一種三抗體雙通道同時(shí)檢測(cè)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種三抗體雙通道策略電化學(xué)免疫傳感器，采用金雜化硫化石墨烯Au-S-GS作為連接載體，利用人免疫球蛋白抗體為骨架支撐抗體，來連接人核基質(zhì)蛋白抗體和癌胚抗原抗體，通過標(biāo)記層抗體孵化物中甲苯胺藍(lán)和中性紅的不同氧化峰電位，實(shí)現(xiàn)對(duì)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原的同時(shí)檢測(cè)，屬于新型生物傳感技術(shù)的發(fā)展和新型傳感方法構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一大類惡性腫瘤的統(tǒng)稱。在正常人體內(nèi)，腫瘤標(biāo)志物的含量低于一定的濃度，腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)或宿主細(xì)胞對(duì)腫瘤反應(yīng)后產(chǎn)生的某些物質(zhì)，這些腫瘤標(biāo)志物的含量會(huì)急劇上升，可用于臨床某些腫瘤的診斷和輔助診斷。但是有時(shí)候僅僅一種腫瘤標(biāo)志物的檢出，并不能說明人體內(nèi)患病狀況，而多種標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)，則可以確定患者的患病狀況。因此，在臨床研究上，發(fā)展一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的同時(shí)檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物的方法是十分重要的。
[0003]電化學(xué)免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、易于小型化、可連續(xù)、快速自動(dòng)化檢測(cè)分析等優(yōu)點(diǎn)，由其是新型的電化學(xué)免疫傳感器新技術(shù)的發(fā)展，突破了傳統(tǒng)的傳感器構(gòu)建思路，取得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于將來的臨床應(yīng)用，具有很好的導(dǎo)向作用，因此本發(fā)明構(gòu)建了一種新型的電化學(xué)免疫傳感器，利用Au-S-GS交聯(lián)人免疫球蛋白抗體、人核基質(zhì)蛋白抗體和癌胚抗原抗體，同時(shí)利用NKF-5-3為孵化材料，中性紅和甲苯胺藍(lán)的不同氧化峰電位實(shí)現(xiàn)了對(duì)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原的同時(shí)檢測(cè)。
[0004]目前已有的腫瘤標(biāo)志物的臨床檢測(cè)方法很多，如光電化學(xué)分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶聯(lián)免疫分析等。免疫傳感器是將免疫學(xué)方法與分析化學(xué)方法相結(jié)合的一種生物傳感器，通過抗原與抗體之間的特性性結(jié)合，使得它具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，當(dāng)前對(duì)于腫瘤在標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)，需要進(jìn)行多個(gè)工作電極的同時(shí)實(shí)施，而本發(fā)明將檢測(cè)多種標(biāo)志物集中于一個(gè)工作電極上，減少了檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是基于G00PAN10CS-HC1為基底材料，構(gòu)建一種無酶快速超靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。
[0006]本發(fā)明的目的之二是首次構(gòu)建了三抗體雙通道電化學(xué)免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原的同時(shí)檢測(cè)。
[0007]本發(fā)明的目的之三是利用Au-S-GS為載體，實(shí)現(xiàn)了人免疫球蛋白抗體、人核基質(zhì)蛋白抗體和癌胚抗原抗體的同時(shí)固定，實(shí)現(xiàn)了三抗體雙通道傳感器的構(gòu)建。
[0008]本發(fā)明的目的之四是利用NKF-5-3為載體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗體和染料的同時(shí)孵化，利用中性紅和甲苯胺藍(lán)的不同氧化峰電位實(shí)現(xiàn)了對(duì)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原的同時(shí)檢測(cè)，為膀胱癌的早期檢測(cè)提供了有力保障。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1.一種三抗體雙通道同時(shí)檢測(cè)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原免疫傳感器的制備方法
(1)用Al2O3拋光粉打磨直徑為4mm的玻碳電極，超純水清洗干凈;將6 pL.l.0?2.0mg/mL氧化石墨烯@聚苯胺@殼聚糖鹽酸鹽G00PAN10CS-HC1分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
(2)滴加6nL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的金納米溶膠，室溫下晾干；
(3)依次滴加6汕、1ug/mL的人免疫球蛋白抗體Ab(I)標(biāo)準(zhǔn)溶液，3 yL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的牛血清白蛋白BSA溶液，超純水洗凈，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加6uL、I yg/mL的人免疫球蛋白抗原Ag(I)標(biāo)準(zhǔn)溶液，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6nL的三抗體孵化物Ab(C)OAb(N)OAb(I)OAu-S-GS溶液，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(6)滴加6UL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的牛血清白蛋白BSA溶液，超純水洗凈，4°C冰箱中晾干；
(7)依次滴加6yL、l yg/mL的癌胚抗原CEA標(biāo)準(zhǔn)溶液，6 yL、l yg/mL的人核基質(zhì)蛋白抗原NMP22標(biāo)準(zhǔn)溶液；
(8)依次滴加6仙、0.5mg/mL的癌胚抗原抗體孵化物NKF-5-3@Au@TB@Ab(C)，6 yL、
0.5 mg/mL的人核基質(zhì)蛋白抗體孵化物爾?-5-3_11_1?_13 0)。
[0010]2.氧化石墨烯O聚苯胺O殼聚糖鹽酸鹽G00PAN10CS-HC1，的制備
(1)氧化石墨烯@聚苯胺G00PANI的制備
在磁力攪拌下，將2.0?3.0 mg氧化石墨稀分散在1.0?2.3 mL超純水中，超聲30min，繼續(xù)加入200 mg苯胺，超聲3 h，繼續(xù)加入I mL、0.2?0.8 g/mL的硫酸錢水溶液，4°C下保存24 h，用甲醇和超純水在8000 r/min、10 min下交替離心洗滌三次，40°C真空干燥，制得G00PANI ；
(2)將Img G00PANI分散于I mL超純水中，再加入0.1?10 mg殼聚糖鹽酸鹽，超聲2h，制得 G00PAN10CS-HC1。
[0011]3.三抗體孵化物Ab(C)OAb(N)OAb(I)OAu-S-GS的制備
Ab (C) OAb (N) OAb (I) OAu-S-GS溶液，其特征在于，制備步驟如下:
將0.1?0.8 mg金雜化硫化石墨烯Au-S-GS分散于2 mL超純水中，得到Au-S-GS溶液，將20?30 yL、10 yg/mL人免疫球蛋白抗體Ab(I)標(biāo)準(zhǔn)溶液，50?100 yL、10 yg/mL癌胚抗原抗體Ab(C)標(biāo)準(zhǔn)溶液和50?100 pL.lO ug/mL人核基質(zhì)蛋白抗體Ab(N)加入到Au-S-GS溶液中，在4°C震蕩孵化器中孵化24 h，加入10 pL.l.0 mg/mL的BSA，在4°C震蕩孵化器中孵化24 h，制得三抗體孵化物Ab(C)@Ab(N)@Ab(I)@Au-S-GS溶液。
[0012]4.癌胚抗原抗體孵化物NKF-5-3@Au@TB@Ab(C)的制備
將0.5 mg氨基化NKF-5-3分散于2?15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的金納米溶膠中，震蕩2 h，在8000 r/min離心5 min分離得到NKF-5_3@Au，并重新分散到I mL的超純水中，依次加入10?300 yL、10 48/1^癌胚抗原抗體413(0和10?100 yL、0.5 mg/mL甲苯胺藍(lán)TB溶液，在4°C震蕩孵化器中孵化24 h，制得癌胚抗原抗體孵化物NKF-5-3@Au@TB@Ab(C)。
[0013]5.人核基質(zhì)蛋白抗體孵化物NKF-5-3@Au_R@Ab(N)的制備
將0.5 mg氨基化NKF-5-3分散于2?15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的金納米溶膠中，震蕩2 h，在8000 r/min離心5 min分離得到NKF-5_3@Au，并重新分散到I mL超純水中，依次加入10?300 HlAO yg/mL人核基質(zhì)蛋白抗體Ab(N)和10?100 yL、0.5 mg/mL中性紅NR溶液，在4°C震蕩孵化器中孵化24 h，制得人核基質(zhì)蛋白抗體孵化物NKF-5-3@Au@NR@Ab(N)。
[0014]6.人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原的同時(shí)檢測(cè)
(1)使用電化學(xué)工作站進(jìn)行測(cè)試，鉑電極作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的0.067 mol/L磷酸鹽緩沖溶液I3BS和0.1 mmol/L硝酸鉀溶液中進(jìn)行測(cè)試；
(2)用方波伏安法對(duì)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，其電壓測(cè)試范圍為-
0.8 V ?0.1 V；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，記錄人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原加入前后的傳感器的峰電流值，繪制工作曲線。
[0015]本發(fā)明的有益成果
(I)GOiPANIiCS-HCl的使用，增大了電極表面的比表面積，同時(shí)能夠很好的促進(jìn)電極表面的電子傳遞，并且Au的存在能夠很好的進(jìn)行抗體的連接，提高傳感器的穩(wěn)定性。
[0016](2) Au-S-GS的使用，能夠很好的連接人免疫球蛋白抗體、人核基質(zhì)蛋白抗體和癌胚抗原抗體，實(shí)現(xiàn)三抗體的同時(shí)固定。
[0017](3)基于Au-S-GS為交聯(lián)材料，構(gòu)建了一個(gè)三抗體雙通道的電化學(xué)免疫傳感器，該方法是首次構(gòu)建的新型傳感器構(gòu)建方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原的同時(shí)檢測(cè)。
[0018](4)該傳感器利用NKF-5-3為固定相，通過孵化兩種不同的染料中性紅和甲苯胺藍(lán)實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種腫瘤標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)。
[0019](5)本發(fā)明兩次利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)，提高了檢測(cè)方法的特異性。
[0020](6)本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器用于人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原的同時(shí)檢測(cè)，響應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)限低，線性范圍寬，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、高靈敏和特異性檢測(cè)，對(duì)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原的檢出限分別達(dá)到12 pg/mI^P3.6 pg/mL，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)膀胱癌的早期預(yù)塾目ο
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1一種三抗體雙通道同時(shí)檢測(cè)人核基質(zhì)蛋白和癌胚抗原免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
(1)用Al2O3拋光粉打磨直徑為4mm的玻碳電極，超純水清洗干凈;將6 pL.l.0 mg/mL氧化石墨烯@聚苯胺@殼聚糖鹽酸鹽G00PAN10CS-HC1分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
(2)滴加6nL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的金納米溶膠，室溫下晾干；
(3)依次滴加6汕、1ug/mL的人免疫球蛋白抗體Ab(I)標(biāo)準(zhǔn)溶液，3 yL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的牛血清白蛋白BSA溶液，超純水洗凈，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加