一種基于金納米團簇熒光探棒快速檢測葡萄糖濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于金納米團簇熒光探棒快速檢測葡萄糖濃度的方法，以牛血清蛋白功能化的金納米團簇為葡萄糖熒光檢測探針，利用共振光散射技術來檢測葡萄糖的濃度。本發(fā)明相對于色譜法及分光光度法使用的儀器成本較低；此熒光探測制備的原料均具有較高的穩(wěn)定性，相對于生物傳感器法檢測的穩(wěn)定性較差的缺點有很大的改進。本發(fā)明的熒光檢測探針靈敏度高、選擇性好、檢測限低；所用試劑均無毒副作用；本發(fā)明方法簡單、快速、易操作，不需要大型儀器。
【專利說明】—種基于金納米團簇熒光探棒快速檢測葡萄糖濃度的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料應用【技術領域】，具體涉及一種基于金納米團簇熒光探棒對血樣中葡萄糖濃度的靈敏檢測方法。
【背景技術】
[0002]葡萄糖是生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，是活細胞的能量來源和新陳代謝的中間產(chǎn)物，在食品分析和臨床診斷中有著非常重要的作用。目前，已有的檢測葡萄糖的方法很多，各有利弊。
[0003]在所有的葡萄糖的檢測方法中，應用最廣的是高效液相色譜法，該方法中的離子色譜法在近年發(fā)展非?？?。采用氣相色譜法分析葡萄糖需經(jīng)過硅醚化處理，操作比較復雜。采用分光光度法分析需加入顯色劑。此外，色譜法及分光光度法使用的儀器成本較高且需要專業(yè)的實驗員進行操作，不適宜發(fā)展中國家及偏遠地區(qū)的普遍使用。鑒于葡萄糖結(jié)構(gòu)的復雜性，旋光度法適宜作為一種輔助的檢測方法；生物傳感器法具有線性檢測范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點，且成本較低，有很好的應用前景，但由于其重現(xiàn)性較差且穩(wěn)定性不高，在葡萄糖的實際檢測中應用較少。
[0004]色譜法及分光光度法使用的儀器成本較高，且需專業(yè)人員操作；旋光度法只能作為一種輔助手段定性的檢測葡萄糖的簡單結(jié)構(gòu)；生物傳感器法檢測需建微流管道并且受環(huán)境(溫度、濕度、氣壓等)影響較大，穩(wěn)定性差。
[0005]因此亟需一種可以快速、有效檢測葡萄糖濃度的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種快速檢測血清中低濃度葡萄糖濃度的方法。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:一種基于金納米團簇熒光探棒快速檢測葡萄糖濃度的方法，包括以下步驟:
(1)合成牛血清蛋白功能化的金納米團簇:
將牛血清蛋配置成50mg/mL的溶液備用，將氯金酸配置成lOmmol/L的溶液避光保存?zhèn)溆?，取已配好的牛血清蛋白溶液IOmL與氯金酸溶液IOmL在避光的條件混合，在溫度為37°C的水浴中劇烈攪拌2?3min，隨后加入lmol/L的ImL氫氧化鈉溶液，避光恒溫反應12h，溶液顏色從淡黃色變?yōu)闇\棕色，最后變?yōu)樯钭厣玫脚Ｑ宓鞍坠δ芑慕鸺{米團簇水溶液，稀釋至50mL，將溶液在4°C的條件下保存?zhèn)溆茫?br> (2)檢測牛血清蛋白功能化的金納米團簇的LS強度:
將所述牛血清蛋白功能化的金納米團簇按質(zhì)量比1:5的比例配成水溶液，取3mL加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型熒光分光光度計上以Xem =400nm進行同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器獲得溶液的LS強度，測定時保持電壓為400V，狹縫寬度為IOnm ；
(3)共振光散射法檢測葡萄糖濃度: 將60 μ L的待測溶液和0.6mg/mL 140 μ L葡萄糖氧化酶在37 °C下混合培養(yǎng)10分鐘，力口入到2.8mL的金納米團簇溶液，混合均勻加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型熒光分光光度計上以Xem =400nm進行同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器獲得溶液的LS強度，測定時保持電壓為400V，狹縫寬度為IOnm ;根據(jù)線性回歸方程為可以獲得待測溶液的葡萄糖濃度。
[0008]所述待測溶液為非血清溶液時，線性回歸方程為F = 44.5c +82.467，待測溶液為血清溶液時，線性回歸方程為F = 52.027c +97.23，其中F表示待測溶液加入金納米團簇溶液后在400nm處的光散射增加強度，c表示待測溶液中葡萄糖的濃度。
[0009]本方法不僅可以通過利用共振光散射技術來檢測葡萄糖的濃度，且可以通過肉眼大概比較出葡萄糖的濃度高低，相對于色譜法及分光光度法使用的儀器成本較低；此共振光探測制備的原料均具有較高的穩(wěn)定性，相對于生物傳感器法檢測的穩(wěn)定性較差的缺點有很大的改進。
[0010]本發(fā)明優(yōu)點:(1)由于此熒光探針制備的原料均具有較高的穩(wěn)定性，因此本檢測方法所使用的金納米團簇易于制備和保存，在4°c且避光條件下可保存數(shù)月。(2)本發(fā)明檢測方法提供的熒光檢測探針靈敏度高、選擇性好、檢測限低。(3)本發(fā)明和檢測過程中所用試劑均無毒副作用。(4)本發(fā)明方法簡單、快速、易操作。將已知濃度的葡萄糖溶液和過量的葡萄糖氧化酶加入到熒光探針，通過檢測其共振光散射強度的變化，得出光散射強度與葡萄糖濃度的標準工作曲線。然后在同樣的條件下，就可以通過測定未知濃度的葡萄糖和過量的葡萄糖氧化酶加入到該熒光探針后的光散射強度，就可以從標準工作曲線上查出葡萄糖的濃度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1牛血清蛋白(BSA)為模板功能化的熒光金納米團簇的激發(fā)和發(fā)射波長。
[0012]圖2金納米團簇的高分辨率透射電鏡圖。
[0013]圖3不同濃度的葡萄糖對BSA-Au NCs光散射強度的影響。
[0014]圖4葡萄糖的濃度和光散射強度的線性關系。
[0015]圖5血清中葡萄糖的濃度和BSA-Au NCs光散射的強度的線性關系。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0017]葡萄糖熒光檢測探針為牛血清蛋白(BSA)為模板功能化的熒光金納米團簇。
[0018](I)牛血清蛋白功能化的金納米團簇(BSA-Au NCs)突光探針的合成:
將牛血清蛋(BSA)配置成50mg/mL的溶液備用，將氯金酸(HAuCl4)配置成lOmmol/L的溶液避光保存?zhèn)溆?。取已配好的牛血清蛋白溶液IOmL與氯金酸溶液IOmL在避光的條件混合，在溫度為37°C的水浴中劇烈攪拌2?3min。隨后加入ImL氫氧化鈉溶液(lmol/L)，避光恒溫反應12小時。溶液顏色從淡黃色變?yōu)闇\棕色，最后變?yōu)樯钭厣?圖1)，得到牛血清蛋白功能化的金納米團簇水溶液，稀釋至50mL,其濃度為2.0mmol/L (以金原子的數(shù)量計算)，將溶液在4°C的條件下保存?zhèn)溆?。在紫外?波長為365nm)照射下，牛血清蛋白功能化的熒光金納米團簇的水溶液發(fā)紅光。在波長為430nm處激發(fā)，在620nm處得到最大發(fā)射峰，圖2為牛血清蛋白功能化的金納米團簇的高分辨率透射電鏡圖，從圖中可以看出其粒徑大小在Inm左右。
[0019](2)檢測牛血清蛋白功能化的金納米團簇的LS強度:
由于光散射與介質(zhì)的不均勻性密切相關，除了真空之外的其它所有介質(zhì)都有一定程度的不均勻性，所以，在自然界中光散射現(xiàn)象普遍地存在。因此，可以利用共振光散射技術對不同濃度的葡萄糖和牛血清蛋白功能化的金納米團簇混合后的共振光散射強度變化進行測試。且經(jīng)實驗表明，利用共振光散射技術對葡萄糖濃度的檢測的靈敏度更高。
[0020]共振光散射法檢測血清中的葡萄糖是利用葡萄糖在葡糖糖氧化酶參與下催化生成的雙氧水對金簇探針的氧化，導致其光散射強度變化的原理設計的。在進行分析時一般采用標準工作曲線法。首先將上述牛血清蛋白功能化的金納米團簇按質(zhì)量比1:5的比例配成水溶液，取3mL加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型熒光分光光度計上以(Aem= Aex)進行同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器，測定時保持電壓為400V，狹縫寬度為10nm，最大散射波長在400nm處獲得LS強度，記錄為曲線a (圖3)。
[0021](3)共振光散射法檢測非血清溶液中的葡萄糖濃度:
隨后取出比色管洗凈，將60 μ L的不同濃度的葡萄糖溶液和140 μ L葡萄糖氧化酶(0.6mg/mL)在37°C下混合培養(yǎng)10分鐘,加入到2.8mL的金納米團簇溶液溶液,混合均勻加入比色管中，在LS-50B型熒光分光光度計上以相同方法獲得LS光譜(曲線b-j)。如圖3所示，在一定范圍內(nèi)，而當加入的葡萄糖的濃度逐漸增大時，光散射強度出現(xiàn)明顯增強。圖4所示葡萄糖的濃度在0.5 μ M至7 μ M的范圍時葡萄糖的濃度和光散射強度有一個良好關系，由此可得到葡萄糖的濃度和光散射強度之間的線性回歸方程，該方程為:F = 44.5c+82.467，其中F表示加入葡萄糖后BSA-Au NCs在400nm處的光散射增加強度，c表示葡萄糖的濃度。最低檢測限可以達到0.1 μ M。
[0022]將60 μ L的待測溶液和0.6mg/mL 140 μ L葡萄糖氧化酶在37 °C下混合培養(yǎng)10分鐘，加入到2.8mL的金納米團簇溶液，混合均勻加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型熒光分光光度計上以Xem =400nm進行同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器獲得溶液的LS強度，測定時保持電壓為400V，狹縫寬度為IOnm ;根據(jù)線性回歸方程為可以獲得待測溶液的葡萄糖濃度。
[0023](4)共振光散射法檢測血清中的葡萄糖濃度:
根據(jù)同樣的步驟，通過加標法，利用金納米團簇合成的葡萄糖熒光檢測探針對血清中的葡萄糖的濃度與光散射的強度之間的關系進行了實驗，測試結(jié)果如圖5所示，其線性回歸方程為:F = 52.027c +97.23，線性擬合R值達到0.9966。
[0024]將60 μ L的血清溶液和0.6mg/mL 140 μ L葡萄糖氧化酶在37 °C下混合培養(yǎng)10分鐘，加入到2.8mL的金納米團簇溶液，混合均勻加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型熒光分光光度計上以Xem =400nm進行同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器獲得溶液的LS強度，測定時保持電壓為400V，狹縫寬度為IOnm ;根據(jù)線性回歸方程為可以獲得血清溶液的葡萄糖濃度。
[0025]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但實施例和附圖并不是用來限定本發(fā)明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，自當可作各種變化或潤飾，但同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此本發(fā)明的保護范圍應當以本申請的權(quán)利要求保護范圍所界定的為準。
【權(quán)利要求】
1.一種基于金納米團簇熒光探棒快速檢測葡萄糖濃度的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)合成牛血清蛋白功能化的金納米團簇: 將牛血清蛋配置成50mg/mL的溶液備用，將氯金酸配置成lOmmol/L的溶液避光保存?zhèn)溆茫∫雅浜玫呐Ｑ宓鞍兹芤篒OmL與氯金酸溶液IOmL在避光的條件混合，在溫度為370C的水浴中劇烈攪拌2?3min，隨后加入lmol/L的ImL氫氧化鈉溶液，避光恒溫反應12h，溶液顏色從淡黃色變?yōu)闇\棕色，最后變?yōu)樯钭厣?，得到牛血清蛋白功能化的金納米團簇水溶液，稀釋至50mL，將溶液在4°C的條件下保存?zhèn)溆茫? (2)檢測牛血清蛋白功能化的金納米團簇的LS強度: 將所述牛血清蛋白功能化的金納米團簇按質(zhì)量比1:5的比例配成水溶液，取3mL加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型熒光分光光度計上以Xem =400nm進行同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器獲得溶液的LS強度，測定時保持電壓為400V，狹縫寬度為IOnm ； (3)共振光散射法檢測葡萄糖濃度: 將60 μ L的待測溶液和0.6mg/mL 140 μ L葡萄糖氧化酶在37°C下混合培養(yǎng)10分鐘，力口入到2.8mL的金納米團簇溶液，混合均勻加入到5mL的比色管中，然后在LS-50B型熒光分光光度計上以Xem =400nm進行同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器獲得溶液的LS強度，測定時保持電壓為400V，狹縫寬度為IOnm ;根據(jù)線性回歸方程為可以獲得待測溶液的葡萄糖濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金納米團簇熒光探棒快速檢測葡萄糖的方法，其特征在于:所述待測溶液為非血清溶液時，線性回歸方程為F = 44.5c +82.467，待測溶液為血清溶液時，線性回歸方程為F = 52.027c +97.23，其中F表示待測溶液加入金納米團簇溶液后在400nm處的光散射增加強度，c表示待測溶液中葡萄糖的濃度。
【文檔編號】G01N21/64GK103837516SQ201410104398
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】陳萌, 馬鴻飛, 李玉峰, 馮大千, 王偉 申請人:南京工業(yè)大學