例如五氟苯)酯化的羧酸官能團。
間隔臂X可以根據(jù)最終特性的需要而改變其長度和極性。例如，其可以是不帶電的疏水鏈(例如飽和烴鏈)或其它例如乙二醇醚的不帶電的親水鏈。
根據(jù)本發(fā)明的具體優(yōu)選實施方式，間隔臂X選自包含1至13個碳原子的飽和烴鏈，或二醇醚，二醇醚的碳鏈包含4至12個碳原子，例如三乙二醇(TEG)和六乙二醇(HEG)。
反應(yīng)性官能團B是在光去保護后，可與具有至少一個互補化學官能團的靶分子共價連接的官能團。此反應(yīng)性官能團B將能夠與該靶分子所具有的互補官能團，例如胺官能團、醇、硫醇、羧基或羰基，相互作用?；パa官能團對的更詳盡列舉可以容易地在任何有機化學專論中查找。
在上述通式(II)的保護基團中，當表示烷基，互相獨立的R1和R2優(yōu)選選自甲基或乙基；特別最優(yōu)選甲基。
在上述通式(I)的偶聯(lián)劑中，特別優(yōu)選下列偶聯(lián)劑，其中i.-A表示亞磷酰胺官能團，-X表示具有6個碳原子的飽和烴鏈，-B表示羥基胺官能團(-ONH-)，且-R1和R2表示氫原子或甲基；ii.-A表示三(C1-C4)烷氧基硅烷，-X表示具有2至12個碳原子的飽和烴鏈，-B表示羥基胺官能團(-ONH-)，且-R1和R2表示氫原子或甲基；iii.-A表示用N-羥基丁二酰亞胺或五氟苯酯化的羧酸官能團，-X表示-CH2-，-B表示羥基胺官能團(-ONH-)，且-R1和R2表示氫原子或甲基；在上述iii)定義的化合物中，最特別優(yōu)選如下化合物，其中官能團A是三乙氧基硅烷，X是含有3個或11個碳原子的飽和烴鏈。上述通式(I)的偶聯(lián)劑，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的有機合成原理，且根據(jù)官能團A和B的性質(zhì)，而容易地制備。
根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方式，當偶聯(lián)劑是通式(I)的化合物，其中連接官能團A是例如N-羥基丁二酰亞胺酯形式活化的羧酸，并且官能團B是羥基胺官能團時，優(yōu)選使用對應(yīng)以下示意圖1的制備方法示意圖1 在此示意圖中，Proc是上述通式(II)所定義的光不穩(wěn)定保護基團，且X可以是具有與上述說明相同含義的間隔臂。
根據(jù)此示意圖，在第一步驟中，含有羧基官能團和羥基胺官能團的通式(III)化合物，受選自通式(II)的Proc光不穩(wěn)定保護基團的保護，由此產(chǎn)生通式(IV)的化合物，然后，在第二步驟中，用N-羥基丁二酰亞胺將通式(IV)化合物的羧酸官能團活化，由此產(chǎn)生預期的通式(I)化合物。
根據(jù)本發(fā)明的第二個實施方式，當偶聯(lián)劑是通式(I)的化合物，其中連接官能團A是亞磷酰胺官能團，且官能團B是羥基胺官能團時，優(yōu)選使用對應(yīng)以下示意圖2的制備方法
示意圖2 在此示意圖上，X和Proc具有如上述說明的相同含義，B表示羥基胺官能團而A表示以下基團。
其中，R和R’可以相同或不同，表示含有1個至13個碳原子的烷基。
根據(jù)此示意圖，在第一步中，通式(V)的鹵代醇(其中Halo表示例如溴、氯、碘或氟的鹵原子)與N-羥基鄰苯二甲酰亞胺反應(yīng)(鹵原子的親核取代)，由此獲得通式(VI)的化合物，其在第二步中進行肼解作用，以獲得游離的羥基胺官能團，其隨后受選自通式(II)的光不穩(wěn)定的Proc保護基團的保護，由此產(chǎn)生通式(VII)的化合物，其在第三步中，進行亞磷酸化作用(phosphitylation)，由此產(chǎn)生預期的通式(I)化合物。
根據(jù)本發(fā)明的第三個實施方式，當偶聯(lián)劑是通式(I)的化合物，其中連接官能團A是硅烷類，且官能團B是羥基胺官能團，優(yōu)選使用對應(yīng)以下示意圖3的制備方法
示意圖3 根據(jù)此方法，通式(IX)的烯烴化合物的羥基胺官能團被保護，由此獲得通式(X)的化合物，其中，X表示間隔臂，其與上述用于說明通式(I)偶聯(lián)劑的間隔臂具有相同含義。隨后，通式(X)的化合物進行氫化硅烷化作用，由此產(chǎn)生通式(I)化合物，其中連接官能團A是三(C1-C4)烷氧基硅烷官能團。
根據(jù)本發(fā)明的通式(I)的偶聯(lián)劑可用于將固相載體官能化。因此，本發(fā)明的主題在于至少一種如上定義的通式(I)的偶聯(lián)劑在固相載體官能化中的應(yīng)用。
使用通式(I)的偶聯(lián)劑，有利于使固相載體表面能夠迅速修飾上穩(wěn)定層，該穩(wěn)定層具有通過光去保護作用而易于得到的反應(yīng)性官能團。
因此，本發(fā)明的主題還在于一種用于制備官能化固相載體的方法，其特征在于包括至少一個使固相載體的至少一個表面與在有機溶液中的至少一種通式(I)的偶聯(lián)劑的溶液接觸的步驟。
優(yōu)選的有機溶劑選自例如三氯乙烯、二甲基甲酰胺(DMF)和環(huán)己烷的非極性溶劑。
使固相載體與通式(I)的偶聯(lián)劑溶液接觸，優(yōu)選在大約4℃至80℃之間的溫度進行，維持大約1至48小時。
隨后，用一種或多種溶劑清洗基質(zhì)，優(yōu)選連續(xù)地使用反應(yīng)溶劑、絕對乙醇和/或氯仿，隨后干燥，優(yōu)選使用氮。
此方法的優(yōu)點在于其可以簡單地實施，且使其有可能獲得具有良好密度的層。特別是有可能使其獲得包括至少一表面由通式(I)化合物的自組裝單層(SAM)官能化的固相載體。SAM定義為分子的組裝(assembly)，其中，分子是經(jīng)排列的(organized)，其排列是由于分子鏈之間的相互作用，產(chǎn)生穩(wěn)定的、單分子的并且整齊的非均向膜(A.ULMAN，Chem.Rev.，1996，96，1533-1554)。當固相載體表面被根據(jù)本發(fā)明通式(I)的偶聯(lián)劑(其中，連接官能團A是硅烷類官能團)官能化時，優(yōu)選在濃度大約為10mM的溶液中，其溶劑例如為三氯乙烯，且當其接觸是在大約4℃的溫度下進行大約24小時時，特別有可能獲得該SAM。
另外，通過實施本發(fā)明的方法所獲得的表面直接呈現(xiàn)出大量的被光不穩(wěn)定保護基團所保護的反應(yīng)性官能團，容易在時間和空間上選擇性地除去該保護基團，從而共價地固定目標生物分子，該生物分子包括與存在于固相載體表面的偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團B互補的化學官能團。
可以用本發(fā)明的通式(I)的偶聯(lián)劑官能化的固相載體優(yōu)選選自由玻璃、陶瓷(氧化物類)、硅或塑料制造的載體，所述載體包括至少一個水合的、羥基化的、硅烷化的或氨化的表面、或另選的活化的酯類表面。該表面可以容易地根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)熟知的技術(shù)制備。例如，能夠通過利用硅烷環(huán)氧化物的硅烷化作用制備包括羥基化表面的固相載體，其隨后進行酸解，從而使表面的羥基官能團游離。
此固相載體含有至少一個平面或非平面、平滑或結(jié)構(gòu)性表面，并且可以是例如載玻片、平面塑料板或具槽的塑料板、毛細管或其它有孔或無孔珠的形式。
如上述說明，通式(I)的偶聯(lián)劑的連接官能團A，根據(jù)待與偶聯(lián)劑連接的載體表面的性質(zhì)選擇。
因此，當它們是含有至少一個活化的酯類表面的載體時，官能團A優(yōu)選是胺類官能團；當它們是含有至少一個羥基類表面的載體時，官能團A優(yōu)選是亞磷酰胺或硅烷官能團；當它們是含有至少一個氫化物類表面的載體時，官能團A優(yōu)選是硅烷官能團；且當它們是含有氨化表面的載體時，官能團A優(yōu)選是活化的酯官能團。
因此，本發(fā)明的主題還有如下的固相載體，其含有至少一表面由一個或多個如上述定義的通式(I)的偶聯(lián)劑官能化。
固相載體經(jīng)去保護后，能夠有利地用于將目標生物分子固定，該生物分子含有與存在于所述固相載體表面的通式(I)偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團B互補的化學官能團，并且更具體而言，該固相載體可用于共價固定例如DNA和寡核苷酸之類的核酸分子。
因此，本發(fā)明的主題還有上述固相載體的應(yīng)用，用于將目標生物分子共價固定，該生物分子包括與存在于所述固相載體表面的通式(I)偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團B互補的化學官能團，更具體而言，通過酰胺鍵(肽)的形成共價固定核酸(DNA、寡核苷酸)。
本發(fā)明的主題還有用于將目標生物分子，特別是核酸分子，固定在上述固相載體上的方法，其特征在于其至少包括第一步驟通過將固相載體的至少一部分表面曝光，使通式(I)化合物的反應(yīng)性官能團B光去保護，隨后使由此而活化的固相載體與目標生物分子(特別是核酸分子)溶液接觸，從而使所述分子在所述固相載體上固定(通過與由所述分子所帶有的至少一個化學官能團之間形成共價鍵，且該化學官能團與本發(fā)明的通式(I)的所述化合物的反應(yīng)性官能團B有反應(yīng)性)，并任選地重復這兩個步驟。
更具體而言，光去保護步驟可以只局限在部分經(jīng)官能化的固相載體表面上，例如通過掩模進行。
曝光后，通式(I)偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團B是在去保護(活化)狀態(tài)，其因此產(chǎn)生帶有游離的反應(yīng)性官能團的區(qū)域，其可以捕捉溶液中任何包括如下化學官能團的分子，該化學官能團與在固相載體表面存在的所述活化反應(yīng)性官能團B有反應(yīng)性。
更具體而言，固定步驟通過在通式(I)化合物的羥基胺官能團B與目標生物分子(特別是核酸分子)的羰基化官能團之間形成肟鍵而進行。此反應(yīng)的優(yōu)點在于能夠在溫和的條件下進行，特別是在pH4和7之間進行。另外，所形成的鍵(肟)表現(xiàn)出很大的穩(wěn)定性，且其不需要利用附加的還原步驟使其穩(wěn)定。
曝光波長優(yōu)選在300nm至400nm之間。
目標生物分子的溶液可以是簡單的水溶液或這些分子在緩沖水溶液中的其它溶液。
接觸的持續(xù)時間優(yōu)選在大約5至60分鐘之間，并優(yōu)選在大約4至60℃的溫度之間進行。
最后，本發(fā)明的主題還有如上述說明、且根據(jù)本發(fā)明通過進行固定方法而獲得的固相載體(特別是核酸芯片)，即含有至少一表面，在其上固定所述目標生物分子(特別是核酸分子)，該固定通過與本發(fā)明的通式(I)的偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團B形成共價鍵而進行。


除了上述安排，本發(fā)明還包括將在以下說明的其它安排，其參考通式(I)的偶聯(lián)劑的制備的實施例、使用根據(jù)本發(fā)明的通式(I)偶聯(lián)劑，對毛細管類玻璃固相載體或平面固相載體進行官能化的實施例、使用這些官能化載體，將寡核苷酸固定、還說明了所附的圖1和圖2，其中-圖1表示與根據(jù)本發(fā)明方法的毛細管類固相載體連接的寡核苷酸所放射的熒光的照片，用熒光團(a/類毛細管)標記的互補的寡核苷酸雜化后，與非官能化毛細管(b/類毛細管)對比；-圖2表示與根據(jù)本發(fā)明方法的平面固相載體連接的寡核苷酸所放射的熒光的照片，用熒光團(a/類載體)標記的互補的寡核苷酸雜化后，與非官能化載體(b/類載體)對比。
具體實施例方式
實施例1根據(jù)通式(I)的亞磷酰胺衍生物的制備 1)步驟1化合物(1)的制備羥基胺的引入
N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(2.70g；16.6mmol)和碳酸鉀(4.6g；23.6mmol)在150ml二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液，在50℃的溫度于氬氣下加熱攪拌1小時。隨后加入6-溴代環(huán)己醇(3g；16.6mmol)，然后再次在50℃的溫度下，將該反應(yīng)混合物攪拌過夜。過濾后，將溶劑在減壓下蒸發(fā)。隨后將50ml乙酸乙酯加至由此獲得的殘留物，并隨后用0.1N氫氧化鈉和飽和氯化鈉水溶液沖洗有機相。隨后用無水硫酸鈉干燥該有機相，然后蒸發(fā)。獲得白色粉末狀的產(chǎn)物(1)(3.28g；12.5mmol；產(chǎn)率75％)，其熔點在85和88℃之間。
質(zhì)子核磁共振光譜(1H-NMR)分析，在CDCl3中以波長200MHz進行，結(jié)果如下δppm＝1.30-1.90(8H，m，4CH2)，3.60(2H，t，J＝13Hz，CH2O)，4.20(2H，t，J＝13Hz，CH2ON)，7.70-7.90(4H，m，Ar-H).
MS(DCI，正離子檢測模式)Mcalc-263(C14H17NO4)，m/z＝281[M+NH4]+.
2)步驟2化合物(1)的三苯甲基化以產(chǎn)生化合物(2) 將三苯甲基氯(4.2g；15mmol)加至從前述步驟獲得的化合物(1)(3.2g；12.5mmol)的75ml無水吡啶溶液中。在氬氣下，將該溶液于室溫攪拌過夜。隨后緩慢加入5ml甲醇，然后在減壓下將溶劑蒸走。所得的殘留物隨后溶解在100ml乙酸乙酯中，然后以水和飽和氯化鈉水溶液沖洗該有機相，隨后用無水硫酸鈉干燥該有機相，然后蒸發(fā)。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物(洗脫液二氯甲烷/環(huán)己烷75/25，v/v)。獲得白色粉末狀的產(chǎn)物(2)(6.27g；12.4mmol；產(chǎn)率99％)，其熔點為106-107℃。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.30-1.90(8H，m，4CH2)，3.20(2H，t，J＝13Hz，CH2O)，4.20(2H，t，J＝13Hz，CH2ON)，7.70-7.90(4HAr，m，Ar-H-鄰苯二甲酰亞胺)，7.20-7.40(15H，m，Ar-H-三苯甲基).
MS(ESI，正離子檢測模式)MCalc＝505(C33H31NO4)，m/z＝528[M+Na]+，m/z＝544[M+K]+.
3)步驟3化合物(2)的肼解以獲得化合物(3) 將上述步驟2中獲得的化合物(2)(6.27g；12.4mmol)溶解在50ml二氯甲烷中，并加入780mg肼(24.8mmol)。所得的溶液回流1.5小時，然后過濾，并在減壓下蒸發(fā)。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液為二氯甲烷，然后再用95/5(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物洗脫。獲得油狀的化合物(3)(4.20g；11.2mmol)，產(chǎn)率90％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.30-1.80(8H，m，4CH2)，3.10(2H，t，J＝13Hz，CH2O-Tri)，3.60(2H，t，J＝13Hz，CH2ON)，7.70-7.90(15H，m，Ar-H-三苯甲基).
MS(ESI，正離子檢測模式)MCalc＝375(C25H29NO2)，m/z＝376[M+H]+，m/z＝398[M+Na]+，m/z＝414[M+K]+.
4)步驟4化合物(3)的羥基氨的保護以獲得化合物(4)
在步驟3中制備的化合物(3)(4.20g；11.2mmol)溶解在100ml吡啶中。隨后逐滴加入50ml含有5.40g(22.4mmol)2-(2-硝基苯基)丙基氯甲酯(Cl-NPPOC)的二氯甲烷溶液中。在黑暗中攪拌該反應(yīng)混合物1小時，然后減壓蒸發(fā)。所得的殘留物隨后溶解在二氯甲烷中，其后，以飽和氯化鈉水溶液沖洗該有機相，用無水硫酸鈉干燥該有機相，然后蒸發(fā)。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液二氯甲烷。獲得橙色的油狀產(chǎn)物(4)(5.80g；9.9mmol)，產(chǎn)率89％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.30(3H，d，J＝16Hz，CH3)，1.50-1.80(8H，m，4CH2)，3.0(2H，t，J＝13Hz，CH2O-Tri)，3.70(2H，m，CH2ON，1H，mCH)，4.20(2H，t，J＝13Hz，CH2OCO)，7.10-7.50(15H，m，Ar-H-三苯甲基)，7.50-7.80(4H，m，Ar-HNPPOC).
MS(ESI，正離子檢測模式)Mcalc＝582(C35H38N2O6)，m/z＝605[M+Na]+，m/z＝621[M+K]+.
MS(ESI，負離子檢測模式)m/z＝581[M-H]-.
5)化合物(4)的去(除)三苯甲基作用以獲得化合物(5) 將5.80g(9.90mmol)在前述步驟中獲得的化合物(4)溶解在50ml含有20％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中。在氬氣下，將該混合物于室溫攪拌3至4小時，然后蒸發(fā)。所得的殘留物溶解在100ml二氯甲烷中，其后，以飽和NaCl水溶液沖洗該有機相。用無水硫酸鈉干燥該有機相，然后蒸發(fā)。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液為二氯甲烷，然后用95/5(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物。獲得橙色的油狀化合物(5)(3.0g；8.9mmol)，產(chǎn)率90％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.30(3H，d，J＝16Hz，CH3)，1.50-1.80(8H，m，4CH2)，3.70(2H，m，CH2ON，1H，m，CH)，4.30(2H，t，CH2OCO，2H，t，CH2OH)，7.50-7.80(4H，m，Ar-HNPPOC).MS(DVI，正離子檢測模式)Mcalc＝340(C16H24N2O6)，m/z＝454[M+TFA]+.
6)步驟6化合物(5)的亞磷酸化作用以獲得化合物(6) 在前述步驟中獲得的化合物(5)(0.90g；2.7mmol)在氬氣下溶解在15ml二氯甲烷溶液中，然后加入二異丙基-乙胺(DIEA)(0.56ml；3.2mmol)，接著加入0.72ml2-氰乙基二異丙基氯-亞磷酰胺(3.2mmol)。將該反應(yīng)混合物于室溫攪拌4小時直至原料消失。然后，加入40ml二氯甲烷，其后，以飽和碳酸氫鈉溶液沖洗該有機相，然后用飽和NaCl水溶液沖洗。用無水硫酸鈉干燥該有機相，然后蒸發(fā)。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液為二氯甲烷，然后用97/3(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物。獲得黃色的油狀化合物(6)(0.50g；1.0mmol)，產(chǎn)率38％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.20-1.50(15H，m，4CH3)，1.50-1.85(8H，m，4CH2)，2.65(2H，t，CH2CN)，3.80(2H，m，CH2OH，1H，m，CH，4H，m，2CH2OP)，4.30(2H，m，CH2OCO，2H，m，2 CHN，7.10-7.70(4H Ar-HNPPOC).
31P-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝120(2非對映異構(gòu)體).
實施例2根據(jù)通式(I)的活化的酯衍生物(化合物8)的制備 1)步驟1前體酸(7)的制備 羧基甲氧基胺鹽酸(1g；4.57mmol)溶解在25ml含有10％碳酸鈉的水溶液中。將該溶液冷卻至0℃的溫度，并在攪拌下，逐滴加入20ml含有2.20g(9.1mmol)2-(2-硝基苯基)丙基氯甲酯(Cl-NPPOC)的二氧雜環(huán)乙烷溶液。在室溫保持攪拌2至3小時。將反應(yīng)介質(zhì)蒸發(fā)至干透。加入250ml水至由此獲得的殘留物，其后，以200ml二乙醚沖洗水相。然后，以1N鹽酸溶液酸化水相至pH為3，且分別以250ml二氯甲烷萃取三次。合并所有有機相，并以無水硫酸鈉干燥。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液為二氯甲烷，然后用97/3(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物。獲得白色粉末狀化合物(7)(1.20g；4.0mmol)，其熔點在88和92℃之間，產(chǎn)率90％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.40(3H，d，J＝16Hz，CH3)，3.70(1H，m，CH)，4.30(2H，m，CH2O)4.40(s，2H，COCH2O)，7.30-7.60(4H，m，Ar-HNPPOC).
13C-NMR(300MHz，CDCl3)δppm＝18(CH2)，33(CH2)，67(CH3)，70(CH3)，75(CH3)，123(quat)，137(quat)，138(quat)，133(quat)，136(CH)，151(CH)，159(CH)，172(CH)，173(CH).
MS(ESI，正離子檢測模式)Mcalc＝298(C12H14N2O7)，m/z＝321[M+Na]+，m/z＝337[M+K]+.
MS(ESI，負離子檢測模式)m/z＝297[M-H]-，m/z＝595[2M-H]-.
2)步驟2N-羥基丁二酰亞胺活化酯(8)的制備 在前述步驟中獲得的酸(7)(1.20g；4.0mmol)溶解在15ml無水二氯甲烷中，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(0.82g；4.4mmol)，接著加入N-羥基丁二酰亞胺(0.457；4.4mmol)。將該反應(yīng)介質(zhì)攪拌過夜。過濾后，減壓蒸走溶劑。以快速的硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液為乙酸乙酯。獲得黃色粉末狀化合物(8)(1.0g；2.68mmol)，產(chǎn)率67％。
實施例3通過五氟苯活化的通式(I)的酯衍生物(9)的制備
將500mg(1.6mmol)在上述實施例2的步驟1中獲得的化合物(7)溶解在5ml二氯甲烷，然后加入372mg(1.9mmol)五氟苯酚，接著，逐滴加入1ml含有DCC(360mg，1.9mmol)的二氯甲烷溶液。將該混合物攪拌4小時，然后將所形成的二環(huán)尿素(dicyclourea)(DCU)沉淀物濾走。蒸發(fā)溶劑后，獲得油狀的化合物(9)(740mg；1.9mmol)，產(chǎn)率100％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.30(3H，d，J＝16Hz，CH3，3.70(1H，m，CH)，4.30(2H，m，CH2O)，4.70(s，2H，COCH2O)，7.30-7.70，(4H，m，Ar-HNPPOC).
19F-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝-166.0(1F，t)，-164.0(1F，d)，-162.0(1F，t)，-157.0(1F，t)，-152.50(1F，d).
實施例4通式(I)的三乙氧基硅烷衍生物的制備 1)步驟1N-硝基苯基-丙氧基羰基烯丙基羥基胺(10)的制備
將15ml含有6g(27mmol)2-(2-硝基苯基)丙基氯甲酯(Cl-NPPOC)的二氯甲烷溶液逐滴加至25ml含有市售的烯丙基羥基胺(3.250g；29.6mmol；1.1當量)經(jīng)冷卻至0℃溫度的無水吡啶中。攪拌30分鐘后，將溶劑蒸走，然后與甲苯共沸。將反應(yīng)的粗產(chǎn)物溶解在乙酸乙酯中。將有機相沖洗，并以無水琉酸鈉干燥，然后減壓蒸走溶劑。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液為1/4(v/v)乙酸乙酯和己烷的混合物。獲得化合物(10)(5.76g)，產(chǎn)率72％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.40(d，6H，Si-CH2-CH3)，3.70(q，1H，Ar-CH-CH3)，4.30(m，4H，CH2O，OCH2)，5.30(dd，2H，CH2)，5.90(m，1H，CH)，7.20(s，1H，NH)，7.30-7.80(m，4H，H-Ar).
2)步驟2氫化硅烷化作用以產(chǎn)生化合物(11)將20μl Karsted催化劑逐滴加至含有1.67g(5.6mmol)在前述步驟中獲得的化合物(10)的8ml三乙氧基硅烷溶液中。在60℃的溫度下將其攪拌過夜，利用減壓蒸餾蒸走溶劑。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液為1/4(v/v)乙酸乙酯和己烷的混合物。獲得預期化合物(11)(1.33g)，產(chǎn)率60％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝0.65(m，2H，CH2Si)，1.20(t，3H，CH3-CH2-O)，1.40(d，3H，CH3-CH)，1.70(m，3H，CH2，CH-CH3)，3.80(m，4H，O-CH2-CH3，CH2O)，4.30(m，2H，CH2-O-CO)，7.30-7.80(m，5H，NH，H-Ar).
MS(電噴射，正離子檢測模式)Mcalc＝444，m/e＝44.7[M+H]+.
固相載體的制備實施例是根據(jù)本發(fā)明利用通式(I)的偶聯(lián)劑進行的，是毛細管形式(長度為3cm和直徑為100μm的玻璃毛細管)的。應(yīng)當清楚明白，這些實施例也可以用于其它種類的載體的平面形式。
實施例5用通式(I)的偶聯(lián)劑官能化的含有硅烷類連接官能團A的固相載體的制備在這個實施例中，如上述實施例4中制備的化合物(11)用作通式(I)的偶聯(lián)劑。
通過化合物(11)官能化的固相載體是以單一步驟獲得的，在這種情況下，根據(jù)以下的反應(yīng)示意圖所示的礦物固相載體(玻璃毛細管)表面的硅烷化作用得到 為了完成這個步驟，用含有氫氧化鈉濃度為6M的1/1的水/乙醇混合物溶液填充毛細管，并于室溫中將該溶液留在毛細管內(nèi)2小時。
隨后徹底地用水清洗毛細管，然后用氮氣干燥。
隨后，將含有化合物(11)濃度為10mM的三氯乙烯溶液填充毛細管，并將它留在室溫中反應(yīng)過夜。
隨后徹底地以三氯乙烯、絕對乙醇以及隨后用氯仿清洗毛細管，最后用氮氣干燥。
從而獲得利用一層化合物(11)使其內(nèi)部表面官能化的(即光敏感羥基胺表面)玻璃毛細管。
實施例6用通式(I)的偶聯(lián)劑官能化的含有硅烷類連接官能團A的固相載體的制備在這個實施例中，如上述實施例2中制備的包括NHS-活化的酯類的連接官能團A的化合物(8)，用作通式(I)的偶聯(lián)劑。
根據(jù)以下的反應(yīng)示意圖，利用NHS-活化的酯偶聯(lián)劑官能化的固相載體是以兩個步驟獲得的 根據(jù)這些，在步驟1中，固相載體的礦物表面轉(zhuǎn)換成含有胺官能團的表面，而且在步驟2中，所述表面胺官能團與化合物(8)反應(yīng)。
1)步驟1包括胺官能團的表面的制備用含有氫氧化鈉濃度為6M的1/1的水/乙醇混合物溶液填充(filled)毛細管，并于室溫中將該溶液留在毛細管內(nèi)2小時。
徹底地以水清洗毛細管，然后用氮氣干燥。
將含有10％三氯乙烯的95℃乙醇溶液填充毛細管，并將該溶液留在室溫中過夜。
隨后徹底地用三氯乙烯、絕對乙醇以及氯仿清洗毛細管，且最后用氮氣干燥。
獲得內(nèi)部表面用胺官能團覆蓋的毛細管。
2)步驟2利用化合物(8)使載體官能化在上述步驟1獲得的毛細管，以化合物(8)濃度為10mM的二甲基甲酰胺(DMF)溶液填充，并于室溫中將該溶液留在毛細管內(nèi)過夜。
毛細管隨后先后用DMF和乙醇清洗，且最后用氮氣干燥。
因此獲得利用一層化合物(8)使其內(nèi)部表面官能化的(即光敏感羥基胺表面)玻璃毛細管。
實施例7官能化載體在固定目標生物分子中的應(yīng)用在這個實施例中，于上述實施例5中獲得的固相載體用于固定寡核苷酸(ON)。然而，應(yīng)當清楚明白，這些載體在固定其它目標生物分子的應(yīng)用也是有效的。
在寡核苷酸的例子中，這些分子的移植和對它們存在于固相載體表面的驗證包括四個步驟i.曝光這是在光的作用下，能夠使固相載體表面上的反應(yīng)性官能團B局部游離的步驟。此官能團B將容許生物分子的移植。
ii.固定這本身是ON移植的步驟，曝光后，通過由ON所帶有的醛官能團與在固相載體表面的光去保護的官能團B之間的反應(yīng)而進行。
iii.雜化這是對所需ON的移植的驗證步驟，利用帶有熒光團的互補序列(complementary sequence)識別移植在固相載體表面的ON。
iv.使用掃描器檢測熒光這是對任何由熒光團發(fā)出的信號的處理步驟。
I)步驟1)曝光步驟將如上述實施例5中制備的化合物(11)官能化的毛細管用1/1的吡啶/水的混合物填充。
隨后對毛細管的各個已選位點曝光5秒，利用波長為365nm的紫外線A(UVA)輻射曝光器件，并將狹縫尺寸調(diào)節(jié)至160μm，曝光強度為4mW/mm2，所述曝光器件裝備了100W的燈。
隨后，用水清洗毛細管，然后用氮氣干燥。
2)ON固定步驟將步驟1所處理的毛細管在帶有醛官能團的ON且濃度為10μM的水溶液中保存，使其整體反應(yīng)30分鐘。
隨后，用水清洗毛細管，然后用0.2％月桂基硫酸鈉溶液，以及再次用水進行清洗，并最后用氮氣干燥。
3)雜化步驟用帶有CY3熒光團的互補ON溶液填充上述步驟2中獲得的其上固定了ON的毛細管，并在40℃的溫度下，使其整體反應(yīng)1小時。
隨后，用0.2％檸檬酸鈉溶液清洗毛細管。
4)讀取步驟將上述步驟3中獲得的其上的熒光團標記的ON已被雜化的毛細管放置在載玻片上，隨后將其引入由Genomic′s Solution公司出售的熒光讀取器中。
相同的測量還在對照毛細管(b/類)上進行，對該對照毛細管進行了如上述對測試毛細管(a/類)除了使用通式(I)的偶聯(lián)劑官能化的步驟以外的相同的處理。
II)結(jié)果獲得的熒光圖像在所附的圖1中表示，其中，應(yīng)注意到，只有經(jīng)曝光的位點是熒光的。另外，可以看出只有本發(fā)明的通式(I)的偶聯(lián)劑官能化的毛細管(a/類載體)含有對應(yīng)于所需ON的光定位(photolocalized)固定的熒光片斷，非官能化的毛細管(b/類載體)完全是非熒光的。
這個實例證明了本發(fā)明的固相載體能夠以具體且針對性的方式有利地用于目標分子的固定。
實施例8通式(I)的三乙氧基衍生物(15)的制備 1)步驟1化合物(12)的制備羥基胺的引入 N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(3.50g；21mmol)和碳酸鉀(8g；41mmol)的250ml二甲基甲酰胺(DMF)溶液，在50℃的溫度于氬氣下加熱攪拌1小時。隨后加入11-溴十一碳烯(5.0g；21mmol)，然后再次在50℃的溫度下，將該反應(yīng)混合物攪拌3小時。過濾后，將溶劑在減壓下蒸發(fā)。隨后將100ml二氯甲烷加至由此獲得的殘留物，并隨后用0.1N氫氧化鈉和飽和氯化鈉水溶液沖洗有機相。隨后用無水硫酸鈉干燥該有機相，然后蒸發(fā)。獲得白色粉末狀的產(chǎn)物(12)(6.45g；20.4mmol；產(chǎn)率97％)，其熔點在38至40℃之間。
質(zhì)子核磁共振光譜(1H-NMR)分析，在CDCl3中波長為200MHz中進行，結(jié)果如下δppm＝1.20-1.50(12H，m，6CH2)；1.78(2H，m，J＝7Hz，C2H3CH2CH2CH2)；2.02(2H，m，C2H3CH2CH2)；4.18(2H，t，J＝6Hz，CH2ON)；4.95(2H，m，CH2CHCH2)；5.79(1H，m，CH2CHCH2)；7.70-7.85(4H，m，Ar-H).
MS(ESI，正離子檢測模式)Mcalc-315(C19H25NO3)，m/z＝338[M+Na]+.
2)步驟2化合物(12)的肼解作用以獲得化合物(13) 在上述步驟1中獲得的化合物(12)(3.0g；9.64mmol)溶解在30ml二氯甲烷中，并加入966mg肼(19,3mmol)。所得的溶液回流3小時，然后過濾，并在減壓下蒸發(fā)。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，洗脫液為乙酸乙酯和己烷的混合物(v/v1/2)。獲得半透明的油狀化合物(13)(1.65g；8.94mmol)，產(chǎn)率93％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.20-1.50(12H，m，4CH2)，1.56(2H，m，C2H3CH2CH2CH2)，2.03(2H，q，C2H3CH2CH2)，3.65(2H，t，J＝6Hz，CH2ON)，4.96(2H，m，CH2CHCH2)，5.80(1H，m，CH2CHCH2).
MS(ESI，正離子檢測模式)Mcalc＝185(C11H23NO)，m/z＝186[M+H]+.
3)步驟3化合物(13)的羥基胺的保護以獲得化合物(14) 在步驟2中制備的化合物(13)(470mg；2.54mmol)溶解在2ml比啶中。隨后逐滴地加入3ml含有620mg(5.08mmol)2-(2-硝基苯基)丙基氯甲酯(Cl-NPPOC)的二氯甲烷溶液中。在黑暗中攪拌該反應(yīng)混合物2小時，然后過濾并減壓蒸發(fā)。所得的殘留物隨后溶解在二氯甲烷中，其后，先后以10％(w/v)碳酸鈉水溶液和鹽酸水溶液(1N)沖洗該有機相，并最后以飽和氯化鈉水溶液沖洗。用無水硫酸鈉干燥該有機相，然后蒸發(fā)。以硅膠層析法純化粗產(chǎn)物，乙酸乙酯和己烷的混合物(v/v1/4)。獲得橙色油狀的產(chǎn)物(14)(873mg；2.22mmol)，產(chǎn)率88％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝1.20-1.40(12H，m，6CH2)，1.35(3H，d，J＝7Hz，CH3)，1.56(2H，m C3H3CH2CH2CH2)，2.03(2H，m，C2H3CH2CH2)，3.65(2H，m，CH2ON，1H，m，CH)，4.28(2H，m，CH2OCO)，4.96(2H，m，CH2CHCH2)，5.80(1H，m，CH2CHCH2)，7.20-7.80(4H，m，Ar-HNPPOC).
MS(ESI，正離子檢測模式)Mcalc＝392(C21H32N2O5)，m/z＝415[M+Na]+，m/z＝410[M+NH4]+.
4)步驟4化合物(14)的氫化硅烷化作用以獲得化合物(15) 將根據(jù)上述步驟3的方法所獲得的化合物(14)(1.28g；3.2mmol)加至由5ml三乙氧基硅烷和14μl(0.25當量)Karsted催化劑組成的溶液中。在60℃的溫度下，將該反應(yīng)混合物攪拌2小時，然后將溶劑蒸走，并在真空下與DMF共沸(5至6次)。獲得油狀的預期產(chǎn)品(15)(1.49g；2.68mmol)，產(chǎn)率83％。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δppm＝0.6(2H，m，CH2Si)，1.20-1.40(16H，m，6CH2，9H3CH3CH2OSi)，1.35(3H，d，J＝7Hz，CH3)，3.65(2H，m，CH2ON，1H，m，CH)，4.28(2H，m，CH2OCO)，7.20-7.80(4H，m，Ar-HNPPOC).
MS(ESI，正離子檢測模式Mcalc＝556(C27H48N2O8Si)，m/z＝579[M+Na]+.
實施例9用通式(I)的偶聯(lián)劑官能化的含有硅烷類連接官能團A的平面固相載體的制備在這個實例中，在上述實施例8中所制備的化合物(15)用作通式(I)的偶聯(lián)劑。
1)步驟1表面的再水合(活化)將含有非活性SiO2官能團的固相平面硅載體在包含氫氧化鈉(1gNaOH)和由4ml水和3ml乙醇組成的溶液中浸沒1小時。隨后用超純水、0.2N鹽酸溶液、并最后用水清洗該載體，由此產(chǎn)生含有活化的SiOH官能團的表面。隨后用氬氣干燥該載體。
2)步驟2使用化合物(15)使載體硅烷化由此而活化的載體在80℃且濃度為5mM的化合物(15)(7ml)的甲苯/三乙基胺(v/v97/3)溶液中浸泡過夜。該載體隨后用甲苯、乙醇清洗，最后用氬氣干燥。隨后將由化合物(15)官能化的載體，放置在110℃的培養(yǎng)箱中3小時。
實施例10用通式(I)偶聯(lián)劑官能化的固相平面載體在目標生物分子固定中的應(yīng)用正如上面實施例7所述，ON移植和對它們存在于固相載體表面的驗證包括四個步驟曝光、固定、雜化、最后使用掃描器檢測熒光。
I)步驟1)步驟1載體曝光根據(jù)實施例9中所述的方法由化合物(15)官能化的固相平面載體，其上所涂覆的塑料掩模包括尺寸為100μm×100μm的透明點，該容許光線經(jīng)過的透明點被一滴1/1(v/v)的吡啶/水混合物覆蓋。由此通過掩模，利用波長為365nm且強度為4mW/mm2的紫外線A(UVA)輻射曝光器件，將整個載體表面進行15秒曝光，所述曝光器件裝備了100W的燈。
隨后，用水清洗固相平面載體，然后用氮氣干燥。
2)步驟2ON固定因此，將步驟1所處理的平面載體在帶有醛官能團的ON且濃度為10μM的水溶液中保存，并使其整體反應(yīng)30分鐘。
隨后，用水清洗載體，然后用0.2％月桂基硫酸鈉溶液，以及再次用水進行清洗，并最后用氮氣干燥。
3)步驟3雜化用帶有CY3熒光團的互補ON溶液填充步驟2中獲得的其上固定了ON的固相載體，并在40℃的溫度下，使其整體反應(yīng)1小時。隨后，用0.2％檸檬酸鈉溶液清洗載體。
4)步驟4讀取將上述步驟3中獲得的其上熒光團-標記的ON已被雜化的載體放置在載玻片上，并隨后將所述載玻片引入由Genomic′s Solution公司出售的熒光讀取器中。
相同的測量還在對照固相平面載體(b/類)上進行，對該對照載體進行如上述對測試毛細管(b/類)除了使用化合物(15)官能化的步驟外的相同的處理。
II)結(jié)果獲得的熒光圖像在所附的圖2中表示，其中，應(yīng)注意到，只有經(jīng)曝光的位點是熒光的。另外，可以看出只有本發(fā)明的偶聯(lián)劑(15)官能化的固相平面載體(a/類載體)含有對應(yīng)于所需ON的光定位固定的熒光點，非官能化載體(b/類載體)是完全非熒光的。
這個實例證明了根據(jù)本發(fā)明的固相載體，能夠以特異的且定位的方式有利地用于目標分子的固定。
權(quán)利要求
1.一種如下通式(I)的偶聯(lián)劑A-X-B-Proc (I)其中-A表示用于與固相載體連接的官能團，所述官能團選自胺、亞磷酰胺、硅烷和活化的酯類的官能團；-X表示間隔臂；-B是選自在光去保護后，形成羥基胺(-ONH2)及其衍生物或酰肼(-NH-NH2)及其衍生物官能團的反應(yīng)性官能團，所述官能團B被Proc基團保護；-Proc是以下通式(II)的光不穩(wěn)定保護基團 其中R1和R2可以相同或不同，其表示氫原子或C1-C4烷基。
2.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)劑，其特征在于所述的間隔臂X是不帶電的疏水鏈或不帶電的親水鏈。
3.如權(quán)利要求2所述的偶聯(lián)劑，其特征在于所述的間隔臂X選自包含1至13個碳原子的飽和烴鏈、以及碳鏈包含4至12個碳原子的二醇醚。
4.如前述任一權(quán)利要求所述的偶聯(lián)劑，其特征在于互相獨立的R1和R2表示選自甲基和乙基的烷基。
5.如前述任一權(quán)利要求所述的偶聯(lián)劑，其特征在于所述的偶聯(lián)劑選自下列，其中i.-A表示亞磷酰胺官能團，-X表示具有6個碳原子的飽和烴鏈，-B表示羥基胺官能團(-ONH-)，且-R1和R2表示氫原子或甲基；ii.-A表示三(C1-C4)烷氧基硅烷，-X表示具有2至12個碳原子的飽和烴鏈，-B表示羥基胺官能團(-ONH-)，且-R1和R2表示氫原子或甲基；iii.-A表示與N-羥基丁二酰亞胺、或五氟苯酯化的羧酸官能團，-X表示-CH2-，-B表示羥基胺官能團(-ONH-)，且-R1和R2表示氫原子或甲基。
6.如權(quán)利要求5所述的偶聯(lián)劑，其特征在于所述的化合物iii)選自其官能團A為三乙氧基硅烷，且X是具有3或11個碳原子的飽和烴鏈的化合物。
7.至少一個如權(quán)利要求1至6中任何一項所定義的通式(I)的偶聯(lián)劑在使固相載體官能化中的應(yīng)用。
8.一種制備官能化固相載體的方法，其特征在于其包括至少一個使固相載體的至少一面與在有機溶劑中的至少一種如權(quán)利要求1至6中任何一項所定義的通式(I)的偶聯(lián)劑的溶液接觸的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于使固相載體與通式(I)的偶聯(lián)劑溶液于4℃-80℃接觸1至48小時。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述的固相載體選自由玻璃、陶瓷、硅或塑料制成的載體，所述載體包括至少一個水合的、羥基化的、硅烷化的或氨化的表面或活化的酯類表面。
11.如權(quán)利要求8至10中任何一項所述的方法，其特征在于所述的載體含有至少一個平面或非平面、平滑或結(jié)構(gòu)性表面，并且是載玻片、平面的塑料板或具槽的塑料板、毛細管或有孔或無孔珠的形式。
12.一種固相載體，其特征在于其含有至少一個被一種或多種如權(quán)利要求1至6中任何一項所定義的通式(I)的偶聯(lián)劑官能化的表面。
13.權(quán)利要求12所定義的至少一種固相載體的應(yīng)用，其用于使目標生物分子共價固定，所述的生物分子含有與存在于所述固相載體表面的通式(I)的偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團B互補的化學官能團。
14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于所述目標生物分子是核酸分子。
15.權(quán)利要求14所定義的使目標生物分子固定在固相載體上的方法，其特征在于所述的方法至少包括第一步驟，通過將固相載體的至少部分表面曝光，使通式(I)化合物的反應(yīng)性官能團B光去保護，隨后使由此而活化的固相載體與目標生物分子溶液接觸，從而使所述分子在所述固相載體上固定，所述固定通過由所述分子所帶有的至少一個化學官能團形成共價鍵而進行，且所述化學官能團與通式(I)的所述化合物的反應(yīng)性官能團B有反應(yīng)性，并任選地重復這兩個步驟。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述的光去保護步驟只局限在官能化的固相載體表面的一部分。
17.如權(quán)利要求15或16所述的方法，其特征在于所述的固定步驟通過在通式(I)化合物的羥基胺官能團B與目標生物分子的羰基化的官能團之間形成肟鍵而進行。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述的固定步驟在pH 4-7的條件下進行。
19.如權(quán)利要求16至18中任何一項所述的方法，其特征在于所述的曝光波長為300至400nm。
20.一種固相載體，其特征在于所述的固相載體是根據(jù)權(quán)利要求15至19中任何一項所定義的方法而獲得的，且所述的固相載體包括至少一面，其上固定著目標生物分子，所述的固定是通過與如權(quán)利要求1至6中任何一項所定義的通式(I)的偶聯(lián)劑的反應(yīng)性官能團B形成共價鍵而進行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有光不穩(wěn)定保護基團的化合物，及其作為偶聯(lián)劑在固相載體官能化中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及由所述化合物官能化的固相載體，并涉及所述固相載體在諸如核酸分子等目標生物分子的固定中的應(yīng)用。
文檔編號C07C271/08GK101023091SQ200580029633
公開日2007年8月22日 申請日期2005年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者安托萬·歐昂, 弗朗索瓦絲·維內(nèi), 埃里克·德弗朗斯科, 帕斯卡爾·迪米 申請人:原子能總署, 約瑟夫傅立葉大學