一種柱前衍生化法測定苦碟子注射液中6種氨基酸含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種柱前衍生化法測定苦碟子注射液中6種氨基酸含量的方法。屬于中藥成分分析領(lǐng)域。其步驟如下：（1）混合對照品溶液的配制：制成含脯氨酸217.0mg·L-1，丙氨酸37.40mg·L-1，纈氨酸44.40mg·L-1，異亮氨酸39.80mg·L-1，亮氨酸43.20mg·L-1，苯丙氨酸42.20mg·L-1的混合對照品溶液。（2）供試品溶液的配制。（3）色譜條件：DiamonsilC18(2)色譜柱(200×4.6mm,5μm)；柱溫：25℃；檢測波長：350nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：30mmol/LNaAc，含1％N,N-二甲基甲酰胺，pH6.40；流動(dòng)相C：乙腈；進(jìn)行梯度洗脫。具有操作簡便易行、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，為苦碟子注射液的質(zhì)量控制方法研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種柱前衍生化法測定苦碟子注射液中6種氨基酸含量的方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種柱前衍生化法測定苦碟子注射液中6種氨基酸含量的方法。屬于中藥成分分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在現(xiàn)有技術(shù)中，苦碟子別名滿天星，苦荬菜，主要分布于我國東北及內(nèi)蒙古等地，為菊科植物抱莖苦荬菜(Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance)的當(dāng)年生干燥全草,性寒，味苦、辛，具有清熱解毒、排膿止痛之功效?？嗟?碟脈靈)注射液是以苦碟子為原料提取精制而成的靜脈注射液，具有活血化瘀，改善微循環(huán)的作用[2]。該注射液已上市多年，療效確切?？嗟幼⑸湟?曾用名:碟脈靈注射液)列入國家藥品標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品(國藥準(zhǔn)字Z20025450)，由通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
[0003]處方:抱莖苦荬菜IOOOg,制成1000ml。
[0004]制法:取抱莖苦荬菜，加水煎煮二次，第一次I小時(shí)，第二次0.5小時(shí)，合并煎液，濃縮至每Iml相當(dāng)于原生藥0.5g,放冷至40°C以下，在攪拌下加10%氧化I丐乳調(diào)節(jié)pH值至10，放置12小時(shí)，離心，離心沉淀物稱重，懸浮于5.3倍量95%乙醇中(使含醇量達(dá)80%)，力口50%硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3 — 4，充分?jǐn)嚢枋狗磻?yīng)完全，離心，離心液加40%氫氧化鈉溶液中和PH值至7.0,濾過，濾液回收乙醇，并揮盡乙醇，用注射用水稀釋至每Iml相當(dāng)于原生藥4g，置-5°C以下放置12小時(shí)以上，濾過，濾液加0.1 — 0.2%藥用活性炭粉末，煮沸15分鐘，置_5°C以下放置24小時(shí)以上，濾過，濾液加注射用水稀釋至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至7.0 -
7.5，濾過，灌封，滅菌即得。性狀:本品為淺黃棕色至黃棕色的澄明液體。
[0005]含量測定:本品每IOml含總黃酮以無水蘆丁(C27H3tlO16)計(jì)，不得少于4.0mg0含抱莖苦荬菜以腺苷(CltlH12N5O4)計(jì)，不得少于0.025mg。
[0006]功能主治:活血止痛，清熱祛瘀。用于瘀血閉阻的胸痹，證見:胸悶、心痛，口苦，舌暗紅或存瘀斑等。適用于冠心病、心絞痛見上述病狀者。亦可用于腦梗塞者。
[0007]用法用量:靜脈滴注，一次10 - 40ml，一日I次；用5%葡萄糖或0.9%氯化鈉注射液稀釋至250 - 500ml后應(yīng)用；14天為一療程；或遵醫(yī)囑。
[0008]規(guī)格:每支裝(I)10ml, (2) 20ml, (3) 40ml。
[0009]藥理研究表明，苦碟子注射液具有擴(kuò)張冠狀血管，改善心肌血氧供應(yīng)，增加纖維蛋白溶血酶活性，抑制血檢形成的功能，臨床應(yīng)用中在腦梗塞，誕心病和心纟父痛的治療方面有重要的藥用價(jià)值。中藥注射劑是安全風(fēng)險(xiǎn)較高的品種，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求較高，苦碟子注射液目前在質(zhì)量控制方面的研究主要集中于黃酮類、糖類和有機(jī)酸類的含量測定，然而氨基酸類成分在苦碟子注射液中含量較大且有明確藥效。目前中藥中氨基酸含量測定方法主要為氨基酸自動(dòng)分析儀分析法、高效液相色譜法(衍生高效液相色譜法、未衍生高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等。其中氨基酸自動(dòng)分析儀分析法儀器價(jià)格昂貴，毛細(xì)管電泳法方法復(fù)雜，因此本文建立了同時(shí)測定6種氨基酸的柱前衍生化方法并對苦碟子注射液中的氨基酸進(jìn)行了含量測定，為全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是針對上述不足而提供一種采用柱前衍生化法測定苦碟子注射液中6種氨基酸含量的方法，方法簡便、準(zhǔn)確，可靠，同時(shí)為其質(zhì)量控制提供方法學(xué)參考依據(jù)。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種柱前衍生化法測定苦碟子注射液中6種氨基酸含量的方法，其步驟如下: (I)混合對照品溶液的配制:
精密稱取脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.34 mg，丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品3.74 mg，纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.44 mg，異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品3.98 mg，亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.32 mg，苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.22 mg，分別置10 mL量瓶中，先加少量80%乙醇溶解再定容至刻度，搖勻，即得對照品儲(chǔ)備液；分別精密吸取對照品儲(chǔ)備液適量，制成含脯氨酸217.0 mg.171，丙氨酸37.40 mg.l1，纈氨酸44.40 π^.?Λ異亮氨酸39.80 mg.L4,亮氨酸43.20 mg.L4,苯丙氨酸42.20 mg.L-1的混合對照品溶液。
[0012](2)供試品溶液的配制:
精密量取樣品1.00 mL置10 mL量瓶中，加5%碳酸氫鈉溶液1.00 mL與1% 2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1.00 mL，搖勻，60 °〇水浴中暗處加熱30 min后取出；用0.01 mo I/L KH2PO4溶液定容至10 mL,經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。
[0013](3)色譜條件:
Diamonsil C18 (2)色譜柱(200X4.6 mm, 5 μ m);柱溫:25 V ;檢測波長:350 nm ;流速:1.0 mL/min ;進(jìn)樣量:10 yL;流動(dòng)相 A:水;流動(dòng)相 B:30 mmol/L NaAc,含 I % N, N-二甲基甲酰胺，PH 6.40 ;流動(dòng)相C:乙腈；進(jìn)行梯度洗脫。
[0014](4)進(jìn)樣測定。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:建立測定苦碟子注射液中6種氨基酸類成分一一脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量的測定方法，具有操作簡便易行、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，衍生后剩余的DNFB及其衍生物對氨基酸的測定無干擾，該方法為苦碟子注射液的質(zhì)量控制方法研究奠定了基礎(chǔ)，提供了參考。
[0016]下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。上面或以下的描述，只是本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，各種舉例說明不對本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容構(gòu)成限制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明空白溶液(A)的HPLC圖。
[0018]圖2是本發(fā)明混合對照品溶液(B)的HPLC圖。
[0019]圖3是本發(fā)明供試品溶液(C)的HPLC圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]柱前衍生化法測定苦碟子注射液中6種氨基酸含量的方法:
1.儀器和材料
Waters-e2695高效液相色譜系統(tǒng)(含四元泵，在線真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，2998光電二極管陣列檢測器；Empower 2色譜工作站；美國Waters公司)；BT12?型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];THZ-82型水浴恒溫振蕩器(金壇市榮華儀器制造有限公司)；KH 2200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)
脯氨酸、纈氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):140624-200805);所有對照品純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計(jì)算均大于99% ;乙腈(色譜純，SIGMA公司)；甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)；水為超純水；2，4-二硝基氟苯(天津一方科技有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(天津一方科技有限公司)；其他試劑均為分析純。
[0021]苦碟子注射液(吉林通化華夏藥業(yè)有限公司，批號(hào):120625、110601、120312、120109、111105、120438、111011、120209、111218、120532)
2方法與結(jié)果
2.1混合對照品溶液的配制精密稱取脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.34 mg,丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品3.74mg,纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.44 mg,異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品3.98 mg,亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.32 mg,苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.22 mg，分別置10 mL量瓶中，先加少量80% (v/v)乙醇溶解再定容至刻度，搖勻，即得對照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取對照品儲(chǔ)備液適量，制成含脯氨酸217.0，丙氨酸37.40，纈氨酸44.40，異亮氨酸39.80，亮氨酸43.20，苯丙氨酸42.20 mg.L-1的混合對照品溶液。
[0022]2.2供試品溶液的配制精密量取樣品1.00 mL置10 mL量瓶中，加5%碳酸氫鈉溶液1.00 mL與1% 2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液1.00 mL，搖勻，60 1:水浴中暗處加熱30min后取出。用0.01 mo I/L KH2PO4溶液定容至10 mL,經(jīng)0.45 μπι微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。
[0023]2.3 色譜條件 Diamonsil C18(2)色譜柱(200X4.6 mm，5 μ m);柱溫:25 °C ；檢測波長:350 nm ;流速:1.0 mL/min ;進(jìn)樣量:10 μ L。流動(dòng)相A:/Κ ；流動(dòng)相B:30 mmol/L NaAc (含1% N，N-二甲基`甲酰胺)，pH 6.40 ;流動(dòng)相C:乙腈；按“表1”進(jìn)行梯度洗脫。
[0024]表1流動(dòng)相洗脫梯度
【權(quán)利要求】
1.一種柱前衍生化法測定苦碟子注射液中6種氨基酸含量的方法，其特征在于其步驟如下: (O混合對照品溶液的配制: 精密稱取脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.34 mg，丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品3.74 mg，纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.44 mg，異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品3.98 mg，亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.32 mg，苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.22 mg，分別置10 mL量瓶中，先加少量80%乙醇溶解再定容至刻度，搖勻，即得對照品儲(chǔ)備液；分別精密吸取對照品儲(chǔ)備液適量，制成含脯氨酸217.0 mg.!/1，丙氨酸37.40 mg.?Λ纈氨酸44.40 mg.!/1，異亮氨酸39.80 mg.L4,亮氨酸43.20 mg.L4,苯丙氨酸42.20 mg.L-1的混合對照品溶液； (2)供試品溶液的配制: 精密量取樣品1.00 mL置10 mL量瓶中，加5%碳酸氫鈉溶液1.00 mL與1% 2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1.00 mL，搖勻，60 °〇水浴中暗處加熱30 min后取出；用0.01 mo I/L KH2PO4溶液定容至10 mL,經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過，即得供試品溶液； (3)色譜條件: Diamonsil C18(2)色譜柱200X4.6 mm, 5 μπι;柱溫:25 °C;檢測波長:350 nm ;流速:1.0 mL/min ;進(jìn)樣量:10 μ L ;流動(dòng)相 A:水;流動(dòng)相 B:30 mmol/L NaAc,含 I % N, N-二甲基甲酰胺，PH 6.40 ;流動(dòng)相C:乙腈；進(jìn)行梯度洗脫； (4)進(jìn)樣測定。`
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103630633SQ201310707567
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】劉睿, 李遇伯, 張艷軍, 孫璐 申請人:通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司